小麥4 個WAKs/WAKLs 基因的分子特征及其響應條銹菌侵染的表達*

孔一淅，喬 梁，王蕙羽棠，劉星辰，楊寶菊

(云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

類受體激酶(receptor-like kinase，RLK)是植物受體最主要的組成成分，在細胞間的跨膜轉導信號中起重要作用，控制植物的繁殖、生長、發育及對各種環境的適應[1]。RLK 家族一般包含胞外結構域(extracellular domain，ED)、跨膜區(transmembrane region，TM)和胞內激酶結構域(Ser/Thr kinase domain，STK)[2]。在植物病原菌互作的信號轉導通路中，RLK 作為模式識別受體 (pattern-recognition receptors，PRRs)可以識別病原菌分子模式 (pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而在細胞膜上響應植物的天然免疫系統(pattern-triggered immunity，PTI)，激活植物的抗病能力[3-5]。當外界信號PAMPs 分子被受體類激酶的ED 識別后，通過STK 將信號傳導給下游的信號通路，引發一系列免疫反應，包括ROS爆發、MAPK 激活、胼胝質沉淀、鈣離子流入、水楊酸積累等[3-5]。如油菜素內酯信號轉導通路中，共受體BAK1 和受體FLS2 共同識別病原菌的鞭毛蛋白，BRI1 受體類激酶和BAK1 相互作用并經交互磷酸化形成1 個活躍的受體復合物，從而激活油菜素內酯抵御病原菌。越來越多的RLKs 已被證明是PRRs[3-5]。

細胞壁受體激酶(wall-associated kinases，WAK)及其類基因WAKLs(WAK like genes，WAKLs)屬于RLK 家族的亞家族[6]，合稱為WAK/WAKL 家族。WAKs和WAKLs的結構非常相似，主要是胞外表皮生長因子結構域(epidermal growth factor domain，EGF)、跨膜結構域和胞內STK，但部分WAKLs缺少一些結構域，如WAKL7缺少跨膜域和激酶結構域[7]。在植物防御反應中，擁有胞外結構域的WAKs/WAKLs基因可以作為細胞外界信號接收員，而胞內激酶部位參與胞質信號級聯反應[7]，并且在生長發育和對非生物壓力的耐受性中起作用。WAKs/WAKLs基因在植物防御病原體方面發揮著關鍵作用，如：AtWAK1編碼WAKs 蛋白，與病原菌互作，在擬南芥的防御反應中起重要作用[8]；從玉米(Zea maysL.)中克隆的主效數量性狀基因ZmWAK可抗玉米絲黑穗病[9]；在棉花(Gossypium hirsutumL.)中鑒定到的GhWAK7A參與調節對鐮刀菌和黃萎病的反應[10]；在山新楊(Populus davidiana×P.bolleana)中過表達克隆到PdPapWAK基因后，其抵抗非生物和生物脅迫的能力進一步增強[11]。

植物WAK/WAKL家族是響應病原菌信號的重要成員。長久以來，基因對基因假說提供了植物抗病模式PTI 與ETI 系統、植物PRRs 與抗病基因(resistance gene，R)的明確界限，但這一界限面臨著大量研究的挑戰。WAK/WAKL家族作為信號轉導途徑中的重要受體，可以激活植物的PTI 免疫反應模式，檢測到病原菌的效應蛋白，可能原因之一是其在植物R基因與病原菌無毒基因互作過程中發揮“監測”作用[12-13]。在小麥對禾谷絲核菌的防御反應中，鑒定到WAK7的轉錄豐度升高[14]，積極響應了小麥禾谷絲核菌的防御反應。小麥基因組中定位到1 個WAKL4/stb6基因，該基因識別病原菌效應物Avr Stb6，且繞過過敏性反應賦予小麥對枯葉病的抗性，符合基因對基因假說[15]。當過表達OsWAK91時，水稻激活ETI系統，產生H2O2反應并增強相關R基因的表達[16]。SlWAK1通過番茄中的FLS2/FLS3 復合物參與調節PRRs 介導的免疫應答[17]?？傊?，WAK/WAKL家族在PTI 和ETI 系統中的調控機制很復雜，具體情況尚不清楚。

本研究從課題組前期測定的小麥響應條銹病侵染的轉錄組數據中篩選出4 個在抗感材料中差異表達的WAKs/WAKLs基因，對其進行基因結構、蛋白基本理化性質、保守結構域、系統進化等生物信息學分析，結合實時熒光定量 PCR (RTqPCR)在抗病和感病材料中分析其響應條銹菌的表達模式，為進一步研究小麥WAKs/WAKLs基因響應條銹菌的侵染作用機制及功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為抗條銹病品種云337 和感條銹病品種云402；小麥條銹菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)為CYR32。將小麥播種在人工培養室中，溫度控制在晝16～18 ℃、夜12～15 ℃，每天光照16 h；當小麥生長到二葉期時，將CYR-32 與滑石粉按體積比1∶20 混合后進行撒粉接種；分別采集條銹菌侵染后0、24、48、72、120和168 h 的葉片樣本，于-80 ℃保存備用。

1.2 轉錄組測序及差異基因表達分析

轉錄組測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。文庫質檢合格的測序數據采用DESeq2 進行差異基因分析，以差異倍數(fold change，FC)≥1.5 且錯誤發現率(false discovery rate，FDR)＜0.01作為差異基因篩選標準，從中挖掘在抗感材料中差異表達的小麥WAKs/WAKLs基因，并對其進行COG 分類、GO 功能富集、KEGG 注釋和KEGG 通路富集分析。

1.3 小麥WAK/WAKL 家族基因鑒定

下載擬南芥、水稻、大麥和小麥基因組數據庫文件，采用TBtools v1.108 從中比對出差異表達的小麥WAKs/WAKLs基因的同源基因組和氨基酸序列，并篩選同源性較高的基因；利用NCBI 的Batch CD-Search 在線軟件(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對篩選得到的候選基因編碼蛋白進行蛋白結構域分析。

1.4 小麥WAK/WAKL 家族成員生物信息學分析

利用GSDS 在線軟件(http//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析和繪制小麥WAKs/WAKLs基因結構；利用ExPASyProtParam Tool (http//web.expasy.org/protparam)預測蛋白質的等電點和分子質量；利用ExPASy (http//web.expasy.org/protscale)預測蛋白質的親水性和疏水性；利用MEME 在線軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)預測蛋白基序。為了研究小麥WAKs/WAKLs 蛋白與其他物種間的系統進化關系，對小麥、大麥、擬南芥和水稻4 個物種中同源性較高的WAKs/WAKLs 蛋白全長序列進行比對，采用DNAMAN V6 比對蛋白質多序列，采用MEGA 7.0 的鄰接法構建系統進化樹，采用 TBtools 繪制系統進化樹與基序預測圖。

1.5 小麥WAKs/WAKLs 基因的表達模式分析

根據從轉錄組篩選出的小麥WAKs/WAKLs基因序列，使用Beacon Designer 8 設計RT-qPCR 引物序列(表1)，引物由北京擎科生物股份有限公司合成。采用RNA Easy Fast 植物組織 RNA 快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取小麥葉片的總RNA，再采用Aid lab 公司反轉錄試劑盒(TURE script 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)進行反轉錄。以小麥GAPDH基因為內參，使用2×SYBR?Green 預混液(中國DF)試劑盒在Analytikjena-qTOWER2.2 型熒光定量PCR 儀(德國)上進行RT-qPCR 反應。反應體系總體積10.0 μL，包括cDNA 模板1.0 μL，SYBR Green 1 Master 5.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，39 個循環，溶解曲線(60～95 ℃，每個循環增加1 ℃，每次循環時間為4 s)設置2 個生物學重復，并使用2-ΔΔCt[18]計算各個樣品及各組中的基因相對表達量。采用Excel 2010 處理數據；采用GraphPad Prism 8.4.2 作圖。

表1 供試引物Tab.1 Primers for test

2 結果與分析

2.1 4 個WAKs/WAKLs 基因的結構

經轉錄組篩選出4 個小麥WAKs/WAKLs基因，分別為TraesCS1B02G004100、TraesCS6B02-G459100、TraesCSU02G079300和TraesCS3A02G-122300基因(圖1)。其中，基因組序列最長的是TraesCS6B02G459100，長度為5 117 kb，包含4個外顯子和3 個內含子；序列最短的是TraesCS3-A02G122300，長度為2 934 kb，包含3 個外顯子和2 個內含子；TraesCSU02G079300和TraesCS1B-02G004100 的長度相近，分別為3 208 和3 194 bp，均包含3 個外顯子和2 個內含子。

圖1 4 個小麥WAKs/WAKLs 基因的結構Fig.1 Gene structure of four wheat WAKs/WAKLs genes

2.2 WAKs/WAKLs 蛋白的理化性質和亞細胞定位

由表2 可知：TraesCS1B02G004100、Traes-CS6B02G459100、TraesCSU02G079300和Traes-CS3A02G122300編碼的氨基酸序列長度分別為714、960、737 和652 aa；蛋白分子質量分別為78.68、106.29、81.86 和69.67 ku；理論等電點分別為8.50、5.98、5.65 和6.25；脂肪族氨基酸指數分別為89.59、85.33、81.38 和90.49；4 個基因的蛋白親疏水性值均為負值，為親水性蛋白。亞細胞定位預測顯示：4 個基因均定位于細胞膜上，為膜蛋白。

表2 4 個WAKs/WAKLs 基因理化性質Tab.2 Physicochemical properties of four WAKs/WAKLs genes

2.3 WAKs/WAKLs 的系統進化以及基序和功能結構域

小麥、大麥、擬南芥和水稻中同源性較高的43 個WAKs/WAKLs 蛋白質序列按照親緣關系被分為4 個分支，TraesCS6B02G459100和來自水稻、大麥、擬南芥的成員聚為一類，處于分支Ⅰ，且與水稻Os05g04460親緣關系最近；TraesCSU-02G079300和TraesCS3A02G122300處于分支Ⅱ，分別與水稻Os02g02120、擬南芥AtWAKL15親緣關系最近；TraesCS1B02G004100處于分支Ⅲ，與大麥HORVU.MOREX.r3.5HG0503880親緣關系最近；分支Ⅳ僅包括小麥成員(圖2a)。

圖2 小麥與擬南芥、水稻、大麥 WAK/WAKLs 基因中保守蛋白質的系統進化關系(a)、蛋白結構域(b)和基序結構(c)Fig.2 Phylogenetic relationship (a),protein domain(b) and motifs structure (c) based on the amino acid sequences of WAKs/WAKLs from Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana,Oryza sativa,and Hordeum vulgare

蛋白結構域預測結果顯示：小麥、大麥、擬南芥和水稻WAKs/WAKLs 蛋白序列均包括激酶部位(圖2b)。在進化分支Ⅰ中，小麥WAKs/WAKLs 蛋白都包括2 個GUB_WAK_bind 結構域，1個EGF 和1 個STK，除水稻Os01g26300和擬南芥AtWAKL16編碼的蛋白質不具有胞外結構域外，其他成員均具有胞外結構域。在進化分支Ⅱ中，大部分水稻成員不具備胞外結構域，而其他成員均具備；部分小麥成員還具有跨膜TM_FGFR-like 結構域。在進化分支Ⅲ中，除小麥TraesCS1B02G004100 和大麥HORVU.MOREX.r2.1-HG0004690、HORVU.MOREX.r3.5HG0503880編碼的蛋白質具有完整的胞內和胞外結構域外，其他成員均不具備。在進化分支Ⅳ中，只有Traes-CS3A02G049500編碼的蛋白質具有胞外和胞內結構域。說明胞內STK 為所有成員共有，預測WAKs/WAKLs家族基因發揮功能與激酶部位有較大關聯。

基序預測結果顯示：小麥、大麥、擬南芥和水稻的WAKs/WAKLs 蛋白序列共包括12 種基序(圖2c)。進化分支Ⅰ包括11 種基序，TraesCS-6B02G459100與大麥HORVU.MOREX.r3.3HG04-99530編碼的蛋白質基序相似；進化分支Ⅱ包括10 種基序，TraesCSU02G079300與水稻Os02g0-2120、大麥HORVU.MOREX.r3.7HG0649430編碼的蛋白基序高度相似，TraesCS3A02G122300與擬南芥AtWAKL15編碼的蛋白基序高度相似；進化分支Ⅲ包括10 種基序，TraesCS1B02G004100與大麥HORVU.MOREX.r3.5HG0503880編碼的蛋白基序高度相似；進化分支Ⅳ包括9 種基序，均是來自小麥WAKs/WAKLs 家族的成員，且編碼的蛋白基序基本相似。此外，基序1、2、3、4、5、7、8、11 為所有成員共有，均包括STK，預測胞內激酶部位保守性較高，是決定蛋白質功能的關鍵基序；基序9、10、12 包括胞外EGF 和半乳糖醛酸結合結構域(galacturonic acid binding domain，GUB)，說明胞外結構域多樣，但具有一定的保守性。

2.4 WAKs/WAKLs 蛋白激酶部位的同源性比對

為了進一步研究激酶部位的保守性，預測其發揮功能的部位，對涉及的成員進行激酶部位蛋白序列同源性比對分析。該部位通常有2 個與激酶發揮功能有關的重要區域，包括蛋白激酶ATP結合位點、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點和酪氨酸蛋白激酶活性位點(圖3)，分析結果顯示：胞內結構域同源性達73.34%，蛋白激酶ATP 結合位點、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點和酪氨酸蛋白激酶活性位點保守性強，均符合這2 個結合位點序列構成特征。根據蛋白激酶ATP 結合位點中不變的天冬氨酸(D)附近是否存在保守精氨酸(R)，將激酶分為RD 型激酶和非RD 型激酶，由圖4 可知：TraesCS6B02G459100和TraesCS3A-02G122300為RD 型激酶，TraesCS1B02G004100和TraesCSU02G079300為非RD 型激酶。

圖3 WAKs/WAKLs 蛋白激酶催化域中的保守結構域基序Fig.3 Conserved domain motifs in the catalytic domain of WAKs/WAKLs protein kinases

圖4 小麥與擬南芥、水稻、大麥 WAK/WAKLs 基因氨基酸多序列同源比對Fig.4 Homology alignment of amino acid sequences of WAKs/WAKLs genes in T.aestivum and A.thaliana,O.sativa,and H.vulgare

2.5 小麥 WAKs/WAKLs 基因響應條銹病的表達

由圖5 可知：4 個基因在小麥接種條銹菌親和互作和非親和互作過程中差異表達。侵染0 h，TraesCS1B02G004100和TraesCS6B02G459100在小麥與條銹菌非親和互作中被短暫誘導表達后下調，隨后在侵染早期(24～48 h)上調表達，而TraesCS3A02G122300則表達相反；TraesCSU02G-079300在早期表達量無顯著差異。接種48 h 后，TraesCS1B02G004100和TraesCSU02G079300表達受到抑制而下調直至接種168 h；TraesCS6B02-G459100表達則呈上調直至接種120 h。綜上所述，親和互作過程中，TraesCS1B02G004100和TraesCS6B02G459100幾乎不表達，TraesCS3A0-2G122300早期表達趨勢和非親和互作一致，TraesCSU02G079300在早期表達量低于非親和互作。

圖5 4 個WAKs/WAKLs 基因在抗病品種云337 (Y337)和感病品種云402 (Y402)接種CYR32 后的轉錄組表達量Fig.5 Transcriptome expression level of four WAKs/WAKLs genes in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32

由圖6 可知：非親和互作過中，在條銹菌侵染小麥的24～48 h，TraesCS1B02G004100上調表達，TraesCS6B02G459100顯著上調表達，Traes-CS3A02G122300和TraesCSU02G079300表達受到抑制而下調；在接種條銹菌48 h 后，TraesCS1-B02G004100和TraesCS6B02G459100先下調后上調表達；TraesCS6B02G459100、TraesCS3A02G-122300和TraesCSU02G079300的表達量分別在接種條銹菌120、24 和168 h 后達到峰值。親和互作過程中，TraesCS1B02G004100幾乎不表達；轉錄組中幾乎未表達的TraesCS6B02G459100，在接種0～24 h 被抑制表達，24 h 后上調表達，168 h 表達量達到峰值，但由于該基因轉錄豐度較低，可能導致RT-qPCR 檢測結果不能有效地反映其實際表達情況；TraesCS3A02G122300和TraesCSU02G079300在接種早期下調表達，接種120 h 后表達上調。綜上所述，4 個基因在小麥和條銹菌互作過程中利用轉錄組和RT-qPCR 分析的表達模式基本一致。

圖6 RT-qPCR 驗證4 個WAK/WAKLs 基因在抗病品種云337 (Y337)和感病品種云402 (Y402)接種CYR32 后的表達模式Fig.6 Expression patterns of four WAKs/WAKLs in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32 by RT-qPCR

3 討論

WAKs/WAKLs基因在植物中屬于大家族，目前從擬南芥中鑒定了26 個WAKs/WAKLs基因，水稻中125 個，大麥中91 個，小麥中320 個[19-21]，作為病原菌的模式識別受體，它在植物信號轉導過程中發揮著重要作用。本課題組從轉錄組中篩選的4 個WAKs/WAKLs基因，其結構域存在一定差異，暗示這4 個基因功能上存在差異；通過RTqPCR 驗證，闡明TraesCS1B02G004100基因參與調控小麥對條銹病的抗性，研究結果為揭示WAKs/WAKLs基因調控抗病性的功能和機制提供了參考。

本研究的4 個WAKs/WAKLs基因具有典型的胞外富含半胱氨酸的GUB_WAK_bind 和胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。從進化分支上看，小麥TraesCS6B02G459100與水稻OsWAK91的親緣關系最近，OsWAK91正向調控水稻抵御稻瘟病菌侵染[16]。已有研究報道：2 個胞外結構域變異的OsWAK10基因以不同的親和力結合果膠寡糖，以控制水稻次生壁的合成[22]，由此可以說明：GUB 作為首先感知到外界信號的受體，可以與果膠結合激活WAKs/WAKLs基因，以調節植物細胞形態。TraesCS6B02G459100與上述2 個水稻WAKs基因同為RD 激酶，由此可以推測，該基因可能編碼與調節植物生長發育、抗病相關的激酶，相較于其他3 個基因，其具有的2 個GUB結構域在信號轉導過程中的作用機制值得探索。TraesCS3A02G122300與未知功能的激酶聚為同一分支，在抗感材料中都被抑制表達，但在后期感病材料的表達量高于抗病材料，盡管屬于RD激酶，但已有報道中也出現能夠調控植物抗病反應的RD 激酶，如OsWAK91、OsWAK92、OsWAK94和OsWAK14基因是水稻對稻瘟病菌數量抗性的調節因子[16]，因此TraesCS3A02G122300的具體功能機制值得進一步研究。

WAK/WAKL 家族胞內的ATP 結合位點及絲氨酸/蘇氨酸結合位點是調節植物先天免疫的重要結構[23]，尤其是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點中保守的天冬氨酸附近是否存在精氨酸很大程度上決定了激酶的功能。已知在先天免疫中作為PRRs 的15 個激酶中有12 個是非RD 型[24]，表明所有非RD 激酶可能都參與先天免疫。TraesCS1B-02G004100和TraesCSU02G079300為非RD 型激酶。其中，TraesCS1B02G004100在親和互作體系中幾乎不表達；而在非親和體系中，該基因早期被誘導，24 h 以后被抑制，這與已報道的OsWAK112d基因表達模式一致，且過表達OsWAK-112d基因及其突變體分別增加了水稻的易感性和抗性，表明其在植物感染期間是抑制基礎抗性的負調控因子[16]，故推測TraesCS1B02G004100可能是小麥響應條銹菌侵染的負調控基因，并且早期可能被PAMPs 誘導。TraesCSU02G079300與OsWAK11處于同一進化分支，OsWAK11通過GUB 結合果膠并監測果膠甲基化的變化以解毒過量的銅，并且可以調節細胞的伸長率以適應外界環境的變化[25]，其轉錄豐度的趨勢與TraesCS1B0-2G004100相似，并且在2 種互作體系中差異表達，該基因可能也在防御反應中發揮作用。

本研究篩選的小麥WAK1基因TraesCS1B0-2G004100和已經在小麥中鑒定到的Snn1基因同源性最高，達99.86%。在腐生病原菌(Parastagonospora nodorum)和小麥互作過程中，SnTox1 作為病原菌分泌的效應蛋白與Snn1基因相互作用，引起小麥細胞程序性死亡并賦予其對葉斑病的易感性，Snn1-SnTox1是小麥和葉斑病互作的多個重要模式之一[26-27]。本研究發現：在小麥與條銹菌非親和互作過程中，TraesCS1B02G004100基因響應條銹菌侵染且表達受到抑制，而在親和互作過程中不受條銹菌誘導表達，說明該基因極大可能參與調控小麥對條銹病的抗性。

4 結論

4 個小麥WAKs/WAKLs基因中，TraesCS3A0-2G122300和TraesCSU02G079300在小麥與條銹菌親和及非親和互作體系中差異表達；TraesCS6-B02G459100和TraesCS1B02G004100在小麥非親和互作中特異表達。非RD 型激酶TraesCS1B02-G004100在表達過程中受到抑制，作為病原菌效應蛋白的受體，其在參與調控小麥對條銹病的抗性功能值得進一步研究；其他3 個WAKs/WAKLs基因在植物生長發育過程中的作用也值得探索。