不同交配型擬輪枝鐮孢菌熒光蛋白標記菌株的構建*

張峰程，張 君，李 凡，郭 維

(1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.中國農業科學院 農產品加工研究所，北京 100193；3.中國農業科學院 植物保護研究所，北京 100193)

玉米不僅是中國的主要糧食作物之一，也是重要的飼料原料和工業原料，在國民經濟中發揮著重要作用。隨著全球氣候變暖、秸稈還田、栽培模式的改變和品種的更換，玉米病蟲害在中國呈持續高發趨勢，已成為制約中國玉米高產穩產的重要限制性因素之一[1]。玉米莖、穗腐病是一種在全球范圍內普遍發生的病害，擬輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)是引起該病害的主要病原菌之一，該菌可以在玉米整個生育期進行侵染。擬輪枝鐮孢菌可以通過帶菌種子或土壤中的病菌進入初生根，從地下部開始侵染，并向上進入植株莖基部[2-3]；其分生孢子也可以通過氣流到達花絲進而侵染玉米穗部，或落到葉鞘縫隙處侵染玉米莖節或葉鞘組織[4]。擬輪枝鐮孢菌在造成玉米減產的同時還產生多種真菌毒素，在玉米生產、收獲、儲藏、加工和運輸過程中持續為害，嚴重威脅糧飼安全。因此，了解擬輪枝鐮孢菌侵染玉米的過程對玉米莖、穗腐病的防控具有重要意義。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是最常見的標記蛋白，RFP 變種mCherry 是一種作為示蹤劑的紅色熒光染料，它們均具有穩定、使用方便、無物種專一性、易于在活細胞中觀察等優點。熒光蛋白標記技術已經廣泛應用于生命科學研究的各個領域，如研究蛋白的定位及時空示蹤、基因表達、微生物與寄主的相互作用等過程[5-7]。目前，熒光蛋白標記已經應用于研究尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)[8]、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)[9]、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)[10]、黃曲霉(Aspergillus flavus)[11]等病原菌的侵染過程和有性生殖等，但鮮有關于擬輪枝鐮孢菌的研究。擬輪枝鐮孢菌是異宗配合子囊菌，只有在2 種不同交配型(MAT-1和MAT-2)的菌株間才可以進行有性生殖[12-13]。因此，本研究通過聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導的原生質體轉化法分別將eGFP和mCherry熒光蛋白基因導入到不同交配型的擬輪枝鐮孢菌菌株FvLNF15-11 和Fv-SHF19-37 中，以期為研究擬輪枝鐮孢菌的侵染過程、有性生殖和致病機制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑和儀器

1.1.1 供試材料

供試植物材料為對擬輪枝鐮孢菌引起的玉米莖、穗腐病表現感病的玉米自交系B73 植株，種子由中國農業科學院作物科學研究所惠贈。供試擬輪枝鐮孢菌菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 分別分離自遼寧和上海采集的玉米病樣；供試質粒包括pMD18T-TrpCP、pMD18T-TrpCT、pMD18-T-eGFP、pMD18T-mCherry 和pCOM；菌株和質粒均由農業農村部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

PCR 高保真DNA 聚合酶(P520-01)、膠回收試劑盒(DC301-01)、質粒小提試劑盒(DC201-01)和無縫克隆試劑盒(C113)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。供試溶菌肉湯培養基(luria-bertani medium，LB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar medium，PDA)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)、完全培養基(complete medium，CM)和胡蘿卜瓊脂培養基(carrot agar medium，CA)為微生物常用培養基，再生液體培養基(regeneration liquid medium，RLM)和再生瓊脂培養基(regeneration agar medium，RAM)的配制參考RIDENOUR 等[14]的方法。試驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器

艾本德臺式高速離心機(Eppendorf 5810 R)；伯樂PCR 儀(C1000)；北京六一瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)；上海勤翔凝膠成像分析系統(GeneSons 2000)；奧林巴斯光學顯微鏡(CX23)；激光共聚焦顯微鏡(蔡司LSM 880)。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬輪枝鐮孢菌交配類型鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取菌株基因組[15]，使用MAT-1基因座和MAT-2基因座特異性引物(表1)進行PCR 擴增以確定擬輪枝鐮孢菌FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的交配型[16]。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.2 重組質粒的構建和酶切

以質粒pMD18T-TrpCP 和pMD18T-TrpCT 為模板，通過引物TrpCPF/TrpCPR 和TrpCTF/Trp-CTR (表1)分別擴增構巢曲霉(A.nidulans)trpC基因啟動子TrpCP 和終止子TrpCT 序列片段，利用無縫克隆的方法[17]將上述片段構建到質粒p-COM 中得到載體pCOM-TrpCP-TrpCT。以質粒pMD18T-eGFP 和pMD18T-mCherry 為模板，通過引物TeGFPF/TeGFPR 和TmCherryF/TmCherryR (表1)分別擴增eGFP和mCherry基因片段，利用無縫克隆的方法[17]將上述片段構建到pCOMTrpCP-TrpCT 載體，得到質粒pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry，以G418 抗生素作為篩選標記。用限制性內切酶HindⅢ對質粒pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry 進行酶切，使其線性化。

1.2.3 PEG 介導的擬輪枝鐮孢菌原生質體轉化

將從PDA 平板上收集到的擬輪枝鐮孢菌分生孢子接種于YEPD 培養基中，搖培過夜使孢子萌發為幼殖體。2 500 r/min 離心5 min 收集幼殖體，用20 mL 0.7 mol/L NaCl 重懸和清洗幼殖體2 次，2 500 r/min 離心5 min 后棄上清；用10 mL 0.7 mol/L NaCl 重懸幼殖體，加入酶解液(0.1 g 溶壁酶和0.1 g 崩潰酶溶解于10 mL 0.7 mol/L Na-Cl 中) 10 mL，于28 ℃、150 r/min 條件下酶解3 h，然后在4 ℃、2 500 r/min 條件下離心5 min 收集原生質體；經預冷的0.7 mol/L NaCl 溶液重懸和清洗后，再用預冷的0.7 mol/L NaCl 溶液500 μL重懸原生質體。取HindⅢ線性化的質粒pCOMeGFP 和pCOM-mCherry 10 μL 分別加入100 μL FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的原生質體中，冰上靜置30 min 后加入40% PEG 溶液100 μL，室溫放置20 min；加入RLM 培養基800 μL，在25 ℃、100 r/min 搖床中搖培過夜。將復壁后的溶液加到含有100 μg/mL G418 抗生素的RAM 培養基50 mL中，混勻后倒板，在25 ℃恒溫培養箱培養2～4 d 后進行轉化子篩選鑒定[14]。

1.2.4 轉化子的驗證及遺傳穩定性

以轉化子的基因組為模板，用eGFP基因、m-Cherry基因和抗性基因neo的特異性引物(表1)進行PCR 擴增以驗證轉化子，利用激光共聚焦顯微鏡對PCR 驗證到的陽性轉化子進行熒光檢測；觀察到熒光的轉化子在無G418 抗生素的PDA 培養基上繼代培養5 代，再轉接到含有G418 抗生素的PDA 培養基上，觀察菌株能否正常生長，以確認eGFP基因和mCherry基因在轉化子中的遺傳穩定性。

1.2.5 熒光標記菌株生長特性的觀察

(1)菌落形態觀察及生長速率測定

GFP 標記菌株FvLNF15-11-eGFP、mCherry標記菌株FvSHF19-37-mCherry 和相應的野生型菌株分別在PDA 培養基活化5 d，用直徑為1 cm的吸頭打邊緣菌餅并轉接到新的PDA 培養基上；在25 ℃培養箱黑暗培養6 d 后，在2 個垂直方向上測量菌落直徑并拍照，每個處理重復3 次[18]。

(2)產孢量統計和孢子形態觀察

用直徑為1 cm 的吸頭打1 個邊緣菌落至1 mL ddH2O 中，旋渦振蕩2 min，用血球計數板統計孢子數量并觀察孢子形態，每個處理統計3 次[18]。

1.2.6 熒光標記菌株的致病性測定

(1)孢子懸浮液的制備

將待測菌株接種于CM 液體培養基中，于25 ℃、150 r/min 條件下搖培3 d，使用滅菌的3 層擦鏡紙過濾菌液，收集分生孢子，用血球計數板計數并調節孢子懸浮液密度為1×106mL-1[18]。

(2)玉米莖稈的接種

玉米自交系B73 種子消毒后種植于溫室，待玉米長到10 葉期時，挑選長勢一致的玉米進行接種。用滅菌牙簽在玉米第2、3 莖稈中間扎孔，用注射器接種孢子懸浮液，再用滅菌紗布包裹接種處，期間用ddH2O 保濕2 次；接種7 d 后，沿接種處縱向劈開玉米莖稈并拍照，利用ImageJ 統計病斑面積。以接種ddH2O 作為陰性對照，每個處理重復3 次[18]。

1.2.7 熒光標記菌株間的雜交及子囊殼產生情況

將菌株FvLNF15-11 和FvLNF15-11-eGFP 作為母本培養于CA 培養基，菌株SHF19-37 和SHF19-37-mCherry 作為父本培養于CM 固體培養基，于25 ℃條件下培養7 d 后，用2.5%吐溫60沖洗父本菌株菌落并收集分生孢子，用血球計數板計數并調節孢子懸浮液密度為1×108mL-1。吸取父本孢子懸浮液1 mL 均勻涂布于母本菌株表面制成雜交平板，再將平板置于25 ℃、黑光燈條件下進行光照12 h/黑暗12 h 的循環誘導[13,19]，培養4 周后觀察子囊殼的產生情況。以FvLNF15-11 與FvSHF19-37 菌株的雜交結果作為對照，每個處理重復3 次。

2 結果與分析

2.1 擬輪枝鐮孢菌的交配類型

由圖1 可知：使用MAT-1基因座和MAT-2基因座特異性引物從菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的基因組中分別擴增出800 和250 bp 的片段，表明菌株FvLNF15-11 為MAT-2型，菌株FvSHF-19-37 為MAT-1型。

圖1 野生型菌株FvLNF15-11 和FvSHF19-37 的交配類型Fig.1 Mating types of the wild-type strains FvLNF15-11 and FvSHF19-37

2.2 質粒的構建及轉化子的篩選與鑒定

利用無縫克隆的方法成功構建了pCOM-eGFP 和pCOM-mCherry 載體(圖2a)。通過PEG 介導的原生質體遺傳轉化后，利用eGFP基因和neo基因特異性引物從FvLNF15-11-eGFP 轉化子中分別擴增出650 和795 bp 的片段(圖2b～c)；利用m-Cherry基因和neo基因特異性引物從FvSHF19-37-mCherry 轉化子中分別擴增出711 和795 bp 的片段(圖2d～e)。PCR 擴增的片段大小與預期一致，表明eGFP基因和mCherry基因已分別整合到FvLNF15-11 和FvSHF19-37 菌株的基因組中。

圖2 質粒圖譜及熒光標記轉化子PCR 鑒定的電泳圖Fig.2 Plasmid map and electrophoresis image for PCR identification of fluorescently labeled transformants

2.3 熒光標記菌株的熒光觀察及遺傳穩定性

熒光檢測結果(圖3)顯示：菌株FvLNF15-11-eGFP 的分生孢子和菌絲中觀察到綠色熒光，菌株FvSHF19-37-mCherry 的分生孢子和菌絲中觀察到紅色熒光，而野生型菌株中未觀察到熒光，表明eGFP基因和mCherry基因在相應的菌株中成功表達。熒光標記菌株繼代培養5 代后轉接到含G418 抗生素的PDA 平板上繼續培養，菌株能正常生長，表明eGFP基因和mCherry基因能夠穩定遺傳。

2.4 熒光標記菌株的生長特性

由圖4 可知：熒光標記菌株的菌落形態、孢子形態、生長速率和產孢量與野生型菌株無明顯差異，表明eGFP基因和mCherry基因的插入不影響熒光標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的生長發育。

圖4 熒光標記擬輪枝鐮孢菌的生長特性Fig.4 Growth characteristics of fluorescently labeled F.verticillioides

2.5 熒光標記菌株的致病性

熒光標記菌株和野生型菌株接種玉米莖稈后，玉米莖稈組織均出現褐色病斑及腐爛，而接種無菌水的對照未觀察到癥狀(圖5a)；熒光標記菌株的病斑面積與野生型菌株的病斑面積差異不顯著(圖5b)，表明熒光標記菌株能侵染玉米并造成玉米莖腐病，且致病力與野生型菌株相似。

圖5 熒光標記擬輪枝鐮孢菌的致病性Fig.5 Pathogenicity of fluorescently labeled F.verticillioides

2.6 熒光標記菌株的有性生殖能力

由圖6 可知：通過黑光燈誘導后，熒光標記菌株產生的子囊殼數量與野生型菌株相近，表明eGFP基因和mCherry基因不影響標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的有性生殖能力。

圖6 熒光標記擬輪枝鐮孢菌的有性生殖能力Fig.6 Sexual reproduction ability of fluorescently labeled F.verticillioides

3 討論

熒光標記技術被廣泛運用于研究病原菌的侵染過程、致病機制等[5-7]，本研究通過PEG 介導的遺傳轉化方法成功構建了不同交配型擬輪枝鐮孢菌的熒光標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry，eGFP和mCherry基因在相應菌株的菌絲和孢子中能穩定表達。在真菌的遺傳轉化中，外源基因隨機整合到基因組中可能會影響真菌的生長發育[20]，但本研究中熒光標記菌株的菌落形態和孢子形態與野生型菌株十分相似，且兩者的生長速率和產孢量無明顯差異，表明eGFP基因和mCherry基因不影響熒光標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 的 生長發育，這與WU 等[21]的研究結果相似。由于鐮孢菌通過有性生殖產生子囊孢子越冬完成病害循環[22]，本研究對熒光標記菌株的有性生殖進行測定，結果顯示熒光標記菌株產生的子囊殼數量與野生型菌株相近，表明eGFP基因和mCherry基因不影響熒光標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和Fv-SHF19-37-mCherry 的有性生殖能力，這一結果與LUIS 等[11]的研究報道一致。本研究表明：接種擬輪枝鐮孢菌后，玉米莖稈組織出現褐色病斑及腐爛的發病癥狀，且熒光標記菌株與野生型菌株的病斑面積差異并不顯著，表明熒光標記菌株保持了與野生型菌株相似的致病力；GAI 等[23]研究顯示：eGFP 標記的擬輪枝鐮孢菌與野生型菌株對玉米病害病情指數的影響無明顯差異，但eGFP 標記擬輪枝鐮孢菌的毒力明顯弱于野生型菌株，這可能是由于eGFP基因隨機整合到基因組中影響某些功能基因的表達。因此，本研究構建的熒光標記菌株FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 可以更好地用于研究擬輪枝鐮孢的侵染和有性生殖等過程。

4 結論

本研究通過PEG 介導的原生質體轉化法成功將熒光蛋白基因eGFP和mCherry分別導入到不同交配型的擬輪枝鐮孢菌中，獲得帶有熒光標記的FvLNF15-11-eGFP 和FvSHF19-37-mCherry 菌株。該熒光標記不會影響擬輪枝鐮孢菌的生長發育、有性生殖以及致病力。研究結果為后續擬輪枝鐮孢菌的侵染過程、有性生殖和致病機制研究提供了材料。