2013—2021 年云南省豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)流行與混合感染狀況調查*

鄧珺文，畢峻龍，李永能，程美玲，沈學文，楊貴樹，尹革芬**

(1.云南農業大學 動物醫學院，云南 昆明 650201；2.紅河州動物疫病預防控制中心，云南 蒙自 661100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病。該病于1987 年首次在美國發現，并逐漸蔓延至歐洲和亞洲[1-2]，中國大陸于1995 年發現該病[3]，1996 年分離到PRRSV[4]。PRRSV 具有高度遺傳多樣性和快速進化的特征，各基因型之間的抗原表位發生突變，導致疫苗免疫效果降低。為預防PRRSV 的傳播，控制PRRS的發生，養殖場生產一線通常采用藥物預防或疫苗免疫的方法，但效果有限，如何有效地控制PRRS 流行是當前面臨的嚴峻挑戰。2006 年變異毒株引起高致病性豬藍耳病[5]給部分養豬企業造成了嚴重損失，近年來出現的類NADC30 毒株[6-7]和類NADC34 毒株[8]正逐步成為新的流行毒株，然而有關云南省內新發毒株的流行情況鮮有報道。本研究通過分子生物學方法檢測2013—2021年間云南省部分地區收集到的血液樣品，旨在調查云南省PRRS 的流行規律和混合感染情況以及PRRSV 不同基因型的流行情況，以期為PRRS 的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

于2013—2021 年采集云南省各地區不同養殖場、不同生長階段豬群的血液樣品3 112 份(表1)。其中，在3 種不同類型養殖場進行樣品采集：種豬場567 份，育肥場1 650 份，散養戶895份；對5 個不同生長階段的豬群進行樣品采集：哺乳仔豬556 份，保育豬943 份，生長育肥豬1 089份，種公豬71 份，種母豬453 份。

1.1.2 試驗材料

病毒RNA 提取試劑RNAiso Plus、6×Loading Buffer、DL500 DNA Marker、pMD19-T 載體和大腸桿菌DH5α 感受態細胞購自寶生物工程有限公司；病毒DNA 提取試劑盒購自濟凡生物科技有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 和2×TransTaqHigh Fidelity (HIFI) PCR SuperMix Ⅱ購自北京全式金生物技術有限公司；異丙醇、氯仿和無水乙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 PRRSV 陽性樣品篩選

取血液樣品200 μL 放入離心管，加入RNAiso Plus 細胞裂解液1 mL，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min；取上清后加入一半體積的氯仿，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min；取上清后加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min；棄去管中液體后加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min 離心5 min，棄去液體后室溫放置5～10 min，最后將沉淀溶于無RNA 酶水20 μL 中，獲得血液樣品的基因組RNA。參考畢峻龍[9]的PRRSV RT-PCR 檢測方法對總RNA 進行PCR 擴增，擴增得到的RT-PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，用DL500 DNA Marker 確定目的條帶大小，在凝膠成像系統中觀察結果并拍照。

1.2.2 PRRSV 感染情況調查

為進一步分析PRRSV 和其他病毒混合感染的情況，使用病毒DNA 提取試劑盒，按照相關說明書提取得到血液樣品的基因組DNA。使用PCR/RT-PCR 方法進一步對PRRSV 核酸陽性樣品進行豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)和豬圓環病毒2 型病毒(porcine circovirus type 2 virus，PCV2)檢測，檢測引物和方法參考畢峻龍[9]的研究。對陽性樣品的檢出率進行不同年份、不同類型養殖場、不同年齡階段和混合感染情況分析。

1.2.3 PRRSV 基因型分析

選取保存較為完好(均為2017—2021 年的樣品)且具有較強毒力的PRRSV 陽性樣品共53 份，將產物純化回收后與pMD19-T 載體連接，轉化入DH5α 中，均勻涂板后放入37 ℃恒溫培養箱培養16～22 h，挑取單個菌落進行富集，于恒溫培養搖床(220 r/min，37 ℃)振蕩過夜培養后提取質粒，并送至生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序，得到PRRSV 的nsp2基因序列，再進行基因型分析。

2 結果與分析

2.1 PRRSV 檢測結果

樣品經RT-PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約為330 bp 的特異性條帶(圖1)，表明部分樣品PRRSV 核酸檢測呈陽性。經統計，在2013—2021 年收集的3 112 份樣品中，PPRSV 核酸陽性樣品有801 份，陽性率為25.74%。

圖1 PRRSV 核酸檢測電泳圖Fig.1 Electrophoretic detection picture of PRRSV

2.2 不同年份PRRSV 核酸檢測結果

由表2 可知：2013—2018 年，PRRSV 檢出率呈上升趨勢；2019—2021 年，PRRSV 檢出率有一定下降，但仍在20%以上。

表2 2013—2021 年送檢樣品PRRSV 核酸陽性率Tab.2 Positive rate of PRRSV in samples sent for testing from 2013 to 2021

2.3 PRRSV 與其他病原的雙重、多重感染情況

對801 份PRRSV 核酸陽性樣品進行其他疫病檢測，出現雙重混合感染的樣品有330 份，混合感染率為41.20%。其中，檢出CSFV 陽性樣品78 份，陽性率9.74%；PCV2 陽性樣品198 份，陽性率24.72%；PRV 陽性樣品54 份，陽性率6.74%(表3)。

有100 份PRRSV 核酸陽性樣品出現三重混合感染，混合感染率為12.48%；15 份樣品出現PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率為1.87%。其中，18 份樣品檢出PRRSV、CSFV 和PRV 三重混合感染；50 份樣品檢出PRRSV、CSFV 和PCV2 三重混合感染；32 份樣品檢出PRRSV、PCV2 和PRV 三重混合感染(表4)。

表4 多重混合感染情況Tab.4 Situation of multiple mixed infection

2.4 不同類型養殖場PRRSV 感染情況

801 份PRRSV 陽性樣品中，種豬場陽性樣品81 份，檢出率為14.29% (81/567)；育肥場陽性樣品461 份，檢出率為27.94% (461/1 650)；散養戶陽性樣品259 份，檢出率為28.94% (259/895)?？梢?，相對于育肥場和散養戶，種豬場PRRSV 感染程度較輕。

2.5 不同生長發育階段豬群PRRSV 感染情況

801 份PRRSV 陽性樣品中，哺乳仔豬陽性樣品93 份，檢出率為16.73% (93/556)；保育豬陽性樣品271 份，檢出率為28.74% (271/943)；生長育肥豬陽性樣品362 份，檢出率為33.24% (362/1 089)；種公豬陽性樣品6 份，檢出率為8.45% (6/71)；種母豬陽性樣品69 份，檢出率為15.23% (69/453)?？梢?，不同生長階段豬群的PRRSV 感染程度差異較大，生長育肥豬感染最嚴重，其余依次是保育豬、哺乳仔豬、種母豬和種公豬。

2.6 不同毒株類型分析

由表5 可知：2017—2021 年間，高致病性毒株占58.49% (31/53)，檢出數量呈逐年下降趨勢；經典毒株占22.64% (12/53)，檢出數量呈逐年下降趨勢；類NADC30 毒株自2019 年檢出后呈逐年上升趨勢，占比為15.09% (8/53)；類NADC34 毒株于2021 年在云南省內首次發現，占比為3.77%(2/53)。

表5 陽性樣品中的不同毒株數量Tab.5 Number of different strains in positive samples

3 討論

1995 年在中國大陸發現了PRRS[3]；1996 年郭寶清等[4]在國內暴發PRRS 的豬群中首次分離到PRRSV；1997—1998 年對PRRSV 的血清流行病學調查發現：PRRS 在華東地區廣泛存在[10]；2006 年，1 種新型PRRSV 變異毒株在中國引起非典型PRRS 的暴發，其特點是所有年齡段的豬都出現高熱癥狀，且發病率和死亡率高，這種新型的PRRSV 被定名為高致病性豬藍耳病[5]；2006年下半年，云南省部分地區也發生了高致病性豬藍耳病疫情，隨后分離到了PRRSV 云南毒株[11]；之后，在云南省內不斷檢測出PRRSV，經深入研究，證實了云南省內廣泛存在PRRS，并呈現出一定的流行趨勢[12-13]。本研究檢測了2013—2021年間收集的3 112 份血液樣品，發現有801 份樣品為PPRSV 陽性，總陽性率為25.74%。在2013—2018 年間，PRRSV 檢出率呈上升趨勢，陽性率在21.08%～41.72%之間；近3 年來，PRRSV 檢出率在22.56%～24.32%之間，雖有一定下降但仍高于20%，提示PRRSV 仍在云南省的部分養殖場中廣泛流行。

近年來，臨床上出現多種病原混合感染和持續性感染的現象，且呈上升趨勢[14]。在云南省的部分養殖場中，繁殖障礙病毒性疾病常以PRRSV 和PCV2 的混合感染為主[15]，這2 種病毒均能夠破壞宿主的免疫過程，并進一步加重混合感染的程度[16-17]。本研究進一步對801 份PRRSV 核酸陽性樣品進行其他疫病檢測，發現其在不同程度上與CSFV、PRV、PCV2 等病原發生混合感染。經檢測，共有330 份PRRSV 核酸陽性樣品出現雙重混合感染，混合感染率為41.20%，且PRRSV 和PCV2 雙重混合感染最為常見；共有100 份PRRSV 核酸陽性樣品出現三重混合感染，混合感染率為12.48%；共有15 份樣品檢出PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率為1.87%。結果提示當前規模養殖場發生疫病的主要臨床表現為PRRSV 和其他疫病混合感染，且相對于育肥場和散養戶，種豬場的PRRSV 感染程度較輕；不同生長階段豬群中，以生長育肥豬感染最嚴重。

PRRSV 具有基因遺傳多樣的特性，且不斷出現新的變異毒株，尤其是近年來新發現的類NADC30 新毒株，目前已在中國多地流行[6-7]；2017年，中國新出現了類NADC34 毒株，并逐步在全國范圍內流行[8]；現階段，中國主要流行的毒株仍為類JXA1 和類NADC30 毒株[18]。本研究選取53 份PRRSV 陽性樣品進行測序，并進行基因型分析，結果發現：2017—2021 年間，高致病性毒株和經典毒株占比呈逐年下降趨勢，類NADC-30 毒株自2019 年檢出后占比呈逐年上升趨勢，類NADC34 毒株于2021 年在云南省首次發現。提示類NADC30 毒株和類NADC34 毒株等新型變異毒株已在云南省內流行，并可能會逐漸取代高致病性毒株和經典毒株成為云南省的優勢毒株。

4 結論

2013—2021 年間，PRRSV 仍是對云南省生豬養殖危害最大的疫病之一，當前規模養殖場發生疫病的主要臨床表現為PRRSV 和其他疫病混合感染，相對于育肥場和散養戶，種豬場感染程度較輕，生長育肥豬感染最嚴重。類NADC30 毒株和類NADC34 毒株等新發毒株可能會成為云南省優勢毒株。本研究為PRRS 的防控提供了理論參考依據。

致謝：云南省獸醫生物制品研制中心獸醫師朱玲云、楚雄彝族自治州動物疫病預防控制中心獸醫師趙謙、石林彝族自治縣畜牧獸醫總站高級獸醫師陳關雄、麗江市古城區農業農村局高級獸醫師楊淵、云南省普文公路動物防疫監督檢查站農業推廣研究員鄭旺華在樣本采集、數據分析、流行病學調查等方面提供了大量幫助，特質誠摯謝意！