復合酶法提取槐花多糖的工藝優化及其抗氧化活性

任曉莉，楊 璐，喬 鵬，繆奕鍇，楊懿昂，代秋紅，張賢德

（太原工業學院環境與安全工程系，山西太原 030008）

槐花多糖是從槐花中提取的由10 個以上單糖通過糖苷鍵結合而成的高分子聚合物[1]，具有抗氧化[2]、降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、免疫增強活性[6-7]等多種生理學功能，因其獨特的功效，引起了現代醫學和食品功能化學研究人員共同的關注。常見的槐花多糖的提取方法為水提醇沉法，包括酶輔助提取和超聲輔助提取等。張玉梅等[8]采用水提醇沉法，從天津藥店中的干燥槐花中提取多糖，提取得率為3.94%。胡喜蘭等[9]采用水提法從新疆伊犁槐花中提取多糖，提取得率為6.26%。楊申明等[10]采用超聲輔助提取法，從云南楚雄槐花中提取多糖，提取得率為15.89%。王紅慶等[11]采用水提法從信陽賢山的槐花中提取多糖，提取得率為3.10%。徐建國等[12]采用水提法，從山西師范大學校園內的槐花中提取多糖，得率為3.16%。王麗華等[13]采用水提法，從西安市藻露堂大藥房的槐花中提取多糖，提取得率為3.40%。由上述文獻可以看出，不同產地不同提取方法槐花多糖得率不同。在多糖的提取中，由于酶法提取具有反應條件溫和、降低提取成本，加快多糖釋放等優點，趙慶友[14]采用纖維素酶法提取泰山槐花多糖，提取得率為4.93%，曹小燕等[15]采用纖維素酶法提取秦巴山區野生槐花多糖，提取得率達到17.1%，上述酶法提取均采用纖維素酶提取。盡管復合酶法提取槐花多糖鮮有報道，但是應用復合酶法提取其他植物多糖卻很普遍，如復合酶法提取昆布多糖[16]、菊苣多糖[17]、莪術多糖[18]、香菇多糖[19]和荷葉多糖[20]等。借鑒前人的研究成果，考慮到國槐花富含果膠和纖維素，為了使多糖得以充分釋放，本研究以太原工業學院校園內的國槐花為實驗材料，采用果膠酶和纖維素酶復合酶解法提取槐花多糖，并研究了復合酶提取槐花多糖的最優條件；由于抗氧化活性是評價多糖重要指標，近年來國內外已將抗氧化活性用于功能性食品的評價。因此，本研究測定了所制備的槐花多糖的抗氧化活性，以期為槐花多糖功能食品的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國槐花 太原工業學院校園，7 月采摘，干燥通風下自然晾干（含水率約8.62%），去除枝梗等雜質，密封保存待用；果膠酶（30000 U/g）、纖維素酶（100000 U/g） 山東隆科特酶制劑有限公司；無水乙醇 山西同杰化學試劑有限公司；蒽酮試劑 五聯化工有限公司；無水葡萄糖、維生素C、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、三氯乙酸、氯化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸、過硫酸鉀 西隴科學股份有限公司；DPPH、ABTS 合肥巴斯夫生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵 天津市申泰化學試劑有限公司；鐵氰化鉀 天津市北辰方正試劑廠；以上藥品和試劑均為分析純。

SENCO 真空旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；752N 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ZK-82 真空干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；FZ102 植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；HH-3A 數顯恒溫水浴鍋 金壇市城西騰輝實驗儀器廠；FA1004 電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；美的EG823MF3-NW 微波爐 美的集團有限公司；QHG-100A 雙層恒溫氣浴振蕩器 常州市普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐花多糖提取工藝 槐花多糖提取工藝流程見圖1。

圖1 槐花多糖提取工藝流程Fig.1 Extraction process of Sophora japonica polysaccharides

槐花多糖含量采用蒽酮比色法[21]進行測定，得率η采用公式（1）進行計算：

式中：M多糖為槐花多糖的質量（g）；M槐花為槐花粉的質量（g）。

1.2.2 單因素實驗 分別稱取2 g 的槐花粉置于錐形瓶中，以得率為指標，采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液進行提取，酶解結束后微波輔助提取功率400 W，時間30 s。

選取復合酶添加量（5、10、15、20、25 mg/g），提取液pH4.8，果膠酶與纖維素酶比例為1:1，酶解時間60 min，酶解溫度45 ℃，液固比25:1，微波功率400 W，確定最佳復合酶添加量。

選取pH（3.6、4.0、4.4、4.8、5.2），酶添加量15 mg/g，果膠酶與纖維素酶比例為1:1，酶解時間60 min，酶解溫度45 ℃，液固比25:1，微波功率400 W，確定最佳pH。

選取果膠酶和纖維素酶比例（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1），提取液pH4.8，酶添加量為7.5 mg/g，酶解時間60 min，酶解溫度45 ℃，液固比25:1，微波功率400 W，確定最佳復合酶比例。

選取酶解時間（30、60、90、120、150 min），提取液pH4.8，酶添加量15 mg/g，纖維素酶與果膠酶比例為1:1，酶解溫度45 ℃，液固比25:1，微波功率400 W，確定最佳酶解時間。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，以得率為響應值，以A：酶添加量、B：pH、C：酶比例為考察因素，根據Box-Behnken 設計原理設計響應面試驗，確定槐花多糖最佳提取參數。設計因素和水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 槐花多糖抗氧化活性研究 配制一系列濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mg/mL）的槐花多糖溶液，分別測定其對DPPH·和ABTS+·的清除率和總還原力，并與VC對照分析。

1.2.4.1 DPPH·清除率測定 分別配制一系列不同濃度的VC和槐花多糖溶液，參照文獻[22-23]的方法進行測定，根據公式（2）計算溶液對DPPH·的清除率。

式中：A 為槐花多糖/VC溶液吸光值；A1為對照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.4.2 ABTS+·清除率 配制7.6 mmol/L 的ABTS儲備液，稀釋到在734 nm 吸光值為0.700±0.020，作為工作液，參照文獻[24-26]的方法進行測定，ABTS+·的清除率計算參照公式（2）。

1.2.4.3 總還原力測定 參照文獻[27-29]的測定方法。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3 次，實驗數據使用平均數±標準差表示，單因素實驗和抗氧化性實驗數據均采用Microsoft Office Excel 2019 軟件進行數據分析和繪圖。響應面試驗數據采用Design expert 12 軟件進行響應面作圖和ANOVA 分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶添加量對得率的影響 如圖2 所示，復合酶添加量從5 mg/g 升高到15 mg/g 時，多糖得率從5.95%增加到9.59%，提高了3.64%；當復合酶添加量達到20 mg/g，即果膠酶和纖維素酶各10 mg/g，多糖得率趨于穩定，達到9.73%，這說明當酶添加量較低時，復合酶量相對于底物不足；達到20 mg/g 時，底物幾乎已經全部酶解，再增加復合酶量，意義不大且不利于后續提取分離。綜上所述，認為最佳復合酶添加量為20 mg/g，選取15、20、25 mg/g 進行響應面試驗。文獻[14-15]中采用纖維素酶提取槐花多糖，最佳纖維素酶添加量均與本文一致。

圖2 復合酶添加量對槐花多糖得率的影響Fig.2 Effect of addition amount of compound enzyme on the yield of Sophora japonica polysaccharides

2.1.2 pH 對得率的影響 如圖3 所示，pH 從3.6 升高到4.8 時，多糖得率呈現增加的趨勢，pH4.8 時，得率達到最大值9.76%，之后得率開始降低，分析原因可能是pH4.8 時，復合酶的活性較高，有利于槐花中的果膠和纖維素進行酶解，增加多糖的溶出率。因此，分別選取pH 為4.4、4.8、5.2 進行響應面試驗。

圖3 pH 對槐花多糖得率的影響Fig.3 Effect of pH on the yield of Sophora japonica polysaccharides

2.1.3 酶比例對得率的影響 如圖4 所示，果膠酶和纖維素酶能促進細胞壁纖維素和果膠的分解，促進破壁后釋放細胞壁內的多糖成分，提高槐花多糖的溶出性，同時利于提取液和殘渣的分離，本文中當果膠酶與纖維素酶比例為1:1 時，對于槐花多糖提取是最有利的，此時多糖得率為9.77%，達到最高。因此，選取果膠酶和纖維素酶比例1:2、1:1、2:1 進行響應面試驗，為了方便響應面數據處理和分析，酶比例改為采用果膠酶占復合酶質量比的形式，即0.33、0.50和0.67。

圖4 酶比例對槐花多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme ratio on the yield of Sophora japonica polysaccharides

2.1.4 酶解時間對得率的影響 如圖5 所示，當酶解時間從30 min 增加到60 min 時，槐花多糖得率從6.65%迅速提高到9.77%，此后再增加酶解時間，得率上升不明顯，當120 min 時，得率為10.21%；150 min時，得率為10.31%，基本趨于穩定。這可能是因為酶解時間過短，受酶解速率和傳質的影響，多糖無法全部溶出，本文認為150 min 酶解比較完全。因此固定酶解時間為150 min。

圖5 酶解時間對槐花多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Sophora japonica polysaccharides

2.2 響應面試驗

根據單因素實驗結果，選取了響應面試驗的三因素三水平，分別為pH（4.4、4.8、5.2）、酶添加量（15、20、25 mg/g）和酶比例（0.33、0.50、0.67），酶解時間選擇150 min，試驗結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

模型P＜0.01 表明在0.01 的水平上回歸顯著，A、B、C、AB、A2、B2、C2是顯著的模型參數（P＜0.05），AC 和BC 是不顯著的模型參數（P＞0.05），由F值可知，對槐花多糖得率影響大小依次為A 酶添加量、C 酶比例、B pH。失擬項P=0.1097＞0.05，說明失擬不顯著，模型的選擇是正確的?；貧w方程為：Y=-162.70-0.08347A+68.76B+39.28C+0.195AB+0.1529AC+1.1029BC-0.0193A2-7.7B2-50.61C2。

模型的R2為0.9849，說明實測值與預測值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預測槐花多糖提取。調整R2為0.9655，表明得率96.55%的變異分布在方程的一次項、二次項、交互項的因子中，其總變異中僅有3.45%不能由該模型來解釋。預測R2為0.8137，和調整R2之差為0.1518，小于0.2，說明模型預測是可信的。

復合酶法提取槐花多糖的3D 響應面圖如圖6所示。

圖6 復合酶法提取槐花多糖的3D 響應面圖Fig.6 3D surface of Sophora japonica polysaccharides by enzymatic extraction

圖6 中隨著酶添加量的改變，響應面圖的陡峭程度變化較為顯著，對應的等高線圖的變化也較為明顯，說明酶添加量對得率有較為顯著的影響，根據等高線形狀的變化，可以看出酶添加量和pH 間的交互作用最為顯著，結果與表3 中響應面的方差分析結果一致。

模型預測的最佳提取參數為：酶添加量23.8 mg/g，pH4.8，果膠酶:纖維素酶為0.912:1。在模型預測的最佳提取條件下進行驗證實驗，重復5 次，取平均值，測得槐花多糖得率10.71%，與模型推測的理論值10.72%十分接近。

2.3 槐花多糖的抗氧化活性

2.3.1 槐花多糖對DPPH·清除能力 圖7 中槐花多糖和VC對DPPH·均具有較好的清除能力，并隨著槐花多糖溶液濃度的增加而增加。當溶液濃度為0.4 mg/mL 時，VC對DPPH·清除率達到85%，槐花多糖達到80%，當溶液濃度為2.8 mg/mL 時，VC對DPPH·清除率達到94%，槐花多糖達到88%，說明此濃度下槐花多糖溶液中的還原性組分對DPPH·清除效果明顯。經計算，槐花多糖清除DPPH·的IC50值為0.053 mg/mL。文獻[8]中槐花多糖濃度為5 mg/mL時對DPPH·清除率為89.24%，清除DPPH·的IC50值為1.09 mg/mL。

圖7 槐花多糖和VC 對DPPH·清除能力Fig.7 DPPH scavenging ability of Sophora japonica polysaccharides and VC

2.3.2 槐花多糖對ABTS+·清除能力 圖8 中槐花多糖對ABTS+·清除能力隨著濃度的增加而增大，在較低的濃度0.1 mg/mL 下，槐花多糖對ABTS+·的清除率僅為53.9%，隨著濃度的增加，對ABTS+·清除率迅速增加，當達到1.6 mg/mL 時，ABTS+·清除率達到96.5%，與0.1 mg/mL 的VC溶液對ABTS+·清除率96.91%比較接近，當達到2.8 mg/mL 時，槐花多糖和VC對ABTS+·清除率分別為99.38%和99.59%，十分接近，證明本實驗采用復合酶法提取的槐花多糖對ABTS+·具有較強的清除能力。經計算，槐花多糖清除ABTS+·的IC50值為0.101 mg/mL。文獻[8]中槐花多糖濃度為5 mg/mL 時，對ABTS+·清除率為98.5%，清除ABTS+·的IC50值為1.39 mg/mL。

圖8 槐花多糖和VC 對ABTS+·清除能力Fig.8 ABTS+· scavenging ability of Sophora japonica polysaccharides and VC

2.3.3 槐花多糖的總還原力 圖9 中當槐花多糖濃度從0.1 mg/mL 上升到2.8 mg/mL 時，總還原力從0.236 到0.693，提高了193.64%，VC的總還原力從0.523 到0.912，提高了74.38%。當濃度為2.8 mg/mL時，槐花多糖的總還原力為VC的75.99%，達到了較高的水平。文獻[8]中槐花多糖濃度為5 mg/mL時，總還原力為0.57。

圖9 槐花多糖和VC 的總還原力Fig.9 Total reducing power of Sophora japonica polysaccharides and VC

3 結論

本文采用果膠酶和纖維素酶復合酶法從槐花中提取槐花多糖，提取液采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，單因素實驗結果表明，最適的酶添加量為20 mg/g，pH 為4.8，果膠酶與纖維素酶比例1:1，酶解時間150 min。響應面試驗結果表明對槐花多糖得率影響最大的提取參數為酶添加量，其次是酶比例，酶添加量和pH 之間交互作用比較明顯，最佳的提取條件為：酶添加量23.8 mg/g，pH4.8，果膠酶:纖維素酶為0.912:1，在此條件下，得率為10.71%。通過與VC對照分析槐花多糖對DPPH·和ABTS+·清除能力和總還原力，表明復合酶法提取的槐花多糖具有較好的抗氧化性。

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