黃花蒿精油抑菌、抗氧化及毒理學特性研究

陳文丹，白玉瑩，郭成虎，柴玉宏，王豐俊，黃叢林,*，劉 華,*

（1.北京市農林科學院，北京 100089；2.中央儲備糧寧陵直屬庫有限公司，河南商丘 476111；3.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

植物精油為植物特有的一類芳香物質，屬于次生代謝物質，可隨水蒸氣蒸發，是具有一定揮發性油狀液體的總稱[1]。大多數精油具有廣泛的抗菌活性，對許多真菌和細菌都具有一定的抑菌和殺菌效果[2-3]。黃花蒿又名青蒿，為菊科蒿屬一年生草本植物，蒿屬是菊科植物中分布最廣、最大的屬之一，共有350 多種，中國約有185 種[4]。黃花蒿被廣泛用于香料和藥用植物，其化學成分可分為揮發性成分與非揮發性成分，揮發性成分主要為精油。黃花蒿精油是從黃花蒿中提取出的揮發油，是一種淡黃色油狀液體，主要由單萜和倍半萜組成，富含樟腦、β-芹子烯、α-蒎烯和蒿酮等萜烯類化合物，具有香氣，且含有豐富的生物活性成分，具有抗菌、驅蚊、殺蟲、抗氧化等活性，因而被廣泛用于民間醫藥[5]。Wu 等[6]通過測定黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果，發現其抑菌圈直徑在10.7～17.0 mm，且對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果均較為顯著。

常見的植物精油提取方法有壓榨法[7]、有機溶劑萃取法[8]、亞臨界流體萃取法[9]、水蒸氣蒸餾法[10]等。與其它提取方法相比，本研究所采用的水蒸氣蒸餾法具有成本低、安全無污染等優點，可用于肉桂[11]、獅頭柑[12]等植物精油的提取。李玲玲[13]、Hong 等[14]均采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿精油。

目前，對于黃花蒿的研究主要是從黃花蒿里提取青蒿素——一種高效抗瘧疾的化合物[15-17]，而關于黃花蒿精油化學成分分析及其生理活性研究的報道鮮為少見。因此，本研究可為精油取代一些合成防腐劑提供理論依據，同時為黃花蒿精油的開發利用提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

722/722S 分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；FE28-Standard pH 計 上海托利多儀器有限公司；FA2004 型電子天平 上海上平儀器有限公司；8890-7000 D 型氣相色譜-質譜聯用儀 Agilent安捷倫（美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃花蒿精油的提取 采用水蒸氣蒸餾法[18]提取黃花蒿精油，稱取黃花蒿的葉和莖6 kg，粉碎，以料液比1:2（g/mL）加入去離子水，將其放入精油提取裝備中，加熱至沸騰后開始計時，提取時間為3 h，提取得到的黃花蒿精油冷卻至室溫，放置在深色玻璃瓶中，并在4 ℃保存。以一定質量黃花蒿所提取的精油質量來計算黃花蒿精油的產率，產率按式（1）進行計算。

式中：m 表示黃花蒿精油質量，g；M 表示黃花蒿的質量，g。

1.2.2 GC-MS 分析 GC 條件：色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：He（99.999%），恒流流速1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲3.5 min。升溫程序：初始柱溫為40 ℃，持續3.5 min，以10 ℃/min 升溫至100 ℃，再以7 ℃/min 升溫至180 ℃，最后以25 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min。

MS 條件：電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為選擇離子檢測模式（SIM）。

1.2.3 抗氧化性測定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除率測定 黃花蒿精油的DPPH 自由基清除率參考Mollaei 等[19]的方法進行測定，并稍加修改。將2 mL 的DPPH 溶液（0.1 mmol/L）與2 mL 不同濃度梯度（2、4、6、8、10 mg/mL）的黃花蒿精油混合，搖勻后將混合溶液置于黑暗處反應30 min，反應完成后于517 nm 波長下測定其吸光值。按同樣方法用維生素C 代替黃花蒿精油作陽性對照，所有實驗均重復三次。DPPH 自由基的清除能力用公式（2）進行測定。

水，冒著熱氣，只有大半桶。田志芳立即抖散行李，取出搪瓷缸，舀半缸，猛喝一口，差點全噴出來。水，又苦又澀，田志芳看看鐵桶，看看茶缸，眼淚一下涌出來，這一路她沒哭，她提醒自己是班長，要帶頭做表率，不能哭，不能不堅強，可這水，這又苦又澀的水，像她眼淚一樣的水，讓她的眼淚汩汩地流出來。田志芳這會兒強烈思念家鄉。

式中：A0表示對照（不含黃花蒿樣品）的吸光度；A1表示樣品的吸光度。

1.2.3.2 羥基自由基清除率測定 黃花蒿精油對羥基自由基清除率的測定采用水楊酸法進行測定[20]。將0.5 mL 不同濃度梯度的黃花蒿精油溶液（2、4、6、8、10 mg/mL），0.5 mL 濃度為2 mmol/L 的水楊酸-無 水 乙 醇 溶 液，0.5 mL 濃 度 為1 mmol/L 的Fe2SO4溶液，1 mL 濃度為2 mmol/L 的H2O2溶液依次加入試管中，充分振蕩混勻后靜置30 min，在510 nm 波長下測定其吸光值。按同樣方法用維生素C 代替黃花蒿精油作陽性對照，所有實驗均重復三次。用公式（3）計算清除羥基自由基的清除能力。

式中：A0表示對照（不含黃花蒿樣品）的吸光度；A1表示樣品的吸光度；A2表示不加硫酸亞鐵溶液的吸光度。

1.2.4 抑菌活性 采用瓊脂擴散法評估黃花蒿精油抑菌活性。在超凈臺中，將200 μL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸液（約為108CFU/mL）均勻地涂抹在LB 瓊脂板上。用滅菌后的鑷子夾濾紙片（直徑6 mm）放置于上述培養皿內，將6 μL 的黃花蒿精油添加到6 mm 的濾紙片上。在37 ℃培養箱中孵育24 h。使用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并求平均值。所有實驗均重復三次。

1.2.5 半數致死劑量（LD50）的確定 小鼠飼養在室溫（22±2）℃、相對濕度50%～55%的動物房內。預實驗選用小鼠18 只，動物福利倫理審查批文號為YXSW2112165978，雌雄各占1/2，試驗前禁食不禁飲水16 h，將黃花蒿精油用羧甲基纖維素鈉稀釋。每組6 只小鼠，三組分別按照100、1000、10000 mg/kg體重劑量對小鼠進行一次性灌胃，觀察7 d，記錄小鼠中毒及死亡情況，估計LD50的可能范圍及確定正式試驗的劑量組。

在預試驗的基礎上選用小鼠60 只，隨機分為6 組，每組10 只，雌雄各半。小鼠先適應性喂養3 d，灌胃前禁食不禁水16 h。六個組分別按5000.0、6597.7、8705.7、11487.1、15157.3、20000.0 mg/kg進行一次性灌胃，以生理鹽水灌胃作對照，連續觀察14 d。觀察期內記錄動物死亡數、體重變化和中毒表現等，最后通過劑量-反應曲線的對數回歸分析確定LD50。死亡率按公式（4）進行計算。

式中：W 表示死亡率，%；n 表示每組中死亡的小鼠數量，只；N 表示每組中小鼠的總數量，只。

1.3 數據處理

所有試驗均做三次重復操作，并將試驗結果以平均值±標準差表示。所有試驗數據的處理與分析均使用SPSS 23.0 軟件進行，顯著性分析使用Duncan和ANOVA 法，P＜0.05 時表示數據間存在顯著性差異，使用Origin 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 黃花蒿精油的成分分析

本實驗采用水蒸氣蒸餾法，提取得到的黃花蒿精油產率為1.04‰。通過GC-MS 對黃花蒿精油的化學成分進行分析，共檢測到332 種化合物，其中22 個組分占總成分的71.09%，主要為萜類、芳烴、酚、醇、醛、酯，各化學組分見表1。測得黃花蒿精油中主要成分為萜類，其中蒿酮占19.34%，具有抗炎、抗氧化的作用[21]；（+）-α-蒎烯占6.10%，具有抑菌、消炎的作用[22]。產地為馬德拉群島的黃花蒿精油經過GC-MS 分析，主要成分為萜類化合物與本研究結果相似[21]；而產地為法國馬賽黃花蒿精油的主要成分為樟腦（44%），這可能是由于其產地、采收季節、提取方式的不同而造成的差異[23]。

表1 黃花蒿精油的成分分析Table 1 Composition analysis of Artemisia annua essential oil

2.2 黃花蒿精油抗氧化性活性的測定

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 自由基是一種穩定的有機自由基，DPPH 中孤電子吸光度降低的程度與樣品的抗氧化程度呈定量關系，因此可用分光光度計進行分析[24]。如圖1 所示，黃花蒿精油濃度在2～10 mg/mL 范圍內，DPPH 自由基清除率隨精油濃度的增加而增大，表現出良好的量效關系，當黃花蒿精油濃度為10 mg/mL 時，DPPH 自由基的清除率最大，為40.03%，該結果與Munda 等[25]對產地為印度的黃花蒿葉片提取精油的研究得出DPPH 自由基清除率隨精油濃度的增加而增大這一結果相似。周江菊等[26]研究發現一些萜類化合物也與抗氧化性有密切關系，如α-蒎烯、石竹烯、檸檬烯等萜類物質均有較強的自由基清除能力；吳均等[27]發現甜橙精油中D-檸檬烯（42.79%）和α-蒎烯（4.54%）的相對含量較高，且甜橙精油具有較強的抗氧化活性。本實驗中黃花蒿精油的主要成分為萜類化合物，α-蒎烯（6.1%）為萜類化合物中含量較高的一種成分，因而可得出α-蒎烯可能與抗氧化活性有關。同時，從表2可知，當黃花蒿精油對自由基的清除率達到50%時，其IC50值為6.76 mg/mL。

圖1 黃花蒿精油的DPPH 自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radicals by Artemisia annua essential oil

表2 DPPH 自由基清除率與黃花蒿精油加入量的線性關系及IC50 值Table 2 Linear relationship between the DPPH free radical scavenging rate and the amount of Artemisia annua essential oil and IC50 value

2.2.2 羥基自由基的清除能力 羥基自由基是一種易于發生化學反應的自由基，其清除率的大小是用于評價抗氧化性的一項重要指標[28]。如圖2 所示，黃花蒿精油清除羥基自由基能力隨著濃度的升高而增強，存在一定的劑量依賴關系。當黃花蒿精油濃度為10 mg/mL 時，羥基自由基的清除率可達92.97%，與陽性對照相比，表明黃花蒿精油的羥基自由基清除能力較強。這一結果與王莉等[29]研究花椒籽精油抗氧化能力得出其羥基自由基與抗氧化能力呈濃度依賴性這一結果相似，當花椒精油濃度為10%時，其清除率可達79.68%。同時，從表3 可知，黃花蒿精油對羥基自由基的IC50為1.9 mg/mL。

圖2 羥基自由基的清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate

表3 羥基自由基清除率與黃花蒿精油加入量的線性關系及IC50 值Table 3 Linear relationship between hydroxyl radical scavenging rate and the amount of Artemisia annua essential oil and IC50 value

2.3 抑菌活性

黃花蒿精油的抑菌效果如圖3 所示。結果表明，黃花蒿精油對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為12.67±0.29 mm，而對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌圈直徑為9.27±0.25 mm，因此可知黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優于大腸桿菌。這一結果與精油對革蘭氏陽性菌的活性略高于革蘭氏陰性菌這一結論相一致，這可能是由于革蘭氏陽性菌的細胞膜與精油的疏水組分可以相互作用；而革蘭氏陰性菌因為含有親水性的細胞壁，所以對精油有一定抵抗力[30]。同時，精油活性的發揮還受細菌形狀的影響，本研究結果與桿狀細胞比球菌狀細胞更容易對抑菌活性有影響[31]這一結論相一致。

圖3 黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌（A）和大腸桿菌（B）的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of Artemisia annua essential oil on Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

除此之外，精油的抗菌活性還可能與其成分相關，主要與單萜、三萜、倍半萜烴類及含氧衍生物相關。研究表明植物精油中的主要成分有萜類、芳香族等化合物，其中芳香族、酚類和萜類起到較強抗菌效果[32]。根據黃花蒿精油的GC-MS 結果顯示，其富含豐富的萜類化合物29 種（蒿酮、（+）-α-蒎烯等），芳烴類5 種（六-2,4-二炔-1-基苯、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯等），這也為黃花蒿精油的抑菌活性提供數據支撐。

2.4 黃花蒿精油毒理學特性試驗

本研究通過觀察小鼠精油灌胃后的中毒行為及死亡率來評估其急性毒性，進而評估黃花蒿精油的安全性。預試驗中精油灌注量達到1000 mg/kg 時，未見小鼠的中毒反應，而當精油灌注量達到10000 mg/kg時，50%的小鼠死亡。在預試驗基礎上進行5000～20000 mg/kg 共6 個劑量組一次性灌胃，小鼠的致死率和中毒癥狀結果見表4。小鼠腹腔注射黃花蒿精油時，5000 mg/kg 劑量對小鼠無不良影響。但隨著注入精油劑量的增加，小鼠的中毒癥狀更加明顯，死亡率也增加。當小鼠注射高劑量溶液10 min 后開始出現異常行為，如呼吸困難和活動遲緩。

表4 黃花蒿精油對小鼠急性毒性試驗結果Table 4 Results of acute toxicity test of Artemisia annua essential oil in mice

評估精油的LD50，判斷其安全性對于食品的生產是十分重要的一個環節[33]。通過劑量-反應曲線的線性回歸，得出半數致死量LD50濃度為7491 mg/kg。根據急性毒性劑量分級表，提取的黃花蒿精油無毒。

小鼠的體重變化是毒理學考察的一個重要指標，加入精油后小鼠的體重突然增大或減小是中毒作用的表現之一[34]。將6 個劑量組的精油溶液對小鼠進行一次性灌胃，分別在0、3、7、10、14 d 測量小鼠體重。小鼠被不同劑量精油灌胃后體重變化結果見表5，當小鼠被灌注低劑量精油時，其體重隨著灌注時間的增長而增加，而當小鼠被灌注高劑量精油時，其體重隨著灌注時間的增長無較大變化；小鼠被不同劑量的精油灌胃后，在0、3、7、10 d 體重并無較大變化，在14 d 時，小鼠體重因灌胃的劑量不同發生了較大變化，這可能是因為高劑量精油在小鼠體內存留時間較長，導致小鼠發生部分死亡甚至全部死亡，從而使得小鼠體重不再變化。

表5 黃花蒿精油對小鼠體重變化的結果Table 5 Results of Artemisia annua essential oil on body weight changes in mice

3 結論

采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿精油，產率為1.04‰。黃花蒿精油經GC-MS 分析鑒定出332 種成分，其中22 個組分含量較高，占總成分的71.09%，包括萜類、酯、醇、醛等化合物，其中主要成分為蒿酮（19.34%），（+）-α-蒎烯（6.10%）。通過對DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和總抗氧化性能力的測試，發現黃花蒿精油的抗氧化能力與黃花蒿精油濃度存在一定的劑量效應對應關系。隨著黃花蒿精油濃度的提高，其抗氧化能力逐漸增強。當黃花蒿精油濃度為10 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率可達到40.03%；羥基自由基清除率可達92.97%；黃花蒿精油的總抗氧化能力也隨著濃度的增加而增加。黃花蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優于大腸桿菌。測定黃花蒿精油的LD50為7491 mg/kg，根據急性毒性劑量分級表，證明提取的黃花蒿精油是無毒的。

本研究對蒿屬植物—黃花蒿進行了精油提取、抗氧化、抑菌、毒理學性質的分析，說明黃花蒿精油在天然抗氧化劑和抑菌劑方面極具開發價值，可為蒿屬植物的開發提供一定的理論依據及技術支撐，將有助于天然生物活性化合物在食品添加劑中的應用。但本研究未對其抑菌機理進行深入研究，因此未來可在此基礎上對黃花蒿精油進行進一步的研究與開發利用。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).