代謝組學在牛奶質量安全中的應用研究進展

慕宇，岳如玉，張慧艷，范慧藝，祁艷霞

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023）

隨著生活水平不斷提高，人們對于食物營養與安全的關注度越來越多。牛奶作為一種生活中比較常見的食品，具有很高的營養價值[1]，被認為是天然的“補品”。同時它也是一種復雜的營養食品，奶牛的品種、健康、飲食、哺乳期及產次都會影響牛奶的質量、成分以及功能[2]，其中脂肪、蛋白質、氨基酸、維生素、脂肪酸、礦物質等是區分牛奶品質的主要標準[3]?？茖W水平的不斷發展，檢測牛奶的技術也在更新。拉曼光譜技術[4]實現了對牛奶中脂肪、脂肪酸、蛋白質和乳糖的定性定量分析，但成本昂貴，并且存在一些技術障礙需要解決，從而阻礙了在乳制品行業檢測的廣泛使用。介電特性[5]通過牛奶的介電常數隨著頻率的變化對牛奶的濃度以及新鮮度進行預測，但靈敏度較低，檢測范圍小。傳感器技術[6]用于監測牛奶中微生物生長改變的pH 值、離子含量、氣味、顏色等物理化學參數，但牛奶在保質期范圍內，這些參數的變化是非常小的，可能不會被傳感器信號檢測到，并且傳感器污垢可能也會產生影響，存在著根本的局限性。代謝組學作為一種新興學科逐漸走向成熟且不斷發展，主要研究相對分子量小于1 000 u 的小分子代謝物，例如氨基酸、脂類、糖類等[7]，因其具有高通量、綜合性的特點，廣泛應用于醫學、農業、食品科學及生命科學等研究領域[8]。近年來，代謝組學在乳品科學領域的應用有了較快的發展，能夠將生產加工過程中代謝物信息應用在牛奶質量和安全控制上[9]。

隨著核磁共振波譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectrum，NMR）、 氣相色譜- 質譜（Gas Chromatography-mass Spectrometry，GCMS）和高效液相色譜-質譜（High Performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry，HPLCMS、HPLC-MS/MS）、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（Ultra-high-performance Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）、 超高效液相色譜- 串聯質譜法（Ultra-high-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UHPLCMS/MS）等高分辨率分析技術的引入，牛奶和奶制品的質量、安全問題得到了有效的識別[10]。此外，代謝組學還可鑒別在牛奶加工，運輸，儲存過程中是否存在摻假[11]，使得牛奶摻假現象也可被監測[12]，代謝組學逐漸成為解決牛奶質量和安全問題的有力工具[13]。

圖1 牛奶代謝組學研究中分析平臺工具Fig.1 Analysis platform in milk metabolomics research

1 代謝組學在牛奶質量中的應用

牛奶質量與安全問題引起人們的高度關注。目前，一些快速檢測技術，特別是光譜、介電特性以及傳感器等，對牛奶中的脂肪、蛋白質、礦物質和維生素實現了快速檢測，在評估牛奶營養成分方面取得了巨大的成功[14]。與上述主要檢測牛奶基本營養成分的技術不同，代謝組學主要用于研究牛奶小分子代謝物。通過代謝物的種類、含量以及濃度不同來區分牛奶的品質。由于代謝物種類繁多，更加有利于區分出奶制品品質差異，從而挑選出優質產品，保障人們的食用安全。

1.1 代謝組學技術測定不同品種的牛奶質量

由于不同乳制品動物種類和品種具有不同的遺傳特征，其所產奶的成分、結構以及理化性質都有所不同。牛奶的來源包括牛、山羊，綿羊以及駱駝等動物，牛是牛奶生產的主要來源，在20 世紀60年代占全球牛奶產量的90%以上。然而，不同品種牛奶代謝物種類以及濃度經過代謝組學檢測發現是有顯著差異的，這種差異對牛奶質量以及營養價值存在影響，不同代謝物對牛奶所具有的功能也存在區別。Sundekilde 等[15]基于NMR 技術研究發現，荷斯坦奶牛牛奶中膽堿和乳糖濃度較高而澤西奶牛的牛奶中肉堿和檸檬酸鹽濃度更高，造成這種現象的原因可能與奶牛品種相關。隨后Yang 等[16]通過NMR 以及LC-MS 技術對該結果進行了驗證，說明利用代謝組學可以區分不同奶牛品種來源的牛奶。

1.2 代謝組學技術測定熱處理方式的牛奶質量

為了延長貨架期通常會采用熱加工的方式對生牛奶進行加工。巴氏殺菌是常見的處理生牛乳的方式之一，此方法廣泛應用在乳制品加工領域，牛奶經過巴氏殺菌在冷藏條件下儲存可達7～28 d[17]，這與生牛乳質量以及巴氏殺菌后的污染有關。經過巴氏殺菌處理后的牛奶味道更新鮮，與生牛乳的味道相似。為了進一步驗證牛奶質量，考慮采用代謝組學技術對巴氏殺菌處理前后的牛奶代謝物進行檢測，觀察經過處理前后代謝物種類以及濃度的變化來判斷牛奶質量的變化。Zhu 等[18,19]通過NMR 和LC-MS 檢測并比較了巴氏殺菌處理前后的牛奶代謝組，經巴氏殺菌處理后的牛奶中脫氧鳥苷、腺嘌呤和?；悄懰岬暮肯陆?，精氨酰脯氨酸、2-甲基丁酰肉堿和溶血磷脂酶含量升高。但代謝物濃度變化幅度較小，說明巴氏殺菌處理是一種有效且溫和的牛奶處理方法，基本保留了原有的牛奶營養價值。值得強調的是，代謝組學技術對代謝物細微變化的高靈敏檢測，使其能夠準確鑒定經過熱加工處理后牛奶中的差異。

1.3 代謝組學技術測定不同環境和飼糧的牛奶質量

環境因素（季節、地理條件）和營養條件等諸多因素對牛奶質量的影響不容忽視，不同的季節[20]、地區、海拔[21]以及營養狀況都或多或少影響著牛奶質量，通過代謝組學對代謝物分析檢測可以進行準確鑒定。

1.3.1 季節影響

季節變化對牛奶質量產生的影響是有必要考慮的，一方面新鮮牧草會隨著季節變化而變化，另一方面，季節溫差不同，也會影響牛奶成分。脂肪是牛奶組成成分之一，牛乳中含有3%～6%的脂肪，其中主要部分是三酰甘油，極性脂質也是脂肪的一部分，在牛奶中都發揮著不可或缺的作用，但都因季節而存在差異。比如極性脂類在秋季含量較高，特別是鞘磷脂，同時也為人體帶來了更多的健康益處，如抗炎活性，抗癌活性，減少膽固醇的吸收以及降低心血管疾病的風險[22]。Liu 等[23]在LC-MS 研究中發現三酰甘油的總體不飽和水平在2 月和3 月大幅下降，5 月才有所提高。同樣，Liu 等[24]基于LC-MS 的研究發現脂質含量隨季節而變化，極性脂類（磷脂酰膽堿、鞘磷脂等）由春季至秋季逐漸增加。表明對于不同季節牛奶成分的變化應用代謝組學是可以精確檢測的，同時也了解到隨季節變化牛奶的營養價值和功能也發生變化，這對乳制品的加工和質量有著重要的意義。

1.3.2 地理位置影響

牛奶的成分也可能會因環境因素而改變，如海拔高度。事實上，許多乳制品的商業價值與牛奶的來源和成分密切相關。在高海拔地區，缺氧對人類和其他動物都是一種嚴重的壓力，破壞氧氣穩態，從而影響組織代謝。不同海拔高度的牛奶代謝物水平不盡相同，代謝組學被用來揭示不同海拔高度的牛奶代謝產物的差異，了解海拔高低對所產牛奶成分的影響。Pu 等[21]利用UHPLC-QTOF-MS 對不同海拔的牛奶代謝差異進行評估，發現低海拔地區牛奶碳水化合物含量較高，其主要參與半乳糖、氨基酸的代謝；高海拔地區牛奶含有較高水平的游離脂肪酸（辛酸、棕櫚酸、十二酸等），這些游離脂肪酸主要參與脂肪酸的生物合成過程。低、中海拔地區的牛奶具有較高水平的氨基酸(如焦谷氨酸、谷氨酰胺)和微量營養物質(吡哆醇、維生素B6)。不同海拔地區牛奶代謝物濃度不同，通過代謝組學分析出其優勢代謝物并根據成分含量的不同生產適合的牛奶以及乳制品。

1.3.3 營養因素影響

營養因素對牛奶質量起決定性作用，飼養系統的差異顯著影響了牛奶成分。與非放牧制度相比，放牧制度下飼養的奶牛生產的牛奶及奶制品被認為更健康、更天然。玉米秸稈，玉米青貯，新鮮飼料和干草等飼糧改變了牛奶代謝組學特征，牧草飼糧中不飽和脂肪酸水平較高[25]，而玉米青貯中亞油酸含量較高[26]。利用代謝組學技術篩選和分析牛奶代謝物，區分不同飼糧方式對牛奶質量產生的影響。Ashokan 等[27]利用LC-MS/MS 研究發現大多數氨基酸在放牧和非放牧奶牛之間有不同的調節，并且豐度差異很大，放牧奶牛的牛奶氨基酸含量要高。Rocchetti 等[28]基于UHPLC-QTOF-MS 比較了喂食干草，玉米青貯以及混合日糧（新鮮飼糧與干草的混合物）奶牛牛奶的不同代謝組學特征，揭示了酚類代謝物中3,3′,4′,5- 四羥基二苯乙烯、五味子苷等大多來源于飼料，而脂質代謝物中磷脂酰膽堿、甘油三酯、鞘磷脂則來源于動物。不同的飼養方式優勢代謝物顯著不同，放牧飼養相對于非放牧形式更有利于牛奶中氨基酸，脂質等物質的積累，應用代謝組學技術對其代謝物的鑒定更加證明了傳統放牧飼養生產的牛奶營養價值更高，在條件允許的情況下應鼓勵放牧飼養，提高牛奶質量。同時如表1 所示，代謝組學工具優勢明顯，幾種技術相互補充，基本覆蓋了牛奶中不同揮發性、不同極性以及不同樣品量的代謝物的高靈敏檢測，使其成為了分析牛奶中微量成分的重要技術。

表1 代謝組學工具在牛奶中應用的優勢以及局限性Table 1 Advantages and limitations of metabonomics tools in milk

2 代謝組學在牛奶安全中的應用

目前，針對牛奶中的污染物，天然毒素以及新病原體等問題的檢測是代謝組學在評估牛奶安全領域最重要的應用[37]。在牛奶生產、加工、運輸、儲存過程中伴隨著安全問題的出現，可能是天然污染物也可能是人為的化學，物理毒物的污染[38]。同時牛奶的摻假現象時常發生，損害消費者利益，給消費者帶來潛在的健康風險。代謝組學通過對代謝物的分析檢測出牛奶外源物質是否過量，可以有效地識別牛奶的摻假物質。

2.1 代謝組學技術測定藥物殘留對牛奶安全的影響

目前，各種分析方法已用于檢測牛奶的藥物殘留，并且進行了定量分析，包括微生物抑制實驗，酶聯免疫吸附試驗和液相色譜分析等[39]。利用固相萃取、液相色譜分離和紫外檢測對磺胺二甲基嘧啶進行分析，方法定量限為10 μg/kg[40]，該方法可以監測牛奶中最大殘留量，但選擇性不足，無法區分不同類型的藥物。酶聯免疫吸附試驗近年來有了新的進展[41]，與傳統酶聯免疫吸附試驗相比靈敏度更高，檢測黃曲霉毒素M1時定量限為0.003 ng/mL 且能同時檢測三種目標，但免疫篩查方法往往會產生假陽性的結果[42]。而基于LC-MS/MS 的代謝組學技術的靈敏度、準確度和重現性高于以往的分析方法，被應用于檢測牛奶的藥物殘留。Chen 等[43]用LC-MS/MS 檢測牛奶中藥物殘留時，黃曲霉毒素M1的定量限可達到0.002 7 μg/kg，且采用了自動樣品預處理，簡化了操作，減少了人為誤差。Wittenberg等[44]利用LC-MS/MS 檢測40 種獸藥殘留，定量限范圍為0.02～82 ng/g。比起以往的分析方法代謝組學技術更加精確，檢測靈敏度更高，在檢測牛奶藥物殘留領域有很大的發展前景。

2.1.1 影響牛奶安全的抗生素殘留分析檢測

抗生素作為一種具有抗微生物活性的化合物，一直被應用在畜牧業用于治療和預防常見病癥，但是由于不明智使用抗生素治療產奶動物的疾病，如使用抗生素的數量、類型以及方法等都可能導致部分藥物無法通過尿液和糞便排出而殘留體內，并在牛奶及肉類中找到[45]。此外，牛奶中抗生素的另一個來源是一些抗生素被任意用作飼料添加劑。如果這些抗生素殘留超出最大殘留限量會給消費者造成嚴重的健康問題，可能會引發過敏反應甚至是癌癥的發生，所以檢測牛奶中抗生素殘留是必要的?？股赜糜趧游镏委煹闹饕é?內酰胺類、四環素類、氟喹諾酮類、磺胺類以及大環內酯類等[45,46]，這些抗生素種類殘留在牛奶中都可以被代謝組學技術檢測到，具體抗生素名稱如表2 所示。

表2 應用代謝組學技術檢測牛奶抗生素殘留實例Table 2 Application of metabolomics technique in the detection of antibiotic residues in milk

2.1.2 影響牛奶安全的農藥殘留分析檢測

大多數的植物源食品都可能經過農藥處理從而對雜草、昆蟲以及其他害蟲進行控制，但這種方式可能會對人類健康產生間接的風險。研究發現，食草動物未經加工的奶中可能含有農藥殘留[53]，其中牛奶的農藥殘留可能來源于受污染的食物（飼料、草、玉米青貯），被身體系統吸收、累計，導致牛奶中的微量農藥達到毒性水平，影響消費者的慢性健康問題[54]。代謝組學技術檢測范圍廣泛，可以對牛奶中多種農藥殘留進行檢測，具體檢測農藥名稱見表3。

表3 應用代謝組學技術檢測牛奶農藥殘留實例Table 3 Application of metabolomics technique in the detection of pesticide residues in milk

2.2 代謝組學技術測定牛奶安全的摻假分析

2.2.1 牛奶中豆漿的摻假行為

牛奶在世界范圍內生產并用于乳制品生產的原料占85%。部分生產者為了謀取更大的利益常常會將豆漿作為摻假劑放入牛奶中。豆漿價格便宜，且蛋白質的成分與牛奶相似，作為摻假劑放入牛奶中口感也不會受到影響。但是豆漿所含成分與牛奶有所差異，比如豆漿中含有大量的D-蔗糖，而在牛奶中并沒有檢測到，Li 等[57]建立了一種利用NMR檢測高價值牛奶摻假的方法，通過NMR 對代謝物標記進行鑒定，其中N-乙酰碳水化合物，乙酸酯，肉堿，檸檬酸，肌酸和卵磷脂可作為區分牛奶與豆奶的主要指標，并且定量確定了牛乳中豆奶的摻假定量限為2%（V/V）。欺騙者為了利益最大化且摻假不被常規方法檢測出來，通常將2%～10%（V/V）的廉價牛奶放入高價值牛奶中，這正在NMR 的有效檢測范圍之內，牛奶摻假行為通過此方法得以檢測，并且可將其應用到乳制品的質量監測中。

2.2.2 不同品種牛奶的摻假行為

添加較低價值的牛奶品種也是常見的乳制品欺詐行為，比如羊奶、牛奶和水牛奶這三種常見的牛奶在全球人類飲食中扮演著重要角色。由于生產和飼養條件等各種綜合因素，牛奶的價格要低于水牛奶和羊奶，為了獲取高額利潤，利用不同品種牛奶價格差異造成乳品摻假的潛在行為。雖然牛奶品種不同，但具有相似的感官特性，外觀和化學成分[58]。UHPLC-MS/MS 可以解決此類問題。Jia 等[59]研究中發現壬酸、癸酸和辛酸是羊奶的標志物，β-胡蘿卜素是牛奶的標志物，麥角鈣化醇是水牛奶的標志物。表明羊奶、牛奶和水牛奶各有獨特的代謝物存在，根據標記的代謝物，我們可以對乳制品進行鑒定，以此來打擊替代欺詐行為，此方法有可能成為乳制品行業中可靠且強大的欺詐分析工具。

3 總結

代謝組學作為一種檢測小分子的新興學科，在牛奶及乳制品行業顯示出了良好的應用前景。本文綜述了代謝組學在牛奶質量及安全研究中的主要應用，與其他檢測技術相比，代謝組學檢測范圍多元化，對牛奶中不同揮發性、不同極性以及不同樣品量的代謝物均可檢測，實現了對牛奶品質、藥物殘留以及摻假問題的多樣監測，基于其高靈敏度、高選擇性、重現性好和高準確度使其成為分析牛奶品質的主要手段之一。目前，代謝組學技術不僅用于檢測奶牛品種、地理環境、飼糧條件、加工方式等不同因素引起的牛奶代謝物差異對牛奶質量的影響，還可以絕對定量牛奶中不同藥物殘留，并通過相對定量分析識別牛奶摻假問題。從而全方位保障牛奶的質量與安全。

4 展望

代謝組學已被證明是一種可應用在鑒定牛奶質量與安全的有力工具。然而，由于代謝組學所用的儀器設備體積較大，價格昂貴，而且一般分析所需時間相對較長，使其在牛奶品質鑒別方面受到較大的限制。未來開發更多微型化、便攜式儀器用于分析代謝物有望大大拓展代謝組學技術的應用。同時代謝產物信息庫的不完善也限制了其發展。需要收集大量數據，開發強大的軟件工具來完善代謝組學信息庫。在未來，代謝組學技術的不斷發展結合更新的數據庫以及更多的統計軟件，有望發現牛奶中更多與奶牛健康和疾病相關的生物標志物，有助于反映出奶牛的生理或病理狀態，以及實時監測牛奶在加工貯藏等過程中代謝物的變化，為保障牛奶及乳制品質量與安全提供更多的技術支撐。