酸棗仁皂苷A對抑郁小鼠行為及突觸可塑性相關蛋白的作用

李會濤，李劍男，張桐，貢濟宇

（長春中醫藥大學藥學院，吉林長春 130117）

抑郁癥是一類以顯著而持久的心情低落為主要臨床特征的心境障礙，多伴有不同程度的認知或行為改變，重度抑郁癥患者甚至出現自殘、自殺現象，嚴重影響患者的工作和生活[1]。據不完全統計，目前全球約有3.5 億抑郁癥患者，且抑郁癥的發病率逐年升高[2]?！度嗣袢請蟆钒l布的《2022 年中國抑郁癥藍皮書》顯示我國抑郁癥患者總數的30%為18 歲以下青少年，其中50%的抑郁癥患者為在校學生，教育部已明確規定將抑郁癥納入學生健康體檢內容中。抑郁癥的主要臨床表現包括注意力不集中、思維遲鈍、學習記憶能力下降、精神情感障礙，甚至產生飲食睡眠障礙、行動能力受損、自殘自殺傾向等[3]。WHO 預計到2030 年抑郁癥將成為威脅人類健康的主要疾病之一[4]。

目前學術界討論的抑郁癥發病機制主要包括神經遞質假說、神經突觸可塑性假說等。神經活動的基本方式是信號傳導，神經信號傳導依賴突觸的相互連接。神經突觸可塑性是指細胞突觸的數量、形態結構、連接強度等在神經活動中具有可調節性，其對神經系統功能發揮和損傷修復，特別是對應激反應中腦內神經細胞適應外界刺激至關重要。研究發現，抑郁癥的發生可能與神經突觸可塑性變化相關，如抑郁癥患者內側前額葉皮質和海馬的錐體神經元體積縮小或丟失；抑郁動物模型出現神經元萎縮、突觸數量減少、內側前額葉皮質及海馬區神經突觸的長度和分支數量降低等[5]。表明神經突觸可塑性可能是抑郁癥發生發展和臨床治療的重要影響因素之一，應用藥物干預等提高神經突觸可塑性，對于抑郁癥治療藥物和治療策略的開發具有重要意義。

中藥治療情志類疾病具有靶點多、副作用小等優勢，在抑郁癥及其伴發癥的治療方面具有廣闊的應用前景。酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubaMill. Var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou）的干燥成熟種子，是一味常用的藥食兩用的中藥材，具有養心補肝，寧心安神之功效，臨床常用于治療虛煩不眠、焦慮、抑郁等[6,7]?，F代研究表明，酸棗仁含有三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類以及脂肪酸類等多種活性成分，具有鎮靜催眠、抗焦慮抑郁，以及抗心律失常、抗炎等多種藥理作用[8]。酸棗仁皂苷是酸棗仁的主要活性成分之一，其含量高，結構復雜，藥理作用廣泛，結構主要屬于達瑪烷型三萜皂苷[9]。目前，對酸棗仁皂苷類成分的研究較為深入，已從中鑒定出包括酸棗仁皂苷A（JuA）、酸棗仁皂苷B（Jujuboside B）等在內的十余種單體皂苷[10,11]。JuA（C58H94O26，結構式如圖1 所示）是酸棗仁皂苷中發現較早研究較為深入的單體成分之一。學術界對酸棗仁藥理作用的研究多集中在復方及其活性部位，如酸棗仁湯、酸棗仁合歡湯，酸棗仁總皂苷、總黃酮、總生物堿等，有關單體成分JuA 的抗抑郁作用及機制研究尚不充分。本文通過慢性皮下注射皮質酮（Corticosterone，CORT）建立抑郁小鼠模型，同時灌胃給予JuA 溶液進行干預，利用行為學實驗考察JuA 對抑郁模型小鼠的抗抑郁作用，并探究JuA 對神經突觸可塑性相關蛋白BDNF、TrkB、CREB、PSD95、Beclin1 表達的影響，進而豐富酸棗仁在抑郁癥治療中的理論依據。

圖1 酸棗仁皂苷A 的結構式Fig.1 The structural formula of Jujuboside A

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

JuA（純度≥97%，批號：Z18M11X113209）、CORT（純度≥98%，批號：J24J11E116591）購于上海源葉生物科技有限公司；鹽酸氟西?。ㄅ枺篜V1015CCNP），禮來蘇州制藥有限公司。

1.1.2 動物

雄性C57BL/6 小鼠，體質量18～22 g，購于長春市億斯實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（吉）-2020-0002。室溫（22±2） ℃，濕度55%±10%，自然采光，給予充足食水，適應性飼養1 周后隨機分組進行實驗。本實驗經長春中醫藥大學倫理委員會批準，批準號：2022657，動物實驗操作符合“4R”原則及動物實驗相關規定。

1.1.3 試劑

漿蛋白提取試劑盒（批號：20201109），北京索萊寶科技有限公司；兔源BDNF（批號：28205-1-AP）、TrkB（批號：13129-1-AP）、CREB 單克隆抗體（批號：12208-1-AP），均購于武漢三鷹生物技術有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：090120201214）、兔源PSD95 單克隆抗體（批號：AF1096）、兔源Beclin1 多克隆抗體（批號：AF5123）、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（批號：A0208）、SDSPAGE 凝膠快速配制試劑盒（批號：052920201229）、超敏ECL 化學發光試劑盒（批號：082020201230），均購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.4 儀器

OFT-100 小鼠開場活動實驗視頻分析系統、MT-200 Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統，成都泰盟科技有限公司；萬分之一天平，梅特勒托利多儀器有限公司；臺式高速低溫離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；酶標儀、Mini-PROTEAN 垂直電泳槽、Trans-Blot 轉印槽，美國BIO-RAD 公司；化學發光凝膠成像儀，美國Aplegrn 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模給藥

小鼠適應性飼養7 d 后隨機分成對照組、模型組、JuA 低劑量組（10 mg/kg）、JuA 高劑量組（30 mg/kg）、陽性藥組（鹽酸氟西汀20 mg/kg），每組8 只。實驗期間，除對照組外其余各組小鼠連續28 d 皮下注射CORT（40 mg/kg）溶液致慢性抑郁。同時，JuA 低、高劑量組分別灌胃給予對應濃度的JuA 溶液，陽性藥組給予鹽酸氟西汀溶液，對照組、模型組給予等劑量生理鹽水。

1.2.2 懸尾實驗

將小鼠從距尾尖1 cm 處用透明膠帶固定倒懸，頭部距地面約20 cm，四周用擋板圍定與周圍環境隔離并保持安靜。每只小鼠觀察5 min，記錄后4 min 內小鼠放棄掙扎，身體垂懸不扭動的時間，即靜止時間。

1.2.3 強迫游泳實驗

將小鼠放入高30 cm，直徑15 cm 的透明圓柱形水桶中游泳5 min，桶內事先注入深約20 cm，溫度（23±2） ℃的清水。記錄小鼠后4 min 內四肢不劃水，靜止漂浮于水面的時間，即靜止時間。

1.2.4 曠場實驗

將小鼠放于底部長50 cm，寬50 cm 的敞口箱的中央區域，視頻分析系統自動記錄5 min 內小鼠的活動軌跡和數據。實驗時保持環境安靜，兩只小鼠實驗之間用體積分數75%酒精擦拭箱底，清除排泄物及氣味以免干擾實驗結果。

1.2.5 Morris水迷宮實驗

水迷宮為直徑150 cm，高50 cm 的圓形水池，分為四個象限，水下逃逸平臺隨機設置在其中一個象限。實驗時向水池內注入溫度為（23±2） ℃的清水（用適量二氧化鈦粉末染成奶白色）至沒過逃逸平臺1 cm 左右，水池正上方為視頻采集裝置。造模給藥28 d 后將各組小鼠依次在4 個象限內頭朝池壁放入水池中，記錄小鼠在90 s 內找到水下逃逸平臺所用時間，記為潛伏期，并讓小鼠在平臺上停留10 s；若90 s 內小鼠未找到水下逃逸平臺則人為引導小鼠至平臺停留10 s，并記錄潛伏期為90 s。每天訓練2 次，連續訓練4 d，使小鼠對平臺位置形成空間記憶。訓練結束后，進行空間探索實驗，即撤掉水下逃逸平臺，依次將小鼠從原平臺所在象限的對側象限頭朝池壁放入水池，記錄90 s 內小鼠第一次穿越原平臺所在位置的時間（潛伏期），以及穿越原平臺位置的次數和穿越目標象限的次數。

1.2.6 免疫組化實驗

水迷宮實驗結束2 h 后處死小鼠，每組隨機取4 只于冰上取海馬組織并用質量分數為4%的多聚甲醛灌注固定。石蠟切片經脫蠟水化、封閉、抗原修復后用BDNF 抗體稀釋液孵育，4 ℃環境下孵育過夜后加入二抗，37 ℃孵育1 h。再經DBA 顯色、蘇木素染色、脫水、封片后在顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算BDNF 表達的平均光密度。

1.2.7 Western blot實驗

小鼠處死后于冰上迅速取海馬組織，凍存于負80 ℃超低溫冰箱中備用。取凍存的小鼠海馬組織，加入適量含質量分數1% PMSF 的漿蛋白提取試劑，冰浴環境下勻漿，離心取上清。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白后按1:4 加入上樣緩沖液，煮沸10 min 即得蛋白樣本。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，經上樣、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、化學發光成像等步驟分析目的蛋白表達情況。

1.3 數據分析

采用GraphPad Prism 5 統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析 （One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 JuA對抑郁模型小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中靜止時間的影響

與對照組相比，模型組小鼠靜止時間顯著增加（P＜0.001）。與模型組相比，JuA 低、高劑量組及陽性藥組小鼠靜止時間顯著減少（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），結果見表1。造模劑CORT 是一種由腎上腺皮質分泌的甾體類激素，其對海馬神經元的發育、分化及生理功能的發揮有著直接影響。在應激或衰老等情況下，血漿皮質酮水平升高，可導致海馬組織形態異?；蚬δ苁軗p。研究表明，長期皮下注射CORT 是一個可靠的制備慢性應激抑郁動物模型的方法[12,13]。懸尾實驗和強迫游泳實驗是經典的動物行為學實驗，兩項實驗中的靜止時間長短可反映模型動物的抑郁狀態，靜止時間越短表明其抑郁程度越輕[14]。本實驗中，模型組小鼠較對照組小鼠靜止時間顯著增加，表明利用CORT 長期注射成功制備了抑郁小鼠模型，同時，JuA 低、高劑量組小鼠靜止時間均顯著減少表明JuA 顯著改善了模型小鼠的抑郁狀態。

表1 JuA對抑郁模型小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中靜止時間的影響Table 1 Effects of JuA on immobility time in TST and FST of depression model mice (n=8, )

表1 JuA對抑郁模型小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中靜止時間的影響Table 1 Effects of JuA on immobility time in TST and FST of depression model mice (n=8, )

注：與對照組相比，***P＜0.001 ；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。下表同。

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2.2 JuA對抑郁模型小鼠曠場實驗中行為的影響

與對照組相比，模型組小鼠的靜止時間顯著增加，運動總距離和中央區域運動時間顯著減少（P＜0.001）。與模型組相比，JuA 低、高劑量組及陽性藥組小鼠靜止時間顯著減少，運動總距離和中央區域運動時間顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），結果見圖2、表2。曠場實驗主要考察小鼠的自主活動情況，進而反映其抑郁狀態，單位時間內小鼠的靜止時間越短、運動總距離越長、中央區域運動時間越長代表小鼠的抑郁程度越輕[15]。在本實驗中，JuA 顯著縮短了模型小鼠的靜止時間，增加了其運動總距離和中央區域運動時間，表明JuA 顯著改善了CORT 誘導的模型小鼠的抑郁狀態。

表2 JuA對抑郁模型小鼠曠場實驗中行為的影響Table 2 Effects of JuA on behavior in OFT of depression model mice (n=8, )

表2 JuA對抑郁模型小鼠曠場實驗中行為的影響Table 2 Effects of JuA on behavior in OFT of depression model mice (n=8, )

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圖2 小鼠曠場實驗熱圖Fig.2 Thermal imaging of mice trajectory in OFT

2.3 JuA對抑郁模型小鼠Morris水迷宮實驗中行為的影響

與對照組相比，模型組小鼠潛伏期顯著延長，運動速度、穿越平臺次數、穿越目標象限次數顯著減少（P＜0.001）。與模型組相比，除JuA 低劑量組小鼠穿越平臺次數差異無統計學意義外，JuA 低、高劑量組及陽性藥組小鼠潛伏期顯著縮短，運動速度、穿越平臺次數、穿越目標象限次數顯著增加（P＜0.05或P＜0.01 或P＜0.001），結果見圖3、表3。

表3 JuA對抑郁模型小鼠Morris水迷宮實驗中行為的影響Table 3 Effects of JuA on behavior in MWM of depression model mice (n=8, )

表3 JuA對抑郁模型小鼠Morris水迷宮實驗中行為的影響Table 3 Effects of JuA on behavior in MWM of depression model mice (n=8, )

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圖3 小鼠Morris 水迷宮實驗運動軌跡圖Fig.3 Movement trajectory of mice in MWM

抑郁癥常伴隨學習和記憶功能障礙，通過考察模型小鼠的學習和記憶能力也能反映其抑郁狀態。Morris 水迷宮實驗通過反復訓練使小鼠形成獲得性記憶，然后撤去逃逸平臺后通過考察其潛伏期（第一次穿過原平臺位置的時間）、穿越原平臺位置次數、穿越目標象限次數等反映各組小鼠的空間記憶能力，進而間接反映其抑郁狀態。小鼠模型潛伏期越短、單位時間內穿越平臺和目標象限的次數越多，則其學習記憶能力越好，抑郁程度越輕[16]。本實驗中，JuA 顯著縮短模型小鼠的潛伏期，并顯著增加其穿越原平臺位置和目標象限的次數，即Morris 水迷宮實驗結果表明JuA 顯著改善了CORT 誘導的模型小鼠的抑郁狀態。

2.4 JuA對抑郁模型小鼠海馬組織BDNF蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組小鼠海馬組織BDNF蛋白表達水平顯著下降（P＜0.001）。與模型組相比，JuA 低、高劑量組及陽性藥組小鼠海馬組織BDNF 表達水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），其中JuA 高劑量組的BDNF 上調最為顯著（上調了190.23%），結果見圖4。神經突觸是神經元之間相互連接的“中介”，是神經信號傳導的物質基礎。神經突觸可塑性是指突觸的形態結構可隨神經元的活動而發生改變，其被認為是信號傳導、學習認知、記憶形成等的必要條件[17]。研究發現，腦源性神經營養因子（BDNF）是一種具有神經營養作用的分泌型堿性蛋白，其主要在中樞神經系統內表達，具有營養神經，促進神經發生和神經細胞存活、分化，增加突觸可塑性等作用[18]。學術界對BDNF 與抑郁癥之間的聯系研究較為深入，通過考察腦卒中后抑郁動物模型、產后抑郁模型、慢性不可預知溫和刺激模型等發現，抑郁模型血清或海馬組織中BDNF 水平均有不同程度下降，抗抑郁藥物干預后BDNF 水平顯著上升[19-21]。本實驗結果表明，JuA 顯著提高了模型小鼠海馬組織中BDNF 的表達水平，結合行為學實驗結果提示JuA 具有較為顯著的抗抑郁作用。

圖4 JuA 對抑郁模型小鼠海馬組織BDNF 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of JuA on BDNF protein expression in hippocampus of depression model mice (IHC, ×200)

2.5 JuA對抑郁模型小鼠海馬組織TrkB、CREB、PSD95、Beclin1蛋白表達影響

與對照組相比，模型組小鼠海馬組織TrkB、CREB、PSD95、Beclin1 蛋白表達水平顯著下降（P＜0.001）。與模型組相比，JuA 低、高劑量組及陽性藥組小鼠海馬組織TrkB、CREB 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），其中JuA 高劑量組TrkB、CREB 蛋白表達水平分別上調137.24%、76.29% ；此外，JuA 高劑量組小鼠海馬組織PSD95、Beclin1 表達水平顯著升高，分別上調了169.32%、82.53%（P＜0.01 或P＜0.001）；JuA 低劑量組及陽性藥組小鼠海馬組織PSD95、Beclin1 蛋白表達水平差異無統計學意義，結果見圖5。

圖5 JuA 對抑郁模型小鼠海馬組織TrkB、CREB、PSD95、Beclin1 蛋白表達的影響Fig.5 Effects of JuA on TrkB, CREB, PSD95, Beclin1 protein expression in hippocampus of depression model mice (n=8, )

現有研究發現，酪氨酸激酶受體B（TrkB）是BDNF 的特異性受體，二者結合后在神經細胞生存、突觸生長分化、突觸可塑性等方面發揮重要作用[22]。環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）是核轉錄因子家族中的一員，具有促進神經細胞存活、分化及突觸發生的作用，BDNF 通過誘導CREB 的表達發揮神經保護作用，對于維持神經突觸可塑性具有重要意義[23]。突觸后致密蛋白95（PSD95）是突觸后膜上重要的支架蛋白，具有維持突觸連接狀態、集中信號、參與受體信號傳導、調節突觸可塑性等重要作用，是中樞神經系統突觸可塑性的標志蛋白之一[24]。此外，研究表明神經自噬與突觸可塑性密切相關，提高腦內自噬水平有助于清除神經細胞內受損的細胞器或未成功折疊的蛋白分子，有利于突觸后特定蛋白的更新，增加突觸可塑性。自噬關鍵調控蛋白Beclin1 是哺乳動物體內首個被發現的調控自噬的標志性蛋白，通過誘導自噬促進細胞代謝和穩態，進而維持神經突觸可塑性[25,26]。本實驗中，模型組小鼠在行為學實驗中表現出明顯的抑郁狀態，且其海馬組織BDNF、TrkB、CREB、PSD95及Beclin1 蛋白表達水平較對照組顯著下降，灌胃給予高濃度JuA溶液干預的小鼠抑郁狀態顯著改善，且上述蛋白的表達水平均顯著升高，表明CORT 顯著影響了模型小鼠的突觸可塑性相關蛋白的正常表達，JuA 可能通過回調上述神經突觸可塑性相關蛋白的表達改善模型小鼠的抑郁狀態。有趣的是，在本實驗中陽性藥物鹽酸氟西汀雖然對抑郁模型小鼠的抑郁狀態有明顯改善，但其對PSD95、Beclin1 蛋白表達的促進作用無統計學意義（P＞0.05），這可能與鹽酸氟西汀主要通過抑制神經突觸間隙5-HT 的再攝取而起到抗抑郁作用相關[27]。本實驗通過檢測突觸可塑性相關蛋白的表達，間接反映JuA 對模型小鼠神經突觸可塑性的可能影響，初步探究了JuA 與突觸可塑性相關的抗抑郁機制。

3 結論

本文通過行為學實驗研究發現JuA 能顯著改善CORT 誘導的抑郁模型小鼠的抑郁狀態，并顯著提高神經突觸可塑性相關蛋白的表達水平。綜上所述，JuA 對抑郁模型小鼠具有顯著的抗抑郁作用，其作用機制可能與上調BDNF、TrkB、CREB、PSD95及Beclin1 等突觸可塑性相關蛋白的表達，進而提高神經突觸可塑性有關。本實驗為酸棗仁在抑郁癥治療方面的進一步開發利用提供了一定的理論依據。