腎小管HIF-1α/miR-23a通路在膿毒血癥急性腎損傷中的作用機制

陳思宇 強立娟 朱嘉興 馬世蘭 陳占龍

膿毒血癥是指由感染引起的全身炎性反應綜合征,其發病率很高,可由任何部位的感染引起,能夠導致機體多個器官功能障礙,引起患者死亡[1]。膿毒血癥急性腎損傷(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)是膿毒血癥最常見的并發癥之一,SA-AKI以腎臟排泄功能迅速喪失為主要特征,可嚴重影響膿毒血癥患者預后并增加患者病死率[2]。目前,筆者發現臨床上尚缺乏有效預防和治療SA-AKI的干預措施,因此,探索SA-AKI具體致病機制,明確SA-AKI的重要調節因子,對提高膿毒血癥治療效果、防治SA-AKI具有重要意義。腎小管上皮細胞損傷是SA-AKI的典型病理特征,研究發現,膿毒血癥病理生理情況下,缺氧是引起腎小管上皮損傷的重要致病因素[3]。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)是機體適應缺氧環境機制中的最主要因素,也是膿毒血癥引起多器官功能損傷的主要原因之一[4]。在缺氧性腎損傷中,HIF-1α主要表達于腎小管上皮細胞,HIF-1α調控的下游通路在調節能量代謝、線粒體功能、細胞凋亡等多種生理病理過程中發揮重要作用[5]。在SA-AKI的進程中,HIF-1α可以通過調節能量代謝、促進血管再生、降低細胞耗氧來調節腎損傷[6]。但目前筆者發現其在SA-AKI中的詳細機制尚未闡明。MicroRNA(miRNA)是一種內源性非編碼小RNA,通過調節靶基因表達參與氧化應激、炎性反應、細胞凋亡等過程。近年來一些研究提示miRNA在調節腎臟損傷和修復等方面發揮至關重要的作用[7-8]。研究表明,miR-23a可通過多種途徑調節膿毒血癥損傷期間的炎性反應和細胞凋亡[9-10]。作為一種調節氧穩態的核轉錄因子,HIF-1α已被證實可以直接調控多種miRNA的表達[11]。然而,SA-AKI病理生理過程中HIF-1α和miR-23a的作用機制及相互關系尚不完全清楚。因此,本研究體外培養腎小管上皮細胞,探討腎小管上皮細胞中HIF-1α表達對miR-23a的調控作用,并分析二者參與SA-AKI發生、發展的作用機制,以期為臨床防治SA-AKI提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞:人近曲小管上皮細胞(HK-2細胞)購自中國上?？茖W院細胞庫。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F12培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(規格:10 mg)購自上海吉至生化科技公司;HIF-1α小干擾RNA序列(HIF-1α siRNA)及其陰性對照序列(NC siRNA)、miR-23a模擬物(miR-23a mimic)及其陰性對照(miR-NC)、miR-23a抑制劑(anti-miR-23a)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自上海吉瑪公司;Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司;TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒均購自上海愛必信生物科技公司;白細胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛公司;HIF-1α、核轉錄因子-κB-p65(nuclear factorκB-p65,NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB-p65(p-NF-κB-p65)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)、GAPDH一抗、過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自英國abcam公司。

1.1.3 主要儀器:HeracellTM240iTM二氧化碳恒溫培養箱、MultiskanTMFC多功能酶標儀、Attune NxT流式細胞儀購自美國Thermo Fisher公司;DYY-4C電泳儀購自南京普陽科學儀器研究所;LEIA-X4熒光定量PCR儀購自濟南愛來寶儀器設備公司;iBright凝膠成像系統購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:HK-2細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養基培養,置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的細胞培養箱中培養。取對數生長期的HK-2細胞進行后續實驗。

1.2.2 SA-AKI細胞模型構建:參考文獻[12]方法,將對數生長期的HK-2細胞按照1×105個/mL細胞密度接種于24孔培養板,每孔100 μL,常規培養待細胞密度達到約80%后,加入含5 μg/mL LPS的培養液培養24 h。

1.2.3 細胞分組與轉染:LPS處理的HK-2細胞分為LPS組(不進行轉染處理)、NC siRNA 組(轉染NC siRNA)、HIF-1α siRNA組(轉染HIF-1α siRNA)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-23a組(轉染anti-miR-23a)、HIF-1α siRNA+miR-NC組(轉染HIF-1α siRNA和miR-NC)、HIF-1α siRNA+miR-23a組(轉染HIF-1α siRNA和miR-23a mimic),以正常培養、未經任何處理的HK-2細胞作為空白對照組(Control組)。轉染過程嚴格按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行,轉染后6 h更換培養液,隨后繼續培養48 h,檢測轉染效率。

1.2.4 qRT-PCR實驗:使用TRIzol試劑提取HK-2細胞中總RNA樣本,確定RNA濃度后,通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA,將合成的cDNA使用qRT-PCR試劑盒進行定量擴增。引物序列:HIF-1α正向引物序列:5’-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3’,反向引物序列:5’-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’;GAPDH正向引物序列:5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’,反向引物序列:5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’;miR-23a正向引物序列:5’-CAGAGCAAGGGAACAGTAAGTGTGT-3’,反向引物序列:5’-GGAGGTCACTTCCGATCCA-3’;U6正向引物序列:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物序列:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應條件為:95℃ 2 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,進行40個循環。使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.5 細胞活力測定:采用CCK-8法檢測。將HK-2細胞以2×105個/孔的密度接種到96孔板上,孵育24 h后,將體積為10 μL的CCK-8溶液添加至每個孔中,37℃繼續孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm波長下每個孔的光密度值(OD值)。

1.2.6 細胞凋亡檢測:采用流式細胞術檢測。4組HK-2細胞調以1×106mL/孔接種于24孔板,常規培養24 h,加入預冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌,用100 μL結合緩沖液重懸細胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC溶液和10 μL PI溶液,震蕩混勻后,室溫避光孵育15 min,加入400 μL結合緩沖液稀釋細胞,于1 h內在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 細胞中炎性因子水平檢測:收集4組HK-2細胞培養液,離心留取上清液,采用ELISA法檢測細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α含量實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 Western blot法:使用RIPA裂解緩沖液從HK-2細胞中提取總蛋白,BCA蛋白檢測試劑盒用于評估蛋白質樣品含量。取等量蛋白質樣品上樣,通過10 % SDS-PAGE分離,將目標蛋白轉移到PVDF膜上,轉染蛋白的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h,清洗PVDF膜,與稀釋的一抗在4℃共同孵育過夜,一抗包括HIF-1α(1∶800)、NF-κB-p65(1∶1 000)、p-NF-κB-p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。洗膜,與二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h。洗膜,滴加增強的化學發光試劑,在凝膠成像系統中對蛋白條帶進行可視化,以GAPDH作為內部對照,利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 HK-2細胞中HIF-1α表達水平比較 與Control組比較,LPS組HK-2細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,NC siRNA 組HK-2細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA組HK-2細胞中HIF-1α蛋白和mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 HK-2細胞中HIF-1α表達

表1 HK-2細胞中HIF-1α表達水平比較

2.2 HK-2細胞中miR-23a表達水平比較 與Control組比較,LPS組HK-2細胞中miR-23a mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,anti-miR-NC組HK-2細胞中miR-23a mRNA表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05),anti-miR-23a組HK-2細胞中miR-23a mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與HIF-1α siRNA組比較,HIF-1α siRNA+miR-NC組HK-2細胞中miR-23a mRNA表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA+miR-23a組HK-2細胞中miR-23a mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 HK-2細胞中miR-23a表達水平比較

2.3 抑制HIF-1α表達對HK-2細胞活力、細胞凋亡和細胞中炎性因子水平的影響 與Control組比較,LPS組HK-2細胞活力顯著降低,細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,NC siRNA 組HK-2細胞活力、細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平變化差異均無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA組HK-2細胞活力顯著升高,細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 抑制HIF-1α表達對HK-2細胞凋亡的影響

表3 抑制HIF-1α表達對HK-2細胞活力、細胞凋亡和細胞中炎性因子水平的影響

2.4 抑制HIF-1α表達對HK-2細胞中miR-23a表達的影響 與Control組比較,LPS組HK-2細胞中的miR-23a mRNA表達水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組比較,NC siRNA 組HK-2細胞中的miR-23a mRNA表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA組HK-2細胞中的miR-23a mRNA表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 抑制HIF-1α表達對HK-2細胞中miR-23a表達的影響

2.5 抑制miR-23a表達對HK-2細胞活力、細胞凋亡率和細胞中炎性因子水平的影響 與Control組比較,LPS組HK-2細胞活力顯著降低,細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,anti-miR-NC組HK-2細胞活力、細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平變化差異均無統計學意義(P>0.05),anti-miR-23a組HK-2細胞活力顯著升高,細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表5,圖3。

圖3 抑制miR-23a表達對HK-2細胞中miR-23a表達的影響

表5 抑制miR-23a表達對HK-2細胞活力、細胞凋亡和細胞中炎性因子水平的影響

2.6 抑制HIF-1α表達并過表達miR-23a對HK-2細胞活力、細胞凋亡率和細胞中炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平的影響 與HIF-1α siRNA組比較,HIF-1α siRNA+miR-NC組的HK-2細胞活力、細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平變化差異均無統計學意義(P>0.05);HIF-1α siRNA+miR-23a組的HK-2細胞活力顯著降低,細胞凋亡率、細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 抑制HIF-1α表達并過表達miR-23a對HK-2細胞凋亡的影響

表6 抑制HIF-1α表達并過表達miR-23a對HK-2細胞活力、細胞凋亡和細胞中炎性因子水平的影響

2.7 8組HK-2細胞NF-κB信號通路蛋白表達水平比較 與Control組比較,LPS組HK-2細胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,NC siRNA 組和anti-miR-NC組HK-2細胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值變化差異均無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA組和anti-miR-23a組HK-2細胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均顯著降低(P<0.05);與HIF-1α siRNA組比較,HIF-1α siRNA+miR-NC組HK-2細胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值變化差異均無統計學意義(P>0.05),HIF-1α siRNA+miR-23a組HK-2細胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5,表7。

圖5 8組HK-2細胞NF-κB信號通路蛋白表達水平比較

表7 8組HK-2細胞NF-κB信號通路蛋白表達水平比較

3 討論

HIF-1α是一種氧調節蛋白,是調節細胞代謝以響應缺氧變化的關鍵調節因子,在炎癥性疾病的發生、進展中發揮作用。當炎癥性疾病發生時,炎癥導致局部新陳代謝加快,對氧氣的需求增加;另一方面,由于血管收縮和血栓形成,組織從血流中獲得的氧氣受到限制,最終導致炎性缺氧,促使HIF-1α表達變化,HIF-1α在一系列生理和病理過程中起著至關重要的作用[13-14]。越來越多的證據表明,HIF-1α參與AKI的調節。Bondi等[15]研究報道,HIF-1α通過調控核因子紅細胞-2相關因子2(NRF2)活性參與缺血性AKI后纖維化。Fu等[16]報道,腎小管細胞中HIF-1α-Bcl-2/腺病毒E1B-19k相關蛋白3(BNIP3)介導的線粒體自噬通過抑制AKI中細胞凋亡和活性氧產生發揮保護作用。本研究旨在探討HIF-1α在SA-AKI中的作用和潛在機制。研究結果顯示,HIF-1α在LPS誘導的HK-2細胞中表達顯著上調,抑制HIF-1α表達可增強LPS誘導的HK-2細胞活力,抑制細胞凋亡。此外,HIF-1α的抑制通過降低IL-6、IL-1β和TNF-α炎性細胞因子水平改善LPS誘導的炎性反應。表明HIF-1α可能在SA-AKI進展中發揮促進作用。

miR-23a是miR-23家族的成員。最近研究表明,miR-23家族在炎性反應和腎臟損傷的發展中發揮關鍵作用[17]。先前的一項研究報道,miR-23a對高葡萄糖誘導腎小管上皮-間充質轉化和體外腎纖維化的進展有顯著影響[18]。本研究表明,LPS誘導的HK-2細胞中miR-23a表達水平顯著升高,抑制miR-23a表達后,LPS誘導的HK-2細胞活力升高,細胞凋亡率以及細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低。該結果提示miR-23a可能參與SA-AKI發生、發展。此外,本研究結果顯示,抑制HIF-1α表達可降低LPS誘導的HK-2細胞中miR-23a水平,同時,miR-23a過表達逆轉了抑制HIF-1α表達對LPS誘導的HK-2細胞活力、細胞凋亡以及IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子水平的調控作用。上述結果表明HIF-1α可能通過調控miR-23a表達在SA-AKI中發揮作用。既往研究表明,HIF-1α參與AKI中多種功能性miRNA的調節[19],并且HIF-1α水平受特定miRNA的調節。本研究結果證實,在SA-AKI中,HIF-1α可能通過調控miR-23a表達發揮作用。HIF-1α/miR-23a途徑可能是SA-AKI的有效干預靶點。

NF-κB是一種特征性促炎轉錄因子,NF-κB信號通路在炎癥和免疫反應中發揮關鍵作用。大量研究表明,NF-κB信號通路參與調節LPS誘導的腎損傷炎性反應的基因表達和膿毒血癥的病理生理過程[20-22]。NF-κB的激活受IκB激酶(IKKs)和抑制蛋白IκB調控,可被LPS、促炎細胞因子等多種刺激激活。在膿毒血癥小鼠的腎臟組織中,通過檢測NF-κB-p65易位和相關蛋白的磷酸化程度,可以觀察到NF-κB信號的激活[23]。近年來有證據顯示,AKI中HIF-1α可以調節NF-κB信號通路,同時NF-κB參與了AKI中HIF-1α表達的增加[24-25]。但SA-AKI中HIF-1α調控NF-κB信號通路激活的具體機制尚未完全闡明。Fan等[26]報道,miR-23a可能通過活化NF-κB信號通路參與細胞生物學過程。Xu等[27]報道,miR-23a-3p通過靶向膿毒血癥中的NF-κB信號傳導來改善AKI。本研究結果顯示,LPS誘導的HK-2細胞中NF-κB-p65和IκBα磷酸化水平升高,抑制HIF-1α和miR-23a表達均明顯降低LPS誘導的HK-2細胞中NF-κB-p65和IκBα磷酸化水平;此外,miR-23a過表達減弱了抑制HIF-1α表達降低LPS誘導的HK-2細胞中NF-κB-p65和IκBα磷酸化水平的作用。該結果表明,腎小管HIF-1α可能通過調控miR-23a表達,進而調節NF-κB信號通路活化,促進SA-AKI的發生。

綜上所述,抑制腎小管HIF-1α表達能夠增強LPS誘導的腎小管上皮細胞活力、抑制細胞凋亡和細胞中炎性反應,其作用機制可能與抑制miR-23a表達,從而抑制NF-κB信號通路激活有關。本研究結果證實,HIF-1α和miR-23a參與SA-AKI發生、發展,HIF-1α/miR-23a途徑可能是SA-AKI的潛在治療靶點。但本研究僅從體外細胞層面開展了實驗探索,后期仍需在動物實驗中進一步驗證。