lncRNA KCNQ1OT1靶向調控miR-132-5p對帕金森病細胞損傷的保護機制

付琨燕 劉慧斌 蘇男 李斯琴

帕金森病是一種黑質多巴胺隨年齡增長而呈退行性變的疾病,故發病人群以>60歲為主,目前尚未有根治手段,研究該病的發生、發展作用機制,對其治療具有重要意義[1-3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是可在轉錄后調節基因表達的非編碼RNA分子,可作為帕金森治療的潛在靶點,但lncRNA KCNQ1OT1可在轉錄后調節基因表達而參與腫瘤、糖尿病腎病及心肌病的發生、發展,但在帕金森中相關作用機制目前尚不明確[4]。miRs在神經細胞凋亡、氧化應激及炎性反應過程中均發揮重要作用,miR-132在帕金森病中呈高表達,可參與應激反應調節[5]。1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MMP+)是一種在帕金森病細胞實驗模型建立中應用較為廣泛的神經毒素,可造成多巴胺能神經元氧化應激、細胞凋亡[6]。筆者發現lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p在帕金森病模型細胞中的作用和關系尚不明確,基于此,本研究通過MMP+誘導建立帕金森病模型細胞,以下調lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達的方法明確其對帕金森病模型細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料 (1)研究細胞:人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞來自中國科學院細胞庫,本研究經巴彥淖爾布醫院倫理委員會審核批準。(2)主要試劑:RPMI-1640培養基(武漢益普生物科技有限公司),活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(北京索寶科技有限公司),lncRNA KCNQ1OT1抑制劑(anti-lncRNA KCNQ1OT1)、模擬物(lncRNA KCNQ1OT1)、miR-132-5p抑制劑(anti-miR-132-5p)、模擬物(miR-132-5p)、陰性對照(KCNQ1OT1-NC、miR-NC、si-lncRNA KCNQ1OT1、pcDNA)、miR-132-5p的野生及突變型雙熒光素酶載體均購自南通百奧邁科生物公司,流式細胞儀(美國BD公司),BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術公司),Bcl-2蛋白、Bax蛋白抗體(SCBT公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞放入RPMI-1640培養液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/ml酶聯素)中,之后將其放入培養箱(溫度37℃、5%CO2)中進行培養,每3天更換1次培養液,密度達80%～90%時,將培養基除去,進行傳代培養,取3～5代細胞進行后續實驗。

1.2.2 模型建立:取對數生長期SH-SY5Y細胞分為Con組(正常培養),MMP+組(將濃度為100 μmol/L的MMP+加入培養液中,誘導24 h進行轉染)。

1.2.3 細胞轉染:取對數MMP+培養SH-SY5Y細胞,稀釋至1×106個細胞/mL,后接種于6孔板上,200 μL/孔(1×106個/孔),待細胞融合度達80%,以Lipofectamine 2000進行轉染,分組:lncRNA KCNQ1OT1抑制組(轉染anti-KCNQ1OT1-NC和anti-lncRNA KCNQ1OT1),miR-132-5p抑制組(轉染anti-miR-132-5p-NC和anti-miR-132-5p),lncRNA KCNQ1OT1過表達組(轉染KCNQ1OT1-NC+lncRNA KCNQ1OT1),lncRNA KCNQ1OT1低表達和miR-132-5p過表達(轉染anti-KCNQ1OT1+pcDAN和anti-KCNQ1OT1+pcDAN+miR-132-5p),野生型和突變型雙熒光素酶報告系統(轉染KCNQ1OT1-NC+WT-miR-132-5p、lncRNA KCNQ1OT1+WT-miR-132-5p、KCNQ1OT1-NC+MUT-miR-132-5p、lncRNA KCNQ1OT1+MUT-miR-132-5p),轉染48 h后進行后續實驗。

1.2.4 lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達量檢測:SH-SY5Y細胞lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達量采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測,采用TRIzol試劑盒提取和純化RNA,使用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄處理,獲得總cDNA,采用Primer 5.0軟件設計引物序列,啟動PCR儀,反應條件:95℃、94℃、59℃、72℃分別為5 min、30 s、45 s、45 s,45個循環,采用2-ΔΔCt方法計算出lncRNA NEAT1表達量。

1.2.5 ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測:取對數生長SH-SY5Y細胞,接種于6孔板,孵育過后通過酶標儀對ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平進行檢測,孔中加入10 μL待測樣品、40 μL待測樣品稀釋液,搖勻,加入酶標試劑100 μL,封板并孵育60 min(37℃),將孔中液體棄去,Wash Sohltion重復清洗后加入50 μL顯色劑,搖勻,顯色處理15 min(37℃),后加入終止液50 μL,OD值在450 nm波長下檢測ROS、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 細胞凋亡率檢測:取對數生長SH-SY5Y細胞,接種于6孔板上,2×104個/孔,培養48 h后將培養液棄去,PBS進行洗滌,共2次,后將結合緩沖液重懸細胞(200 μL)、AnnexinV-異硫氰酸熒光素(5 μL)、PI(5 μL)加入,結合緩沖液在孵育15 min后加入,共300 μL,后通過流式細胞儀對細胞凋亡率進行檢測。

1.2.7 Bcl-2、Bax蛋白表達檢測:細胞中蛋白依照細胞蛋白提取試劑盒說明進行萃取,Bcl-2、Bax蛋白表達量通過Western blot法進行檢測,SDS-PDGE電泳于每孔加入80 μg蛋白后進行,電泳結束后將蛋白電轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉,Bcl-2、Bax蛋白一抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將Bcl-2、Bax蛋白K二抗(1∶1 000)于搖床上室溫孵育,60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化學發光顯影采用ECL,以GAPDH為內參,相對條帶灰度光密度值采用Image J軟件分析。

2 結果

2.1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-132-5p在MMP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達 與Con組相比,MMP+組lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p表達量較高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-132-5p在MMP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達

2.2 lncRNA KCNQ1OT1低表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響 與Con組比較,MMP+組lncRNA KCNQ1OT1、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均升高,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與MMP++KCNQ1OT1-NC組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1組lncRNA KCNQ1OT1、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均降低,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

表2 lncRNA KCNQ1OT1低表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響

2.3 干擾miR-132-5p表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響 與Con組比較,MMP+組miR-132-5p表達量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均升高,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與MMP++miR-NC組相比,MMP++si-miR-132-5p組miR-132-5p表達量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均下降,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均上升,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

表3 干擾miR-132-5p表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響

2.4 雙熒光素酶報告實驗 雙熒光素酶報告系統結果顯示,與KCNQ1OT-NC組比較,過表達lncRNA KCNQ1OT組野生型WT-miR-132-5p的熒光從熒光素酶相對活性較高,差異有統計學意義(t=6.708,P<0.05),而突變型MUT-miR-132-5p無顯著變化,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 miR-132-5p過表達逆轉了lncRNA KCNQ1OT1低表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響 與MMP++KCNQ1OT1-NC組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1組miR-132-5p表達量、

ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均降低,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均增加,差異有統計學意義(P<0.05);與MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1+pcDNA組比較,MMP++si-lncRNA KCNQ1OT1+pcDNA+miR-132-5p組miR-132-5p表達量、ROS、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、凋亡率、Bax蛋白表達均上升,SOD水平、Bcl-2蛋白表達均下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表5,圖3。

圖3 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

表5 miR-132-5p過表達逆轉了lncRNA KCNQ1OT1低表達對MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡的影響

3 討論

帕金森病是發病隱秘、病程進展緩慢的老年疾病,臨床癥狀多表現為肢體震顫、活動期間姿態笨拙,且部分患者可伴隨步態障礙或運動緩慢等癥狀,進而對患者正常機體活動造成了不利影響[7-9]。有學者發現神經元氧化應激及炎性損傷、細胞凋亡為帕金森病發病的主要原因,因此尋找可有效抑制神經元氧化應激及炎性損傷、細胞凋亡的分子靶點對臨床診治具有關鍵意義[10-12]。

研究有明,帕金森病病理機制中lncRNA具有重要的調控作用,如lncRNA NEAT1可通過調控RAB3IP、miR-212-5p表達而減輕MMP+引發的細胞毒性及凋亡,lncRNA UCA1可通過抑制P13K/AKT激活而減輕氧化應激炎性反應,lncRNA H19可通過激活Wnt/β-catenin、調控HPRT1表達而減輕神經元細胞損傷,lncRNA KCNQ1OT1作為新型lncRNA可參與內脂應激、神經元損傷及凋亡調節,在腦缺血再灌注損傷、缺血性腦卒中、神經膠質瘤等腦部相關疾病中均發揮重要作用[13-15]。近年來研究表明,lncRNA可通過調控miRNA表達而對下游效應分子功能進行調節,而miRNA可通過靶向調控蛋白表達、抑制或靶向降解其靶mRNA而參與人類疾病的發生、發展,miR-132在帕金森病中呈高表達,且與患者疾病嚴重程度、疾病分期密切相關,而抑制miR-132表達可減少神經細胞凋亡,增加細胞存活量[16]。本研究顯示,miR-132-5p在MMP+誘導SK-N-SH細胞中呈高表達,雙熒光素酶實驗結果顯示,miR-132-5p為lncRNA KCNQ1OT1的靶基因,lncRNA KCNQ1OT1可正向調控miR-132-5p表達,表明lncRNA KCNQ1OT1可靶向調控miR-132-5p表達。

氧化應激反應易對大腦造成影響,故臨床多認為神經系統疾病的發病與氧化應激反應存在密切聯系[17]。ROS為線粒體產物,其低水平表達與正常細胞功能維持存在密切聯系,當抗氧化防御系統與ROS平衡遭到破壞時,可引發氧化應激反應,繼而推動了帕金森病的發生、發展[18-19]。SOD作為抗氧化酶,具有清除自由基的作用,其水平過低可造成ROS在機體內累及,進而促進了酮基、MDA等降解產物的產生,因此MDA可對細胞損傷程度進行間接反映,同時過表達的MDA可對線粒體膜造成損傷,進而對其流動性、通透性造成影響,使得線粒體內Cyt C釋放進入細胞質,最終造成細胞凋亡[20-21]。本研究表明,低表達lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達均可減輕降低ROS、MDA水平,提升SOD水平,而lncRNA KCNQ1OT1低表達和miR-132-5p過表達可提升ROS、MDA水平,降低SOD表達,表明低表達lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達均可抑制細胞氧化應激損傷,而miR-132-5p過表達可逆轉lncRNA KCNQ1OT1低表達產生的細胞氧化應激損傷保護。

帕金森病的主要病理生理標志之一為慢性神經炎癥,慢性神經炎癥可通過激活小膠質細胞核星形膠質細胞而加重多巴胺能神經元變性[22]。IL-1β、IL-6、TNF-α均為具有促炎作用的小膠質細胞活化M1表型,可通過激活細胞凋亡信號而造成器官損壞甚至衰竭,且可促進線粒體產生ROS并釋放細胞色素,最終造成細胞凋亡[23]。細胞凋亡為涉及凋亡相關基因表達及產物相互影響、作用、一個基因級聯反應的細胞自我消亡過程,Bcl-2、Bax蛋白均為細胞凋亡相關蛋白,分別具有抑制細胞凋亡、促進細胞凋亡的作用,兩者表達量與神經細胞凋亡存在密切聯系[24-25]。本研究表明,低表達lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達均可減輕降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平、Bax表達,提升Bcl-2表達,而lncRNA KCNQ1OT1低表達和miR-132-5p過表達可提升IL-1β、IL-6、TNF-α水平、Bax表達,降低Bcl-2表達,表明低表達lncRNA KCNQ1OT1、干擾miR-132-5p表達均可抑制細胞炎性損傷及凋亡,而miR-132-5p過表達可逆轉lncRNA KCNQ1OT1低表達產生的細胞保護。

本文通過轉染lncRNA KCNQ1OT1抑制劑成功下調lncRNA KCNQ1OT1表達后發現MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡受抑,同時轉染miR-132-5p干擾序列后上調miR-132-5p表達后發現lncRNA KCNQ1OT1低表達造成的細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡抑制作用減弱,提示lncRNA KCNQ1OT1低表達可靶向miR-132-5p而抑制MMP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激、炎癥損傷及凋亡,發揮保護帕金森病細胞損傷的機制。說明lncRNA KCNQ1OT1、miR-132-5p是帕金森病的潛在分子靶點,可為帕金森病臨床診治提供指導。