從NF-κB/Bcl-2信號通路調控成纖維樣滑膜細胞凋亡角度探討中醫藥抑制類風濕關節炎滑膜炎癥機制的研究進展*

陳 平,杜小正,王海東,井維堯,劉 翠,李浩林,陶鵬飛,王金磊

(1.甘肅省中醫院風濕骨病中心,甘肅 蘭州 730050; 2.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關節滑膜炎癥為主要病理特征的系統性慢性自身免疫性疾病,發病迅速,具有進行性、破壞性、致殘性等特點,對人類健康造成嚴重危害[1]。RA具體發病機制尚不明確,但持續的滑膜炎癥是導致RA病情發展的最主要因素。臨床給予氨甲蝶呤、來氟米特、糖皮質激素等藥物治療RA,可明顯改善病情,延緩疾病進展,但長期用藥不僅會使患者產生耐受,還會對患者的循環系統、消化系統等造成損害[2]。中醫藥治療RA具有一定優勢,但作用機制不明是限制中醫藥發展的難題。成纖維樣滑膜細胞( fibroblast-like synoviocytes,FLS)是介導RA滑膜炎癥的主要效應細胞[3],FLS激活后可產生大量炎癥因子,引發炎癥級聯反應。RA-FLS具有抗凋亡的特性,其不斷的增殖和遷移是導致血管翳生成及骨破壞的關鍵原因[4]。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/ B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信號通路在FLS的抗凋亡過程中發揮重要作用。研究顯示,RA-FLS中NF-κB表達異常增高,能轉錄大量的Bcl-2調控線粒體,并介導FLS抗凋亡[5]。因此,調控NF-κB/Bcl-2信號通路活性是促使FLS凋亡、抑制RA滑膜炎癥的關鍵。筆者從NF-κB/Bcl-2信號通路調控FLS凋亡角度探討中醫藥抑制RA滑膜炎癥機制的研究進展,綜述如下。

1 RA-FLS抗凋亡是介導RA滑膜炎癥的核心因素

FLS的生理增殖與間充質干細胞從循環中遷移或滑膜中干細胞池的擴大有關,但在RA中,FLS增殖原因尚不明確,可能是由于細胞增殖、生存和死亡的失衡造成。研究[6]表明,RA滑膜組織具有高度遺傳毒性,其活性氮和活性氧水平增高造成的氧化應激反應足以使細胞凋亡;即使FLS的DNA損傷、DNA鏈斷裂增加,經TUNEL檢測、組織形態測定及電子顯微鏡檢查,FLS的凋亡程度仍然處于較低水平。

RA患者的滑膜組織從靜止的相對無細胞結構轉變為充滿免疫細胞的增生性浸潤組織后,活化的FLS便迅速增殖,促使血管翳形成[7],并進一步增加自身抗凋亡能力。同時,FLS通過產生炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、趨化因子和基質降解分子等,增強侵襲能力,并附著在骨表面,加速對骨關節的損傷和破壞[8]。

原位雜交和免疫組化研究[9]表明,內膜中的FLS是白細胞介素(interleukin,IL)-6的主要來源,培養的FLS自發產生IL-6,且IL-1或TNF通過核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)依賴性途徑促進IL-6產生,充分說明FLS具有促炎作用,也說明IL-6抑制劑能改善RA的體征和癥狀;同時,研究表明,關節中的集落刺激因子主要來源于RA-FLS,這些生長因子具有增加骨髓中造血干細胞譜系特異性成熟的能力,在樹突狀細胞和巨噬細胞活化中起著關鍵作用,其粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子在RA滑膜和滑膜積液中含量豐富,并經原位雜交研究證實其主要由RA-FLS產生。研究表明,IL-1或TNF刺激可顯著增加FLS中GM-CSF的水平,此為誘導巨噬細胞局部擴張和活化的關鍵環節[10]。

實驗證明,FLS細胞膜上Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)存在高表達現象,而滑膜組織中大量的高遷移率族蛋白B1、透明質酸及熱休克蛋白等物質可作為損傷相關的分子模式激活TLR通路,介導胞內磷脂酰肌醇3激酶、絲裂原活化蛋白激酶、NF-κB等多種炎癥通路激活,從而活化炎癥網絡[11]。此外,活化的FLS還將誘導輔助性T細胞(helper T cell ,Th)1、Th17等多種免疫細胞遷移至關節中,分泌IL-6、IL-17等多種炎癥因子,協同RA-FLS加重炎癥反應[12]。同時,RA-FLS可內吞中性粒細胞胞外陷阱,獲得抗原呈遞細胞的能力并將其呈遞給CD4+T細胞,這一過程是誘導自身免疫反應的關鍵[13]。

綜上可知,FLS是介導RA滑膜炎癥的主要效應細胞,其抗凋亡特性是加重RA滑膜炎癥的關鍵因素,促進FLS凋亡是抑制RA滑膜炎癥的可靠目標。

2 NF-κB/Bcl-2信號通路調控FLS凋亡是抑制RA滑膜炎癥的關鍵靶點

Bcl-2是一種癌基因,具有明顯抑制細胞凋亡的作用,不僅可以抑制由多種細胞毒素引起的細胞死亡,還可促使細胞在無生長因子環境下存活。在Bcl-2蛋白家族中,Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白,Bcl-2關聯X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)是主要的促凋亡蛋白,兩者動態變化可引起線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeability,MOMP)改變,從而激活線粒體凋亡通路[14]。Bcl-2蛋白一般位于線粒體或內質網上,其含有的多個BH結構域通過阻斷BH3-only蛋白與其激活劑和增敏劑的結合來阻滯凋亡程序,從而抑制MOMP發生。研究[15]證實,在RA的發病過程中,Bcl-2呈明顯高表達狀態,且TNF-α及IL-1β容易刺激RA-FLS導致Bcl-2出現高表達現象,從而證實RA炎癥與FLS抗凋亡是相互促進的。然而,在RA機體中,BAX表達水平升高的幅度遠遠低于Bcl-2,故Bcl-2/BAX極易升高,導致滑膜細胞增殖/凋亡失衡,必然促進RA的發生發展,加重RA癥狀。

Bcl-2的關鍵啟動子多個分布于NF-κB上,而NF-κB感受細胞調節,使NF-κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)激酶磷酸化后釋放NF-κB關鍵位點并移位至細胞核,調控Bcl-2蛋白的表達,進而調控細胞凋亡過程[16]。RA患者外周血中磷酸化NF-κB抑制蛋白α、NF-κB p65亞基、Bcl-2等明顯高表達,證實NF-κB/Bcl-2通路在RA中具有關鍵作用[15]。實驗[16]表明,RA大鼠滑膜組織Bcl-2明顯高表達,但BAX信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)及蛋白質水平升高幅度遠遠低于Bcl-2水平,從而造成滑膜細胞增殖/凋亡失衡,促使RA發生發展。研究[17]證實,上調FLS中NF-κB、Bcl-2蛋白水平,可抑制FLS凋亡,促使FLS分泌IL-6、TNF-α等炎癥因子。相反,沉默NF-κB基因或使用NF-κB抑制藥物硼替佐米等干預能下調RA-FLS中Bcl-2的水平,促使FLS凋亡,減少TNF-α、IL-1β產生[18-19]。研究[20]發現,采用香附素處理RA-FLS后, Bcl-2表達明顯下調,BAX、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9表達上調,且呈劑量依賴性下調IκB和NF-κB磷酸化水平,誘導RA-FLS細胞凋亡,減輕炎癥反應。體內研究[21]表明,梔子有效成分AC-5GP可抑制RA大鼠體內炎癥反應;進一步研究發現,AC-5GP可抑制NF-κB核移位,降低Bcl-2蛋白水平,增加BAX、Caspase-3表達,促使FLS凋亡。

綜上所述,NF-κB/Bcl-2是調控RA-FLS凋亡的關鍵信號通路,抑制其活性可以促使RA-FLS凋亡,此為緩解RA滑膜炎癥反應的關鍵靶點。

3 NF-κB/Bcl-2信號通路調控FLS凋亡在中醫藥抑制RA炎癥反應中的作用

研究表明,中藥[22]、針灸[15]等方法治療RA療效顯著,可延緩病情發展,減輕炎癥反應。但中醫藥基礎研究薄弱,這也是限制其臨床發展的關鍵。因此,明確中醫藥治療RA的具體分子機制是支撐中醫藥高質量發展的堅實基礎,有利于中醫藥成果的轉化。

凋亡與抗凋亡的調節失衡是RA-FLS加重滑膜炎癥的關鍵原因,而中醫藥具有調節機體平衡和穩態的作用,可以通過調節內穩態失衡治療RA。因此,從NF-κB/Bcl-2信號通路及調控FLS凋亡角度探討中醫藥治療RA的機制具有可行性,可能是中醫藥治療RA的關鍵靶點。

3.1 中藥治療

臨床研究[23]表明,二妙散是治療RA的經典方劑,能明顯改善RA大鼠的關節滑膜增生、軟骨破壞和滑膜炎癥。體外研究[24]發現,二妙散水提取物可以降低膠原誘導的關節炎大鼠FLS中NF-κB mRNA及蛋白表達,抑制FLS的增殖和遷移。劉穎姝[25]采用益氣養陰通絡方治療RA取得良好療效,通過網絡藥理學分析發現,其作用機制與誘導FLS凋亡有關;體外研究進一步證實,益氣養陰通絡方可以通過抑制NF-κB通路活性減少Bcl-2的表達,促使FLS凋亡。然而,由于中藥復方成分復雜,其基礎研究仍然存在困難。對中藥單體及其有效成分的研究能為中藥復方的臨床運用提供一定的基礎。

研究[26]表明,類牡丹提取物可以緩解RA-FLS炎癥反應,促進FLS凋亡,抑制血管翳形成,其機制與抑制NF-κB p65、NF-κB p50、Bcl-2及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)活性有關。迷迭香具有健脾、止痛的功效,在RA的治療中備受關注。迷迭香有效成分鼠尾草酸具有抗炎止痛、抗氧化的作用,可抑制RA大鼠踝關節滑膜組織中NF-κB p65、IκB的表達水平,減少IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放。相關研究[27-28]證實,Bcl-2是鼠尾草酸的作用靶點之一,可通過促進細胞凋亡抑制多種癌癥進展,但其在RA-FLS凋亡中的作用仍需進一步明確?？鄥⒕哂星鍩嵩餄竦淖饔?常用于濕熱型RA的治療,其有效成分苦參堿被證實具有促進FLS凋亡的作用。研究[29]顯示,苦參堿能通過干預CIA大鼠抑制大鼠滑膜組織中NF-κB、Bcl-2 mRNA的表達,提高BAX mRNA的表達,減少Caspase-1蛋白表達,達到抑制滑膜增殖和炎癥浸潤、減輕關節腫脹的目的,但該研究未直觀地對滑膜組織進行凋亡檢測,尚存在一定不足。研究[30]顯示,使用吳茱萸苷干預RA-FLS可通過抑制NF-κB/Bcl-2信號通路活性增加BAX的表達,誘導線粒體障礙,促使FLS凋亡,最終發揮抗炎作用。歐前胡素是白芷的主要有效成分。研究[31]證實,歐前胡素能降低NF-κB和Bcl-2的表達,提高BAX的表達,抑制FLS增殖并促使其凋亡。

3.2 中醫外治

針灸作為一種安全、便捷的中醫外治法被廣泛用于RA的治療。RA緩解期單獨使用針灸治療可穩定病情,改善關節運動功能[32];活動期采用針灸聯合改善病情的抗風濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)治療能加速降低疾病活動度,緩解臨床癥狀。

研究[33]表明,電針聯合西藥治療RA的療效明顯優于單純西藥治療,可改善患者關節功能評分、雙手握力、晨僵時間等,降低紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應蛋白(C-reactive proten,CRP)和類風濕因子(rheumatoid factor,RF)水平。實驗研究[34]表明,電針干預RA大鼠足三里穴、關元穴可明顯改善足趾腫脹程度,降低炎癥因子水平,其機制與促進FLS凋亡有關。艾灸是臨床常用的RA外治法,其溫熱效應可以溫陽散寒和扶正祛邪,改善RA臨床癥狀及疾病活動性評分28(disease activity score in 28-joints,DAS28)評分,配合西藥使用可提高療效,降低疾病活動度[35]。研究[36]表明,艾灸可改善RA大鼠組織腫脹程度,促使FLS凋亡。胡枝敏等[36]發現,不同的灸量對FLS凋亡率有不同影響,30 min艾灸可更大程度促進FLS凋亡,改善RA大鼠炎癥反應。

近年來,針刀治療RA獲得臨床廣泛認可。針刀治療具有見效快的特點,可改善患者關節功能,減輕疼痛。臨床研究[37]表明,針刀治療RA可有效改善患者VAS 評分、DAS28 評分,降低血清ESR、RF、CRP水平。實驗研究[37]發現,針刀干預RA可以提高大鼠滑膜組織中Caspase-3、Caspase-9 mRNA水平,提示針刀的作用機制可能與促進FLS凋亡有關。研究[38]發現,針刀干預可以下調Bcl-2 mRNA水平,降低Bcl-2/BAX蛋白表達的比值,但其具體作用機制仍需要進一步探討。

4 小結與展望

RA-FLS是滑膜組織中最關鍵的細胞之一,具有增殖、侵襲、遷移及抗凋亡的特點,可促使滑膜組織血管翳形成并加重骨破壞進程。誘導RA-FLS是治療RA的關鍵環節。Bcl-2在RA-FLS中高表達,起到抑制RA-FLS凋亡的作用。通過抑制NF-κB信號通路活性可以降低Bcl-2表達,調節Bcl-2與BAX的比值,促使RA-FLS凋亡,進而改善RA滑膜炎癥。

中藥治療是RA臨床常用的治療方法,中藥的單體藥物研究為中成藥的運用提供了一定的基礎,如雷公藤多甙、白芍總苷等藥物已廣泛并成熟運用于臨床[39]。許多中藥復方及單體藥物可以誘導RA-FLS凋亡,其機制與抑制NF-κB/Bcl-2信號通路密切相關。針灸是一種安全、便捷的中醫外治法,臨床治療RA療效顯著。有實驗[40]表明,電針具有減輕滑膜炎癥的作用,但其調節FLS凋亡等作用需要進一步研究。針刀基于現代解剖,在中醫經筋理論的指導下治療RA療效確切,易被患者接受。目前研究[41]顯示,針刀治療RA的機制與誘導FLS凋亡有關,但其上游機制仍不明,且缺乏更直觀的研究結果。

綜上所述,NF-κB/Bcl-2信號通路調控FLS凋亡在中醫藥臨床研究中具有很大的潛力。多維度論證中醫藥干預方法對FLS凋亡的影響,為中醫藥改善RA滑膜炎癥機制提供堅實的理論和實驗證據,有利于推動中醫藥治療RA的快速發展。