丹參SmWRKY33基因的克隆與表達分析

龔婷 劉靈娣 溫春秀 武玉翠 王升 萬修福 孫亞倩 姜濤

摘要：為了研究WRKY33基因在丹參非生物脅迫中的作用機制，以白花丹參為試驗材料，對丹參轉錄組數據進行分析，挖掘出丹參WRKY33基因參考序列并設計特異性引物，利用基因克隆技術從丹參中克隆出WRKY33基因的全長cDNA，命名為SmWRKY33。對SmWRKY33基因進行生物信息學分析，同時利用熒光定量方法探究SmWRKY33基因在逆境脅迫下的表達模式。結果表明，SmWRKY33基因核苷酸長度為1 635 bp，編碼544個氨基酸。生物信息學分析顯示，SmWRKY33基因的理論相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，定位于細胞核，不存在跨膜區及信號肽，SmWRKY33蛋白為不穩定親水蛋白。親緣關系顯示，SmWRKY33與紫蘇、芝麻、白花泡桐的WRKY33親緣關系較近。密碼子偏好性分析得出擬南芥真核表達最適應丹參SmWRKY33基因的外源表達。qRT-PCR結果表明，SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl等逆境脅迫誘導下具有不同的表達模式，其中低溫、NaCl能顯著誘導SmWRKY33基因的高表達，說明該基因對溫度調節、鹽脅迫較為敏感，猜測其參與溫度、鹽脅迫調控反應機制。本試驗首次從丹參中克隆出SmWRKY33基因，探討了該基因在丹參逆境脅迫下的作用機制，旨在為培育丹參的抗逆新品種提供參考基因。

關鍵詞：丹參；SmWRKY33基因；生物信息學；qRT-PCR；基因克隆

中圖分類號：S567.5+30.1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0053-08

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科、鼠尾草屬多年生直立草本植物，是我國的大宗藥材之一［1］。2020版《中華人民共和國藥典》中記載：丹參以干燥根莖入藥，具有活血、止痛、生新等功效，用于治療胸痹心痛、月經不調、衰弱失眠等病癥，臨床上常用于心血管疾病的治療［2］。丹參發揮藥效的成分主要有2類，其中包括丹酚酸類、丹參酮類化合物［3］。此外，丹參基因組完善，生育期短，成為研究中藥材在環境脅迫下的模型植物［4］。近些年來，丹參市場不斷擴大，野生丹參遠不能滿足市場的需求；而在人工種植過程中，干旱會極大影響丹參的生長和品質。劉大會等通過研究不同土壤和水分對丹參植株的影響，發現嚴重干旱和過多水分會導致丹參酮、丹酚酸B的含量與累積量明顯下降，進而影響丹參的產量和品質［5］。如何提高丹參的抗旱性和耐鹽性，培育丹參抗逆品種，成為一個熱門研究話題。

WRKY轉錄因子作為植物轉錄因子（transcription factors，TF）的一個大家庭，參與了植物的生長發育、防御調控、逆境反應等多種生物學過程，并在其中起著積極或消極的調節作用［6］。WRKYs通常由2個結構組成，包括高度保守的WRKYGQK七肽結構域（位于其N端的WRKY結構域）和C端的鋅指基序［7］。WRKY結構域能和順式作用元件W-box（C/T）TGAC（C/T）以及RAV1A、WLS元件特異性結合，說明它們具有不同的結合方式，并參與下游目的基因調控［8］。Yu等從小麥克隆出TaWRKY1-2D基因，研究表明TaWRKY1-2D蛋白可能參與小麥中植物激素生物合成、轉錄后基因調控、代謝途徑、蛋白激酶信號傳導，調節下游基因的表達以影響小麥生長機制，表明TaWRKY1-2D基因可以提高小麥的耐旱性［9］。Cai等從玉米中克隆出ZmWRKY17基因，結果發現，ZmWRKY17在擬南芥中通過抑制一些ABA和逆境反應基因的表達，提高對鹽脅迫的敏感性，降低對ABA的敏感性，以此來提高植物的耐鹽性［10］。Xiang等以擬南芥為模式植物，從中克隆出MFWRKY70基因，研究發現MFWRKY70基因定位于細胞核，通過該基因促進根系生長和保水，極大提高根系對干旱、滲透、鹽脅迫的耐受性，以及在應激條件下增強抗氧化酶系統和維持活性氧（ROS）穩態和膜脂穩定性［11］。目前丹參的WRKY33基因還未被研究發現，本研究首次從丹參中克隆出WRKY33基因并進行生物信息學分析，同時利用qRT-PCR對特異性表達模式進行分析，旨在為進一步研究丹參調控次生代謝產物生物合成及逆境響應的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為丹參幼苗，品種為白花丹參，來自河北省農林科學院（114.45°E，38.06°N），于2022年12月采樣進行后續試驗。取丹參葉片，清水洗凈后液氮速凍，用于丹參RNA的提取。

RNA提取試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit、cDNA反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal、高保真酶試劑盒2×TranStart FastPfu、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、熒光定量試劑盒等，購自天北京全式金生物技術有限公司；pMD19-T載體、2×Taq Plus Master Mix，購自北京白鯊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

依照全式金高純度RNA植物提取試劑盒（目錄號：ER501-01）說明書，提取丹參葉片的總RNA；以丹參總RNA為模板，依照全式金TransScript One-Step Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（目錄號：AT311-03）說明書反轉錄體系，對丹參進行cDNA的合成。

1.2.2 丹參引物合成

根據丹參轉錄組數據庫，利用Primer 5.0軟件設計SmWRKY33基因特異性引物。上游引物：SmWRKY33-F 5′-ATGGCTTCTTCTAGCGGAAGC-3′；下游引物：SmWRKY33-R 5′-TCAGCTGAGGAAAGAGTCGAA-3′，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成。

1.2.3 丹參SmWRKY33基因克隆

以丹參cDNA為模板，參照全式金生物有限公司高保真DNA聚合酶2×TranStart FastPfu試劑盒方法擴增SmWRKY33基因全長。25 μL擴增體系如下：12.5 μL 2×Taq Plus MasterMix，1.0 μL SmWRKY33-F，1.0 μL SmWRKY33-R，1.0 μL Template cDNA，9.5 μL ddH2O。PCR擴增程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。PCR產物用瓊脂糖凝膠進行電泳監測，用紫外成像儀進行觀察，全式金膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與表達載體pMD19-T和大腸桿菌DH5α進行轉化連接，挑取單克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 丹參SmWRKY33基因生物信息學分析

利用在線軟件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/），ExPASy-ProScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對分子量、等電點等理化性質和親疏水性進行分析，利用Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線分析保守結構域，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM/）對序列信號肽、跨膜結構進行分析，利用NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線分析磷酸化、糖基化位點，利用PSORT Prediction（http：//psortl .hgc.jp/form.html）對基因SmDREB2A的cDNA編碼氨基酸序列亞細胞進行定位，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）對SmWRKY33蛋白進行二、三級結構等預測；利用CodonW、EMBOSS軟件分析丹參SmWRKY33基因密碼子的偏好性。

1.2.5 丹參SmWRKY33基因表達分析

對丹參根進行低溫、高溫、PEG、NaCl處理，使用熒光定量分析SmWRKY33相對表達量，以丹參肌動蛋白基因Actin為內參基因，利用軟件Primer 5.0進行引物設計（表1）。

參照全式金PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑盒中說明書進行操作，20 μL反應體系如下：10 μL PerfectStart Green qPCR SuperMix，0.4 μL引物-F（正向引物），0.4 μL 引物-R（反向引物），2.0 μL cDNA （1 ng），7.2 μL ddH2O。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；4 ℃ 保存。每個反應重復3次，使用2-ΔΔCT 法分析丹參SmWRKY33基因表達量。

2 結果與分析

2.1 丹參SmWRKY33基因cDNA克隆與序列分析

根據丹參轉錄組數據得到的基因信息，發現1個丹參WRKY33抗逆基因，以此序列設計特異性引物，對丹參WRKY33進行基因克隆。經PCR擴增得到1條特異性片段，其大小約為1 600 bp，與預期大小長度一致（圖1-A）。對PCR產物進行回收后，連接至pMD19-T測序載體，使用大腸桿菌DH5α進行轉化，挑取單克隆菌液送公司測序。對測序結果進行分析，發現該序列含有1 635 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼544個氨基酸（圖1-B），命名為SmWRKY33。在SmWRKY33基因的氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）含量最高，占14.2%；其次為脯氨酸（Pro）含量，占9.5%；色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）含量最低，各占0.7%。

利用ProtParam在線軟件分析SmWRKY33蛋白的理化性質，SmWRKY33蛋白的相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，分子式為C2 641H4 039N769O862S15，不穩定指數為69.58，脂肪族指數為46.60，總平均親水性為-1.007，歸類為不穩定親水蛋白。ExPasy-ProtSCale在線軟件分析SmWRKY33蛋白親/疏水性，結果顯示，SmWRKY33蛋白疏水性最強的位點是第108個氨基酸，疏水最高值為1.889；親水性最強的位點是第133個氨基酸，親水性最低值為 -3.156（圖2-A）。但從整條肽鏈的預測值結果分析來看，該蛋白整體趨于親水性，為親水蛋白。

2.2 丹參SmWRKY33基因生物信息學分析

利用NCBI數據庫對丹參SmWRKY33基因進行Blast分析，結果表明，SmWRKY33基因的氨基酸序列與PfWRKY33（紫蘇，Perilla frutescens，KAH6798330.1）、PaWRKY33（白花泡桐，Paulownia fortunei，KAI3447833.1）、BuWRKY33（互葉醉魚草，Buddleja alternifolia，KAG8374463.1）、SeWRKY33（芝麻，Sesamum indicum，XP-011077504.1）的同源性較高，同源性分別為78.27%、73.39%、73.13%、66.78%（圖2-C）。在線軟件NCBI分析得出SmWRKY33基因有2個WRKY基因保守結構域。利用MEGA 11軟件分析SmWRKY33基因氨基酸序列親緣關系，結果顯示SmWRKY33基因與紫蘇、芝麻、白花泡桐WRKY33親緣關系較近（圖2-B）。

在線軟件WoLF-PSORT預測SmWRKY33蛋白的亞細胞定位，該蛋白可能定位于細胞核。利用TMHMM Sever 2.0預測SmWRKY33蛋白的跨膜結構域，結果顯示該蛋白沒有存在跨膜結構域，可能不屬于跨膜蛋白（圖3-A）。使用NetNGlyc 1.0 Server對SmWRKY33蛋白糖基化位點進行預測，結果表明該蛋白共有6個糖基化位點（圖3-B）。利用NetPhos 3.1 Server對SmWRKY33蛋白的磷酸化位點、蛋白激酶結合位點進行分析（圖3-C），預測值大于0.5共發現149個磷酸化位點，分別含有絲氨酸（S）108個、蘇氨酸（T）27個、酪氨酸（Y）14個。SmWRKY33蛋白的信號肽使用在線軟件SignalP 4.1 Server進行分析，C值、S值、Y值都小于閾值0.5，說明該蛋白沒有信號肽位點，屬于非分泌蛋白（圖3-D）。

2.3 丹參SmWRKY33蛋白二級三級結構預測

利用SOPMA分析SmWRKY33蛋白的二級結構，結果顯示該蛋白二級結構以無規則卷曲為主，占77.39%，其次是延伸鏈、α-螺旋、β-轉角，各占10.48%、10.29%、1.84%（圖4-A）。結合在線軟件SWISS-Model建立SmWRKY33蛋白的三級結構模型，空間結構以隨機卷曲為主，這與二級結構的預測結果相符（圖4-B）。

2.4 丹參SmWRKY33基因密碼子偏好性分析

利用CodonW、EMBOSS軟件分析丹參SmWRKY33基因的密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）、有效密碼子數（effective number of codons，ENC）、GC1s含量、GC2s含量、GC3s含量、總GC含量、同義密碼子相對適應度（relative synonymous codon usage，RSCU）。結果表明，CAI為0.222、ENC為54.16，說明密碼子偏性較弱；總GC含量值0.4 979，其中GC1s、GC2s、GC3s含量值分別為0.4 752、0.4 569、0.5 615，說明該基因的A/U含量高于G/C含量。當RSCU=1時，密碼子沒有偏好性；RSCU>1時，密碼子具有偏好性。表2中，RSCU>1的密碼子共有28個，其中A/U結尾有9個 G/C結尾有19個 說明丹參基因偏好于從數據庫CodcmUsage Database查找煙草（Nicotiana tabacum L.）、擬南芥［Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.］、大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母（Sacchammyces cerevisiae）基因組的密碼子偏好性，利用在線軟件EMBOSS-CHIP分析丹參SmWRKY33基因密碼子的使用頻率，表3列舉了丹參與其4個基因密碼子的使用頻率，分別用Sm/Nt、Sm/At、Sm/Ec、Sm/Sc來表達丹參SmWRKY33基因與煙草、擬南芥、大腸桿菌、酒釀酵母的密碼子使用頻率比值。若2個物種間密碼子使用頻率比值為0.5～2.0，則表明密碼子使用偏向比較接近，超過此范圍則差異較大。差異較大的密碼子個數越少，越有利于基因的異源表達。結果顯示，SmWRKY33與煙草、擬南芥、大腸桿菌、酒釀酵母分別有23、22、28、24個差異較大的密碼子，由此得出擬南芥真核表達最適應丹參SmWRKY33基因的外源表達。

2.5 丹參SmWRKY33基因表達分析

利用熒光定量PCR分析丹參SmWRKY33基因在逆境脅迫下的相對表達量 結果表明SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl等逆境脅迫下有不同程度的表達差異性。在低溫逆境脅迫下SmWRKY33基因的相對表達量顯著提高，在6 h時達到最高（圖5-A）；在高溫逆境處理下相對表達量較低（圖5-B），說明該基因參與丹參的低溫響應機制。同時，為探究SmWRKY33基因在干旱、鹽脅迫下的表達模式，使用PEG、NaCl進行逆境脅迫試驗。結果表明，在PEG處理下，SmWRKY33基因在不同時間點的表達量不同，在24 h表達量達到最高（圖5-C）。在NaCl處理下，SmWRKY33基因的相對表達量隨時間增加總體逐漸升高，但在24 h時出現下降的趨勢，隨后又逐漸上升，表明NaCl顯著誘導SmWRKY33基因的高表達（圖5-D）。SmWRKY33基因表達譜分析結果顯示，該基因易受低溫和鹽等非生物脅迫的誘導表達。

3 結論與討論

丹參是我國傳統中藥材，據《神農本草經》所述，其皆為上品，因藥用部位根部呈紫紅色，被人們稱為“丹心”［12］?！侗静菥V目》原文記載丹參“小花成穗如蛾形，中有細子，其根皮丹而肉紫”，具有活血、治疝痛、通心包絡等作用［13］。Mei等闡述了不同溫度下丹參在干燥過程中產生的代謝變化，發現 100 ℃ 是丹參代謝物譜變化的關鍵轉折點，主要表現為酶促催化生物合成（≤100 ℃） 和化學誘導轉化（≥100 ℃）［14］。Tong等將代謝組學與質譜成像方法相結合，對丹參空間代謝組進行生物合成，發現丹參素是丹參生產多種酚酸的重要前體［15］。意大利學者對丹參進行研究，首次證明丹參中的丹參酮可以改善以奧沙利鉑為主進行化療所帶來的神經病理性疼痛，同時可以降低膠質母細胞瘤中癌細胞的發展速度［16］。

近年來，越來越多的研究證明轉錄因子在生物和非生物脅迫信號傳遞中起著關鍵作用，一些WRKY轉錄因子在干旱/冷脅迫或干旱/熱激脅迫下可以同時被誘導，從而提高植物的抗逆性［17］。Chen等詳細闡述了WRKY轉錄因子在植物非生物脅迫中的作用，表明WRKY轉錄因子在植物生長過程中具有重要作用［18］。WRKY33作為WRKY家族的轉錄因子之一，其轉錄活性依賴于MPK3/6介導的磷酸化。Wang等使用反向遺傳方法和酵母表達系統，明確了擬南芥轉錄因子WRKY33是通過與CesA8遠端啟動子區域的W-box元件結合，直接調節CesA8的表達，參與植物的干旱生長機制［19］。Zhou等通過AtWRKY33基因對同源植物番茄WRKY33脅迫響應中的功能分析，發現在植物生長過程中，WRKY33轉錄因子在植物結構、功能、調控網絡上高度保守，可以有效保護植物免受生物和非生物的脅迫［20］。目前已經從蘋果［21］、向日葵［22］、毛果楊［23］成功克隆出WRKY33，研究表明WRKY33轉錄因子可以提高植物的耐鹽性和抗旱性。

隨著基因克隆技術的發展，越來越多WRKY基因家族的轉錄因子被相繼挖掘出來并進行深入研究。Li等從玉米中克隆出ZmWRKY33，對其進行干旱、高鹽、冷處理及ABA外源誘導試驗，結果表明轉基因擬南芥具有更高的抗逆性［24］。本研究根據丹參轉錄組數據，挖掘出丹參具有耐鹽性和抗旱性轉錄因子WRKY33，利用基因克隆技術首次從丹參中克隆了SmWRKY33基因，該基因全長為1 635 bp，編碼544個氨基酸。利用在線軟件進行生物信息學分析，SmWRKY33蛋白的相對分子量為60 835.66，等電點為7.00，分子式為C2? 641H4 039N769O862S15，為不穩定親水蛋白。親緣關系分析顯示SmWRKY33與紫蘇、芝麻、白花泡桐的WRKY33親緣關系較近。利用在線軟件WOLF PSORT 進行亞細胞定位預測，結果顯示丹參SmWRKY33蛋白可能定位于細胞核中。熒光定量PCR分析SmWRKY33基因在低溫、高溫、PEG、NaCl處理下的相對表達量情況，結果顯示SmWRKY33基因易受低溫、NaCl誘導表達，說明SmWRKY33基因參與了丹參在生長過程中耐低溫和耐鹽機制。本研究利用基因克隆技術，初步探討了SmWRKY33的生物學功能，以期為培育丹參抗逆新品種提供理論支撐。

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