利用CRISPR/Cas9系統創制水稻品種GW2基因的突變體

顏靜宛 陳子強 周淑芬 王鋒

摘要：培育具有育種價值的GW2基因編輯的水稻優異新品種在水稻育種中具有重要意義，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以生產上廣泛推廣應用的13份水稻品種為材料，對粒質量基因（GW2）進行定向性狀改良，通過農桿菌轉化創制出一批無T-DNA元件的水稻非轉基因GW2突變純合株系。結果表明：13份T0代水稻轉基因中，有28.0%～59.1%植株的GW2基因發生了突變，純合突變株數量占總突變株數量的35.0%，雙等位突變株數量占總突變株數量的14.2%，雜合突變株數量占總突變株數量的50.8%。此外，不同水稻品種發生的突變類型也略有不同。對13份T2代非轉基因水稻GW2突變純合株進行千粒質量性狀的考種分析。與對應的野生型親本品種相比，純合突變水稻植株的千粒質量顯著提高10.81%～58.22%。本研究結果極大地豐富了GW2的突變類型，為不同水稻品種的高產穩產創造了重要的種質資源，同時也為利用基因編輯提高水稻產量提供了有價值的育種信息。

關鍵詞：水稻；CRISPR/Cas9；基因編輯；粒質量；GW2基因；突變

中圖分類號：Q344+.14；S511.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0073-06

水稻（Oryza sativa L.）是世界上種植最廣泛的作物之一，是全球超過35億人的主食，尤其是在亞洲。據預測，到2050年，水稻產量必須增加約42%，才能跟上全球日益增長的糧食需求。粒質量是影響水稻產量潛力的重要農藝性狀之一，一直是育種家的主導性狀［1］。研究發現，水稻千粒質量每提高1 g，可增加水稻產量400 kg/hm2［2］。因此，增加粒質量對于水稻新品種的進一步高產穩產越來越重要［3］。因此，迫切需要我們運用更精準的技術和方法來創制高產優質的水稻新品種。

近年來，國內外學者紛紛克隆出控制水稻粒型的基因，如GW2［4］、GW5［5］、TGW6［6］、GW8［7］等，其中水稻粒寬GW2基因已被Song等定位在第2號染色體，這是一個主要調控水稻粒寬和粒質量的主效基因，GW2編碼的環型E3泛素連接酶通過將其底物靶向到蛋白酶體來調節蛋白水解，從而負向調節細胞的分裂［4］。大粒水稻中氨基酸殘基的缺失使得GW2無法結合底物，無法調控泛素介導的蛋白質降解，從而增加谷殼細胞數量，使小穗殼更大、更寬，加快籽粒灌漿速度，增加水稻籽粒的寬度、質量和產量。

基因編輯技術是近幾年來快速發展的熱門新型技術，該技術通過核酸酶對目標靶基因序列進行精準編輯，經過編輯后的目標序列可產生不同形式的突變類型，如堿基的缺失、插入或替換等形式的突變，這些變異形式都具有可遺傳性［8-10］。相比傳統的ZFNs、TALENs技術，基因編輯技術具有更精準改良作物的重要農藝性狀，可大大縮短培育新品種的時間，有利于基因功能研究和精確分子育種。在基因編輯技術中，CRISPR/Cas9系統由于載體易于構建、編輯效率高等優點，成為當前主流的基因編輯系統［11］。目前，CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于作物上，可以創造出更多、性狀更優良的新品種，也可以為解決全球糧食安全問題提供更廣闊的前景［12-16］。

本研究主要對生產推廣中應用廣泛的13份水稻品種進行基因編輯，利用構建的CRISPR/Cas9系統，對粒質量基因（GW2）進行定向改良，通過基因編輯創制出一批優異的非轉基因水稻新品種，以期為進一步開展品種設計和育種價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試受體材料是目前生產上應用廣泛的13份水稻品種，分別是：三系保持系50B；恢復系3550R、736R、5466R、615R、華占；常規秈稻品種福香9號、福泰8522、TN05、粵抗1522、福香98；常規粳稻品種臺粳9號、李粳2號。試驗于2021年5月至2022年12月在福建省農業科學院壽山基地試驗田內進行，按照常規方法進行正常田間種植及管理。

1.2 主要試劑

Golden DNA聚合酶，購自北京天根生物科技有限公司；植物Cas9/gRNA質粒構建試劑盒，購自北京唯尚立德生物科技有限公司；引物合成和DNA測序由福州尚亞生物技術有限公司完成；組織培養試劑，購自Sigma公司。

1.3 載體和菌株

供試菌株為大腸桿菌DH5α和農桿菌菌株EHA105，均購自北京博邁德生物有限公司。

1.4 利用CRISPR/Cas9技術構建基因敲除載體

利用植物Cas9/gRNA質粒構建試劑盒（VK005-01）設計引物，試劑盒步驟如下：oligo二聚體的形成；oligo二聚體插入到載體中；轉化；陽性克隆的鑒定測序。構建水稻粒質量相關性狀的水稻基因編輯載體。

1.5 水稻遺傳轉化

以13個水稻供試轉化受體的成熟胚經誘導后產生的愈傷組織作為轉化受體，水稻愈傷組織的誘導、繼代及與農桿菌的共培養，抗性愈傷組織的篩選、分化及生根等相關培養基和具體試驗步驟參照筆者所在實驗室的常用操作方法［17］進行。

1.6 T0代基因編輯轉化體植株的PCR檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取水稻幼嫩葉片的基因組DNA［18］。設計潮霉素磷酸轉移酶基因（Hpt）的PCR引物，引物編號及序列如下：hyg1，5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′；hyg2，5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′。以提取的T0代各單株的基因組DNA為模板，通過PCR擴增潮霉素磷酸轉移酶基因（Hpt）鑒定轉基因植株。PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃，10 min。PCR產物大小為845 bp。同時，設計粒質量的CRISPR鑒定引物：gw2-1F，5′-GGTGAGGGTTTCATCTGCGG-3′；gw2-1R，5′-CCTACTCTCGCAACAACAAG-3′。PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35個循環；72 ℃，10 min。PCR產物大小為432 bp。

1.7 系統分析T0代基因編輯轉化體的序列信息

對13份水稻T0代轉化苗進行突變位點的測序，找出雙等位突變、雜合突變和純合突變的克隆，并對突變株的突變類型進行統計分析。

1.8 非轉基因水稻GW2突變體的鑒定及其千粒質量性狀的考種分析

將PCR測序結果為突變類型的T0代轉基因單株經過自交結實后，得到的即為T1代種子。以T1代各單株的基因組DNA為模版，通過引物hyg1/hyg2進行PCR擴增Hpt基因，無目的條帶的單株即為無T-DNA元件的GW2突變體。

采用隨機區組設計種植無T-DNA元件的T1代純合GW2突變株系及其對應的親本對照品種，每個株系種植5行，每行種植7株。株行距為20 cm×20 cm，單本栽插。按照大田常規方法進行田間管理。收獲成熟種子烘干后，從中隨機數取飽滿、無病種子1 000粒，用YTS-5D水稻數字化考種機（武漢谷豐光電科技有限公司）稱質量（g），3個重復。數據使用GraphPad Prism軟件計算平均值、標準誤，采用單因素方差分析進行比較。

2 結果與分析

2.1 T0代轉基因水稻植株的PCR檢測

用植物Cas9/gRNA質粒構建試劑盒（VK005-01）設計引物，根據試劑盒說明書按步驟操作，進行轉化，挑3～5個白色菌落搖菌后進行測序，測序結果均正確。將載體命名為CRISPR/Cas9-GW2。

用編輯載體CRISPR/Cas9-GW2轉化13個水稻受體材料，每個轉化受體各轉化30個克隆，分別提取這些克隆水稻轉化植株的基因組DNA，用PCR擴增潮霉素基因。從轉基因植株中擴增出目的條帶，說明目的序列已經整合到水稻基因組中。在13個水稻T0代轉化材料中，轉基因陽性植株檢測結果顯示，轉化陽性率為60.0%～93.3%（表1）。其中，臺粳9號水稻轉基因苗中有28個克隆能擴增出845 bp大小的DNA目標條帶，而陰性對照則不能擴增出目的基因大小的條帶，轉化陽性率為93.3%。PCR檢測結果如圖1所示。

2.2 T0代轉基因水稻GW2基因突變類型分析

為了解T0代轉基因陽性植株GW2基因的突變情況，用gw2-1F、gw2-1R特異引物PCR擴增上述轉基因陽性植株的GW2基因靶位點序列（圖2），并對PCR產物進行測序鑒定，分析結果見表1。由統計結果可知，在13份T0代水稻轉基因中，有28.0%～59.1%植株的GW2基因發生了突變。純合突變株占總突變株數的35.0%，雙等位突變株占總突變株數的14.2%，雜合突變株占總突變株數的50.8%。不同品種發生的突變類型也略有不同，8株736R突變株只產生1種純合突變類型；8株李粳2號突變株也只產生1種雜合突變類型；14株臺粳9號突變株中卻有3株純合突變株、5株雙等位突變株、6株雜合突變株。綜上，利用CRISPR/Cas9-GW2質粒是可以有效編輯不同水稻品種的GW2基因。

2.3 非轉基因水稻GW2突變體的鑒定及其千粒質量性狀的考種分析

將PCR測序結果為突變類型的T0代水稻轉基因種子種植，自交結實后得到T1代種子，對其DNA基因組進行潮霉素基因PCR檢測，擴增得到沒有潮霉素基因的單株，確定為不含T-DNA元件的非轉基因GW2突變體，圖3列出了臺粳9號T1代水稻轉化苗的潮霉素PCR檢測的結果，進一步種植，自交結實得到T2代種子，對13份非轉基因水稻GW2突變純合株進行千粒質量性狀的考種分析。T2代種子的千粒質量統計分析結果見表2，與對應的野生型品種相比，所分析的純合突變植株都顯著提高了水稻的千粒質量，增幅為10.81%～58.22%。其中常規秈稻品種福香9號、 福泰8522、粵抗1522的純合突變株的千粒質量都比親本增幅超過50%。

3 討論與結論

近年來，隨著分子生物學的不斷發展，基因編輯技術特別是CRISPR/Cas9系統的不斷改進，使基因編輯成為一種簡單、高效、易使用的多功能靶向遺傳操作工具。用CRISPR/Cas9系統來改良作物的性狀包括產量、品質及生物和非生物脅迫抗性，有望加速作物改良和提高可持續農業發展的潛力［19］。如在水稻中同時敲除3個與粒質量相關的基因（GW2、GW5和TGW6）會促使籽粒質量聚合，從而大大增加了粒質量［20］。吳明基等通過CRISPR/Cas9編輯Badh2基因來改良優質粳稻品種的香味性狀［21］。尹麗穎等利用CRISPR/Cas9技術來創制出高效抗除草劑水稻［22］。Zhang等通過CRISPR/Cas9敲除Waxy，產生了直鏈淀粉含量低的大米，從而改善了大米的食用和烹飪質量［23］。張元野等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功獲得恢復紅種皮表型的純合株系［24］。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以生產上推廣應用廣泛的13份水稻品種為材料，對粒質量基因（GW2）進行定向性狀改良，一般有28.0%～59.1%植株的GW2基因發生了突變，能非常有效地改良不同水稻品種的粒質量性狀，說明利用CRISPR/Cas9系統是可以快速編輯不同背景不同地域的水稻品種的GW2基因，這也極大地突破和提高了水稻常規育種的進程。但可能由于靶基因、靶位點、脫靶效應等因素的影響，本研究所用的CRISPR/Cas9載體的編輯效率還不是非常高。隨著基因編輯器的不斷開發，Zeng等開發出一套植物高效廣靶向胞嘧啶堿基編輯器PhieCBEs，平均編輯效率提高了3～8倍，展現出穩定的編輯能力［25］。隨后，Tan等在2022年又開發了一個強大的高效腺嘌呤堿基編輯器PhieABEs，可以接近100%的編輯效率，在編輯窗口中有高比例的純合堿基取代［26］。 Wei等也開發出高效的腺嘌呤堿基編輯rABE8e，在水稻中表現出約100%的編輯效率和較高的純合替代率［27］。這些高效基因編輯器的開發，可實現多種形式精準的基因修飾，滿足不同的基因編輯需求，從而為我們今后進一步研究基因功能和分子育種奠定了基礎。

水稻產量是水稻重要的農藝性狀，籽粒大小是決定水稻產量高低的重要因素之一，它不僅是糧食產量的組成部分，而且是決定市場價值的品質性狀。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對不同水稻背景下的GW2位點進行敲除，增產效果明顯，達到了預期的目的。發現不同水稻背景的突變類型略有不同，可發生單堿基或多堿基的缺失或插入，所產生不同的突變類型其千粒質量的增產各不相同，即便不同水稻品種產生相同位點的突變類型，其千粒質量的增產也各不相同。在GW2基因同一個位點發生腺嘌呤單堿基的缺失（-A），恢復系品種3550R的千粒質量增加10.81%，華占的千粒質量增加17.42%；常規秈稻福泰8522的千粒質量增加26.51%，福香9號的千粒質量增加38.63%；而常規粳稻臺粳9號的千粒質量增加30.07%。而在GW2基因同一位點發生胞嘧啶單堿基的插入（+C），保持系50B的千粒質量增加36.32%，常規秈稻粵抗1522的千粒質量則增加58.22%。由此推測，這些不同背景的水稻品種突變后導致氨基酸移碼突變，從而使轉錄提前終止，編碼的蛋白跨膜螺旋結構域發生了改變，從而導致GW2無法結合底物，代謝途徑可能存在顯著差異，因此當GW2突變后，不同品種的GW2突變體加快谷粒灌漿的速度產生了極顯著差異。GW2基因是一種遺傳決定因子，是今后選育良種的理想遺傳資源，可用于定向改良更多生產上主推的水稻品種。此外，需要一個全面綜合的研究策略，通過多重基因組編輯系統構建更多有利的遺傳決定因素，以便有目的地快速培育高產優質的水稻品種，以應對和保障未來的糧食安全。

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