鼠李糖脂抑制芽孢態蠟樣芽孢桿菌的活性及機制

牛永武，喬 杉，孫藝銘，王雨辰，趙仁勇，田雙起,*

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河南工業大學 小麥和玉米深加工國家工程研究中心，河南 鄭州 450001）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見的食源性致病菌，可以通過污染面制品、乳制品等食品引起成人和嬰幼兒食物中毒，危害人體健康[1]。研究表明，B.cereus能夠以營養細胞、芽孢和生物被膜3 種形態廣泛存在于土壤、水、空氣、食品等各種環境中[2]。其中，芽孢態B.cereus是其營養細胞在營養不足或外界環境脅迫條件下形成的休眠體，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和多種化學毒性物質均有很強的抗逆性[3]。芽孢的代謝活性低，但可持續監測周圍環境的營養狀況，一旦養分充足便可快速萌發[4]。目前，巴氏殺菌、輻照等物理殺菌技術和以食品防腐劑為核心的化學抑菌方法是食品生產中常用的微生物殺滅和抑制手段[5]，對滅活有害微生物、確保食品質量安全起到關鍵作用。Juneja等[6]發現溫度從90.5 ℃升至99.0 ℃，可以使B.cereus芽孢數量降低2.53 個對數值。Ansari等[7]在熱處理的基礎上聯合超聲對食物中枯草芽孢桿菌芽孢進行控制，發現100 ℃、振幅114 μm、1.1 W/mL條件下處理5 min，芽孢失活數量增加1.8 個對數值。然而，加熱處理并不適用于對多種食品加工中的殺菌保鮮，而當前的非熱處理等物理殺菌技術大多還停留在實驗室階段[8]。因此，尋求新型的芽孢抑菌劑對預防食品中的芽孢污染具有重要意義。

隨著消費者食品健康意識的增強，具有綠色、安全無毒等特點的天然食品抑菌劑替代化學合成抑菌劑成為當前的發展趨勢[9]，挖掘開發新的天然抑菌劑逐步成為研究熱點[10]。鼠李糖脂（rhamnolipids，RLs）是由銅綠假單胞菌發酵合成的次級代謝產物，是一種天然的陰離子糖脂類表面活性劑[11]，具有抑菌、乳化、抗癌等多種理化特性和生物學活性[12]。其中，RLs的抑菌活性早在1971年被發現[13]，其生物降解等安全性評價在2004年也已經完成。Dusane等[14]研究發現，RLs濃度低于1.6 mmol/L時可以抑制短小芽孢桿菌的生長。de Freitas Ferreira等[15]證實RLs可以使金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌和B.cereus等食源性病原菌失活，抑菌機制主要是破環菌體細胞膜，使其通透性發生改變，造成大量胞內物質外泄，引發菌體死亡[16]。近年來，研究人員還對RLs抑制細菌生物被膜形態進行了探究，發現RLs可以有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，且呈現出劑量依賴效應[17]。Bertuso等[18]發現質量濃度為3.13 mg/mL的RLs可以顯著抑制B.cereus芽孢的生長。隨后，該團隊選擇芹菜籽油樹脂和檸檬烯與RLs聯合處理B.cereus芽孢，將芽孢抑制率從73%提升至98%[19]。但關于RLs對B.cereus芽孢的抗菌機制仍鮮見研究。

基于此，本研究以常見食源性致病菌——B.cereus的芽孢為研究對象，以抑菌圈、生長曲線、菌體外觀形態、芽孢滲透性、相對電導率、生物大分子泄漏量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量、表面疏水性、吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）釋放量以及DNA紫外光譜為評價指標，探究RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性和作用機理，以期為推動RLs作為抑菌劑在食品工業領域的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

B.cereus北京保藏生物科技有限公司

RLs（純度≥90%）湖州紫金生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉粉、瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；ROS測試盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）安徽酷爾生物工程有限公司；其他試劑（均為分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

營養瓊脂培養基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH 7.0）、營養肉湯培養基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0），121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

AB204-S型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；ZHJH-C1109C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；Vortex-2 Genie渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；SevenEasy S20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；5424高速離心機 德國Eppendorf公司；UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 上海華燕醫療器械有限公司；ZQZY-C8振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；SPARK酶標儀 瑞士Tecan公司；Revolve FL熒光倒置顯微鏡美國Echo Laboratories公司；Nova NanoSEM 450場發射掃描電鏡 美國FEI公司；Mini-Protean?Tetra小型電泳套裝、GelDoc Go凝膠成像分析儀 美國伯樂公司；Freezone 6L真空冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢懸液制備

制備1.0×107CFU/mL的B.cereus營養細胞菌液，取100.0 μL涂布在含0.05 g/L四水合硫酸錳的營養瓊脂培養基上，37 ℃培養7 d誘導芽孢形成，超凈工作臺中用滅菌后的載玻片將平板表面的芽孢輕輕刮下，懸浮于無菌水中。4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，用無菌水洗滌3 次，將芽孢重新懸浮在無菌水中，80 ℃水浴處理20 min殺死營養細胞。取一滴菌懸液于載玻片上，用5%的孔雀石綠溶液染色5 min，再用水沖洗，顯示青綠色即表明芽孢制備成功。將芽孢菌液調整至濃度1.0×107CFU/mL，置于-20 ℃條件下1 d后使用[20]。

1.3.2 抑菌活性的評價

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定：分別配制RLs質量濃度為0.0、16.0、32.0、64.0、80.0、96.0、112.0、128.0、144.0、160.0、256.0、512.0 mg/L的營養肉湯培養基，按50.0 mL搖瓶進行分裝，以不含RLs作為對照組。按2%（以體系體積計，下同）芽孢菌液接種，37 ℃、180 r/min條件下培養48 h，測定OD600nm，與初始OD600nm相比變化小于5%的實驗組RLs濃度為對B.cereus芽孢的MIC。

最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定：配制營養瓊脂培養基，從MIC測定實驗組中分別取100.0 μL均勻涂布于固體平板，與對照組相比，菌落數降低3 個數量級的實驗組所對應最低RLs濃度為MBC。

抑菌圈實驗：配制RLs質量濃度分別為MIC、MBC的溶液，吸取100.0 μL芽孢菌液均勻涂布于固體平板上，在培養基表面放置已滅菌的空牛津杯，并向牛津杯中加入200.0 μL不同質量濃度的RLs溶液，以無菌水作為對照組，37 ℃培養24 h后，觀察是否有抑菌圈生成。

生長曲線的繪制：分別配制RLs質量濃度為0（對照）、MIC和MBC的液體培養基，將芽孢菌液按2%接種，37 ℃條件下培養，每2 h測定OD600nm，繪制芽孢生長曲線。

1.3.3 掃描電鏡觀察

在制備好的芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，使其終質量濃度分別為MIC和MBC，37 ℃、180 r/min孵育6 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體，無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）洗滌2～3 次。加入體積分數2.5%戊二醛溶液，于4 ℃過夜固定，依次用體積分數30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度脫水，100%乙醇脫水兩次，再用乙醇-叔丁醇（2∶1、1∶1，V/V）、100%叔丁醇置換，制成叔丁醇芽孢菌液，滴加叔丁醇菌液于鋁箔紙上，-80 ℃預冷后冷凍干燥，采用掃描電鏡觀察并拍照。

1.3.4 芽孢內膜通透性的測定

芽孢滲透性分析：芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，終質量濃度分別為MIC和MBC，對照組加入同體積的生理鹽水（質量濃度為9.0 g/L），37 ℃處理6 h后取樣，離心收集菌體，用等體積生理鹽水重懸。加入濃度為30 μmol/L的PI，避光反應10 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，等體積生理鹽水重懸芽孢菌體，取3.0 μL菌液置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

芽孢菌液胞外電導率的測定：參照Zhang Yunbin等[21]的方法，取芽孢菌液離心，用質量分數5%葡萄糖溶液清洗芽孢菌體，使其電導率與5%葡萄糖溶液的電導率相同，此時的芽孢菌液為等滲菌液。分別加入MIC和MBC的RLs，對照組加入等體積生理鹽水，測定電導率并記為L1。取等滲菌液分別加入MIC和MBC的RLs或生理鹽水，37 ℃振蕩培養8 h，每2 h取樣離心并測定上清液的電導率，記為L2。將培養8 h的菌液121 ℃滅菌30 min，冷卻后離心，測定上清液電導率，記為L0。菌液相對電導率按式（1）計算：

芽孢內大分子釋放量的測定：利用紫外吸光光度法檢測核酸和蛋白等大分子的外泄情況，取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），分別加入MIC、MBC的RLs，對照組加入相同體積的生理鹽水，在37 ℃、180 r/min條件下培養，分別在0、2、4、6、8 h時取出2.00 mL菌液，利用0.22 μm微孔膜過濾，測定濾液的OD260nm和OD280nm。

1.3.5 芽孢ROS含量的測定

取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），加入MIC、MBC的RLs，對照組加入相同體積的生理鹽水，在37 ℃、180 r/min條件下培養，分別在0、30、60、90、120 min時取出200.0 μL菌液，按照ROS檢測試劑盒說明書操作，利用酶標儀檢測各組樣品濾液的熒光強度。

1.3.6 芽孢DPA釋放量的測定

在0.5 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中加入抗壞血酸（終質量濃度為1 g/100 mL）和硫酸亞鐵銨（終質量濃度為1 g/100 mL）配成顯色劑。樣品前處理同1.3.5節，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取4.00 mL上清液與1.00 mL顯色劑混合，測定OD440nm，利用標準曲線計算得到各組樣品中的DPA含量（標準曲線方程為y＝0.001 9x＋0.048 8，R2＝0.991 1）。

測定未處理芽孢的DPA總量，取5.00 mL未處理芽孢懸液經121 ℃、30 min高溫高壓處理，冷卻后加1 mol/L醋酸溶液0.10 mL靜置1 h。離心，取4.00 mL上清液測定DPA含量，即為對照組。

1.3.7 芽孢表面疏水性的測定

利用芽孢對正十六烷的親和力測定其疏水性。樣品前處理同1.3.5節，分別取對照組和RLs處理組的芽孢菌液3.00 mL，與0.60 mL的正十六烷混勻，渦旋振蕩20 s后靜置10 min。對照組的芽孢菌液OD600nm記為A0。取水相再次測定OD600nm，記為A1，以疏水芽孢比例（ratio of hydrophobic spores，RHS）表征芽孢表面疏水性，按式（2）計算：

1.3.8 紫外光譜掃描測定芽孢DNA

按照細菌基因組DNA試劑盒提取方法提取芽孢基因組DNA，用Tris-HCl溶液（0.1 mol/L、pH 8.0）稀釋至1.00 mL，DNA溶液中分別加入MIC、MBC的RLs，以未添加RLs處理為對照組，于37 ℃反應30 min，在220～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描。

1.4 數據統計與分析

無特別說明，以上實驗均為3 次重復。用Origin 8.0軟件繪制曲線圖，用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性評價

MIC和MBC分別可以反映抑菌劑對特定微生物的抑制和殺滅效果，是開發新型抑菌劑常用的評價指標。分別利用吸光光度法和平板涂布法測定RLs對B.cereus芽孢態的MIC和MBC，結果見圖1。如圖1A所示，添加RLs質量濃度為0～64.0 mg/L時，接種芽孢態B.cereus培養48 h后，培養液的OD600nm增長均遠超過5%。RLs質量濃度達到80.0 mg/L時，接種芽孢態B.cereus培養48 h后，培養液的OD600nm為0.104 8，與初始OD600nm（0.100 6）相比僅增加4.17%（＜5%），故確定RLs對芽孢態B.cereus的MIC為80.0 mg/L。將對照組和添加不同質量濃度RLs培養后的菌液進行平板涂布（圖1B），發現RLs質量濃度達到160.0 mg/L時，菌落總數降低3 個數量級，即160.0 mg/L RLs對芽孢態B.cereus的殺死率達99.9%。因此，確定RLs對芽孢態B.cereus的MBC為160.0 mg/L。

圖1 RLs抑制B.cereus芽孢生長的MIC（A）和MBC（B）Fig.1 MIC (A) and MBC (B) of RLs against B.cereus spores

如圖2所示，未添加RLs的芽孢在0～2 h處于延滯期，隨后進入對數生長期，10 h后達到穩定期。加入1/2 MIC的RLs后，芽孢的延滯期延長至4 h，隨后進入生長對數期，但生長速率減緩，10 h后達到穩定期。RLs質量濃度為MIC時，24 h內培養液持續呈澄清狀態，芽孢生長被完全抑制，這與RLs抑制金黃色葡萄球菌的研究結果[15]相似。為進一步驗證RLs對B.cereus芽孢的抑制作用，采用牛津杯法進行抑菌圈實驗，結果如圖3所示，MIC和MBC對B.cereus芽孢抑菌圈直徑分別為（9.77±0.09）mm和（11.29±0.31）mm，表明具有良好的抑菌效果。

圖2 RLs對B.cereus芽孢生長的影響Fig.2 Effect of RLs on the growth of B.cereus spores

圖3 不同質量濃度RLs對B.cereus芽孢的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of different concentrations of RLs on B.cereus spores

2.2 RLs對B.cereus芽孢形態的影響

如圖4所示，未經RLs處理的芽孢呈短桿狀，表面有輕微皺縮，整體較為飽滿但無明顯異常變化。經MIC RLs處理后，部分芽孢表面出現褶皺和折痕，而經MBC RLs處理后的大部分芽孢表現出嚴重的皺縮和凹陷，且表面有泄漏的芽孢內容物，表明一定質量濃度RLs會引起B.cereus芽孢外壁破損，破壞細胞膜的完整性，導致內容物泄漏，起到抑制芽孢生長或滅活的效果。

圖4 掃描電鏡觀察RLs對B.cereus芽孢形態的影響（×40 000）Fig.4 Effect of RLs on the morphology of B.cereus spores observed by SEM (× 40 000)

2.3 RLs對B.cereus芽孢內膜通透性的影響

當菌體死亡或細胞膜通透性改變時，PI染料能進入細胞與DNA結合，熒光顯微鏡觀察結果可以間接反映細胞膜通透性變化[22]。由圖5可知，對照組在顯微鏡下無熒光現象，表明PI未進入B.cereus芽孢內部，細胞生長狀態正常。芽孢經MIC和MBC的RLs處理后均觀察到紅色熒光，且MBC條件處理后的細胞紅色熒光顯著增強，表明RLs可以改變芽孢內膜通透性，且破壞程度與RLs濃度呈正相關。

圖5 B.cereus芽孢的熒光顯微鏡分析Fig.5 Fluorescence microscopic images of B.cereus spores

相對電導率是衡量細胞膜滲透性的指標之一，數值上升表明菌液中電解質增加，即細胞膜破損程度更加嚴重[23]。如圖6所示，所有組的芽孢菌液相對電導率隨時間延長均有所升高，但對照組在4 h后基本不增加，而MIC和MBC RLs處理的芽孢菌液相對電導率呈現持續升高趨勢，其中MBC組升高趨勢更為顯著。8 h時，MIC組相對電導率達到了20.86%，MBC組升至32.13%，進一步證實了RLs可以改變B.cereus芽孢內膜通透性，引起芽孢內電解質的泄漏。

圖6 RLs對B.cereus芽孢相對電導率的影響Fig.6 Effect of RLs on relative conductivity of B.cereus spores

2.4 RLs對B.cereus芽孢內大分子釋放的影響

蛋白質和核酸是細胞的重要大分子物質，對菌體生長繁殖起決定性作用[24]，測定不同處理時間后的芽孢溶液OD260nm和OD280nm，可以判斷芽孢內核酸和蛋白質的泄漏情況。由圖7可知，對照組的OD260nm和OD280nm呈現較低水平，而RLs處理后的芽孢菌液OD260nm和OD280nm明顯升高，且隨著RLs濃度增大和作用時間延長而提升，表明RLs對芽孢各層的通透性和完整性有明顯的破壞作用，導致核酸和蛋白質大量外泄，引起功能紊亂，影響芽孢生長。黃現青等[25]探究了表面活性素對B.cereus壁膜通透性的影響，發現150 μg/mL的surfactin顯著提高了芽孢核酸釋放量，與本研究結果一致。

圖7 RLs對B.cereus芽孢核酸和蛋白質泄漏量的影響Fig.7 Effect of RLs on the leakage of nucleic acids and proteins in B.cereus spores

2.5 RLs對B.cereus芽孢內ROS的影響

ROS是氧正常代謝的天然副產物，在細胞信號傳導和體內平衡中具有重要作用[26]。細胞受到外界的不良刺激時，ROS水平會急劇上升，表現出氧化應激現象[27]。如圖8所示，RLs處理60 min后，濾液的熒光強度開始顯著升高，且MBC處理組的熒光強度始終高于MIC組，表明RLs可以導致B.cereus芽孢產生氧化應激反應，引起芽孢發生不可逆損傷和死亡。Gut等[28]發現Nisin處理炭疽芽孢桿菌芽孢后同樣使其ROS大量增加，造成氧化應激現象。

圖8 B.cereus芽孢內ROS含量的變化Fig.8 Changes in ROS content of B.cereus spores

2.6 RLs對B.cereus芽孢內DPA釋放的影響

DPA是芽孢的核心組成成分，自身釋放會導致芽孢抗性降低[29]，測定DPA的釋放量可以評價芽孢的抵抗能力[30]。未處理的菌液經過121 ℃加熱20 min后，芽孢內DPA全部釋放，此時測得芽孢內DPA的總量為（166.83±1.44）μg/mL。由圖9可知，RLs處理會引起DPA的釋放，且高質量濃度的RLs促使DPA釋放量達到（86.11±2.01）μg/mL，約占總量的51.61%，表明RLs可以有效降低芽孢的耐熱性，從而加速芽孢損傷和失活。Dong等[31]選擇十六烷基三甲基溴化銨處理枯草芽孢桿菌芽孢，發現十六烷基三甲基溴化銨通過激發菌體釋放大量DPA進而導致菌體失活，與本研究結果類似。

圖9 B.cereus芽孢內DPA含量的變化Fig.9 Changes in DPA content of B.cereus spores

2.7 RLs對B.cereus芽孢表面疏水性的影響

表面疏水性是決定芽孢黏附性的重要影響因素之一[32]。根據表1可知，未經處理的B.cereus芽孢的RHS 59.938%，表現出較強的疏水性。而經RLs處理后，芽孢RHS顯著降低，MIC組降低至12.310%，MBC組下降至10.792%，分布在正十六烷中的芽孢比例顯著降低，芽孢表面由疏水向親水轉變。表明RLs可以降低芽孢與疏水表面和界面黏附能力，為減少B.cereus芽孢在食品加工中的污染提供潛在可能。

表1 RLs對B.cereus芽孢表面疏水性的影響Table 1 Effect of RLs on surface hydrophobicity of B.cereus spores

2.8 RLs對B.cereus芽孢DNA的影響

由以上結果可知，RLs具有透過芽孢內膜進入內部結構的潛力，猜測其可能與DNA發生作用，利用紫外光譜探究RLs與DNA之間的相互作用。從圖10可以看出，B.cereus芽孢DNA的最大紫外吸收峰隨著RLs處理質量濃度的增加呈降低趨勢，發生減色效應，表明RLs可以與B.cereus芽孢DNA分子發生作用。分析原因可能是RLs作為小分子物質競爭性地插入DNA的堿基對中，致使堿基對脫落，進而降低紫外吸光度[33]。

圖10 DNA與RLs作用后的紫外光譜變化Fig.10 UV absorption spectra of RLs interacting with DNA

3 結論

本實驗針對RLs對B.cereus芽孢的抑菌活性及芽孢壁膜的破壞作用展開研究，發現RLs可以有效抑制芽孢態B.cereus的生長，MIC和MBC分別為80.0 mg/L和160.0 mg/L，具有良好的抑菌活性。進一步研究RLs對芽孢態B.cereus的抑制機制，發現RLs處理后引起芽孢出現嚴重皺縮、凹陷和內膜破裂，導致芽孢內容物外泄。同時，RLs對芽孢內膜通透性和完整性均發生破壞，引起芽孢內電解質、核酸以及蛋白質等生物大分子物質的大量泄漏，導致芽孢的正常新陳代謝紊亂甚至失活。此外，RLs處理促使芽孢核心內的DPA大量釋放到外界環境中，顯著降低了芽孢抗性。RLs處理后的芽孢內ROS大量堆積，表現出氧化應激現象，降低菌體的代謝活性。RLs能夠有效降低芽孢的表面疏水性，從而降低其黏附能力，還可以與芽孢DNA相互作用并發生減色效應，導致菌體DNA結構受損，對DNA的功能造成干擾。

整體來看，本研究從細胞水平闡述了RLs對B.cereus芽孢形態的抑菌效果及機理，揭示了RLs可有效滅活芽孢的萌發，并對其各層結構均產生破壞作用；同時，RLs可以通過降低芽孢黏附性及熱抗性、加速胞內大分子物質外泄、產生氧化應激反應等多種途徑對芽孢造成損傷，可為RLs的抑菌研究提供理論依據。目前，為減少抑菌劑的使用量，多種殺菌技術聯合應用已逐步成為殺菌行業的關注點，后續可以對RLs與其他抑菌劑或物理抑菌方法的聯合應用展開深入研究。