乳腺熏洗方促進非哺乳期乳腺炎術后創面愈合網絡藥理學分析及臨床驗證

周悅，王錚，葉媚娜，吳晶晶，何斌俊，陳紅風

1. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032；2. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海 200025

非哺乳期乳腺炎（NPM）是一類發生在非哺乳期、非妊娠期的乳房慢性化膿性疾病[1]，臨床上較為少見。在歷代中醫文獻中，尚未查閱到與本病相似的病證記載。1985 年，上海中醫藥大學顧伯華、陸德銘教授根據本病的發病特點及臨床特點，將其命名為粉刺性乳癰[2]，包含現代醫學的肉芽腫性小葉性乳腺炎、導管周圍乳腺炎、乳腺導管擴張癥等[3]。NPM是乳腺疑難病癥，若治療不當，易反復化膿、破潰，嚴重影響乳房外形，給患者帶來極大的痛苦。上海市名中醫陳紅風教授傳承發展顧氏外科特色，以中藥內服結合“切擴-拖線-熏洗-墊棉”四聯外治法治療NPM，具有創傷小、痛苦輕、外形改變少、不易復發等顯著優勢[4]。本研究課題組長期致力于中醫藥內外結合治療NPM 各分期、各階段的臨床和基礎研究，取得了豐碩成果。在NPM 術后生肌收口期，四聯外治法中的“熏洗”療法發揮重要作用，能夠加快創面愈合速度、改善創面愈合質量，減少恢復后乳房外形的改變。

陳紅風教授自擬的乳腺熏洗方包含生黃芪、當歸、丹參、蒲公英、兒茶、澤蘭、郁金、桂枝8 味中藥，具有益氣活血、生肌斂瘡的功效。中藥熏洗療法結合了中醫外治法及現代機械技術的優勢，臨床應用廣泛。由于中藥復方成分復雜，治療作用具有多靶點、多途徑的特點，對創面局部微環境的調節機制不明確，因此在一定程度上限制了其發展和推廣。本研究采用網絡藥理學分析方法，探討乳腺熏洗方促進NPM 術后創面愈合的作用機制，了解乳腺熏洗方在乳房創面治療中的核心活性成分、調節的信號通路、可能干預的靶點等，并通過臨床研究進行驗證，以期為乳房創面治療提供科學的理論指導和評價指標。

1 研究資料與方法

1.1 網絡藥理學分析方法

1.1.1 乳腺熏洗方成分篩選與成分-靶點網絡構建通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索黃芪、當歸、丹參、郁金、澤蘭、兒茶、桂枝7 種中藥的化學成分，再根據化合物類藥性（DL）≥0.18 進行篩選，獲得活性化合物和對應的靶點基因。從文獻[5]中查閱“蒲公英”的有效成分，在有機小分子生物活性數據（PubChem）數據庫中查找到對應的簡化分子線性輸入規范（SMILES）結構，使用SwissADME數據庫分析這些化合物的活性，再根據化合物的結構和活性， 用小分子藥物靶點預測在線平臺（SwissTargetPrediction）預測其靶點。完成篩選后，通過Cytoscape 3.10.10 軟件構建化合物-靶點網絡。

1.1.2 創面愈合靶點篩選與成分-疾病-靶點網絡構建以“wound healing” 或“wound repair” 與“breast”或“mammary gland”為條件，在人類基因綜合分析數據庫（Genecards）中檢索疾病靶點，以同樣條件在藥物治療靶點（TTD）數據庫檢索疾病靶點，將獲取的基本靶點數據合并后刪除重復值，獲得最終靶點。再將乳腺熏洗方的成分靶點與乳房創面愈合靶點取交集，獲取共同靶點，整合分析后構建“藥物-成分-疾病”網絡圖。

1.1.3 乳腺熏洗方與創面愈合交集靶點PPI 網絡構建將共同靶點輸入STRING 數據庫，獲得蛋白質相互作用（PPI）網絡，再使用Cytoscape 3.10.10 軟件的CytoHubba 插件計算網絡自由度（degree）值，依據度值篩選出排名前20 位的靶點，繪制PPI 網絡圖。

1.1.4 基因本體（GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用DAVID數據庫和Metascap 數據庫對疾病-藥物潛在靶點進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析。將KEGG通路富集分析得出的主要信號通路與排名前20 位的靶點進行熱圖分析。

1.2 臨床研究驗證選取2023 年6 月23—30 日于上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫乳腺科住院，行切開擴創手術治療的4 例NPM 患者。待術后創面膿腐脫凈，處于生肌收口期時給予乳腺熏洗方治療。本研究通過上海中醫藥大學附屬龍華醫院醫學倫理委員會審批（2021LCSY047），并于中國臨床試驗中心注冊（ChiCTR2000035929）。

1.2.1 診斷標準NPM 的診斷標準參考《非哺乳期乳腺炎診治專家共識》[6]。術后創面生肌收口期的判斷標準參考《T/CACM 1186—2019 中醫外科臨床診療指南粉刺性乳癰》[7]。

1.2.2 治療方法所有受試者行擴創手術，術后常規換藥至膿腐脫凈。研究性治療從創面生肌收口期開始，給予乳腺熏洗方（處方：生黃芪、丹參、蒲公英各30 g，當歸18 g，郁金、澤蘭各15 g，兒茶12 g，桂枝9 g）熏洗創面，每天1 次，每次熏洗15 min，治療12 d。操作方法：每天1 劑，將上述中藥水煎取汁約400 mL，取200 mL 放入藥桶，加水至約1 000 mL，加熱至95 ℃，將藥桶與熏洗機管道相連接?；颊呷∑脚P位或斜臥位，暴露創口，熏洗機噴口距傷口25～30 cm，熏洗時以局部皮膚微微潮紅，無燒灼疼痛感為宜。熏洗后常規換藥，同時給予有益氣健脾、養血和營功效的中藥方水煎劑內服治療，每天1 劑，辨證加減用藥。

1.2.3 觀察指標創面組織血管內皮生長因子（VEGF）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）蛋白表達：在熏洗前、熏洗12 d 后，分別取創面肉芽組織（約0.5 cm×0.5 cm），凍存管封存、標記、移至-80 ℃冰箱備用。使用蛋白質印跡（Western blot）法檢測上述蛋白表達。

1.2.4 統計學方法臨床驗證部分的統計分析應用SPSS 27.0 軟件進行，用ImageJ 軟件分析出目的蛋白（VEGF、STAT3）和內參（β-actin）條帶灰度值，目的蛋白/β-actin 矯正誤差，所得結果代表目的蛋白相對含量，實驗數據以中位數（四分位間距）[M（IQR）]表示，2 組數據比較采用秩和檢驗。統計學檢驗取雙側顯著性水平α=0.05，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 研究結果

2.1 乳腺熏洗方成分-靶點關系網絡經篩選，乳腺熏洗方組方成分中有205 個化合物、531 個靶點符合條件。通過Cytoscape 3.10.10 軟件，將乳腺熏洗方中的8 種中藥、205 個化合物與531 個靶點構建藥物成分-靶點關系網絡圖，見圖1。乳腺熏洗方組方藥物的主要化合物成分見表1。

2.2 乳腺熏洗方藥物成分-靶點與乳房創面愈合靶點交集分析以“wound healing”或“wound repair”與“breast” 或“mammary gland” 為條件在Genecards 數據庫中檢索，獲得590 個疾病靶點，以同樣條件檢索TTD 數據庫獲得7 個疾病靶點，將以上靶點數據合并后刪除重復值，最終得到594 個乳房創面愈合靶點。將531 個乳腺熏洗方藥物成分靶點與乳房創面愈合相關靶點取交集，得到101 個共同靶點，繪制韋恩（Venn）圖，見圖2。

圖2 乳腺熏洗方與乳房創面愈合共同靶點韋恩圖

2.3 乳腺熏洗方與乳房創面愈合共同靶點的PPI 網絡構建對101 個靶點間的關系進行處理，將度值排名前20 位的靶點（見表2）輸入STRING 數據庫，繪制關鍵靶點相互作用關系圖，可視化呈現如圖3。將乳腺熏洗方與乳房創面愈合的共同靶點導入Cytoscape 3.10.10 軟件中，構建“藥物-成分-疾病”PPI 網絡圖，可視化呈現如圖4。

圖3 關鍵靶點相互作用關系圖

圖4 “藥物-成分-疾病”PPI 網絡圖

表2 乳腺熏洗方與乳房創面愈合共同靶點（前20）

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析利用DAVID 數據庫和Metascap 數據庫對疾病-藥物潛在靶點進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析。從參與的生物學過程（BP）、具有的分子功能（MF）和所處的細胞組分（CC）3 個方面對乳腺熏洗方的靶蛋白基因進行分類。GO 條目富集程度較高的BP 包括環化酶活性的正向調節、參與傷口愈合的炎癥反應等；MF 包括受體結合（趨化因子、表皮生長因子）、一氧化氮合酶活性等；CC 主要涉及質膜區、質膜外側、整合素復合物等。最顯著富集的前6 個BP、MF 和CC 的GO 條目見表3，可視化呈現如圖5。

圖5 GO 功能富集分析柱狀圖

表3 GO 功能富集分析結果（前18）

KEGG 通路富集分析得到176 條通路，根據對數P值（LogP）值、富集分數及基因數目，篩選出20 條信號通路。氣泡大小代表相應通路的目標基因數量，氣泡顏色代表富集顯著性，可視化呈現如圖6。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

將20 條信號通路與關鍵靶點進行熱圖分析，可見關鍵靶點與VEGF、缺氧誘導因子-1（HIF-1）、白細胞介素（IL）-17、腫瘤壞死因子（TNF）以及糖尿病并發癥相關高級糖基化終末產物-受體（AGERAGE）信號通路密切相關，見圖7。

圖7 關鍵靶點與主要通路關系圖

2.5 創面組織蛋白表達驗證依據上述分析結果，對VEGF 通路的關鍵蛋白進行臨床驗證。通過蛋白質印跡法檢測NPM 術后患者治療前后創面肉芽組織中VEGF、STAT3 蛋白的表達水平。治療后，VEGF、STAT3 蛋白表達水平均較治療前升高（P＜0.05）。具體數據見表4。蛋白質印跡法電泳結果見圖8。

圖8 VEGF、STAT3 蛋白表達

表4 NPM 術后患者治療前后創面VEGF通路相關蛋白表達比較[M（IQR）]

3 討論

中藥熏洗療法歷史悠久，相關記載最早見于《五十二病方》[8]?！夺t宗金鑒·外科心法要訣》記載“滌洗之法，乃瘍科之要藥也”，指出中藥熏洗療法在治療外科瘡瘍疾病方面起重要作用[9]。

隨著中醫外治法研究技術手段的發展，中藥熏洗療法已成為具有理論指導和技術支持的特色外治法，臨床應用范圍也逐漸擴大?，F代中藥熏洗療法是一種結合藥力、機械熱力共同作用的綜合性治療方法，在促進創面愈合方面，中藥熏洗能通過加快局部和周身的血液循環和新陳代謝速度，改善局部組織營養和全身機能狀態，達到治療目的。應用不同的藥物、復方煎湯熏洗，治療作用各不相同，如清熱解毒中藥可殺菌、抗炎，清潔創面；益氣化瘀中藥可改善創面血液供應和組織營養狀況，促進創面肉芽組織生長及上皮組織爬生[10]。

陳紅風教授自擬的乳腺熏洗方，以生黃芪為君藥，味甘，性微溫，為補中益氣之要藥，善補肺、脾之氣，具有固表止汗、托毒生肌、利水消腫、生津養血、行滯通痹、斂瘡生肌等功效，《神農本草經》將其列為上品?，F代藥理學研究發現，黃芪的主要活性成分為多糖類、三萜皂苷類、黃酮類化合物[11]，黃酮類化合物可用于創面治療[12]。當歸、丹參、蒲公英為臣藥，當歸配伍黃芪，既能活血消腫，又能補血生肌?，F代藥理學研究表明，黃芪-當歸藥對的益氣作用主要表現為調節物質能量代謝及免疫功能，活血作用的主要表現為降低血黏度，亦可通過抗氧化應激、抗炎、保護血管壁、干預血管生成等發揮作用[13]。丹參味苦，性微寒，既涼血又活血，能清泄瘀熱而消癰腫，《日華子本草》言其能“排膿止痛，生肌長肉”?，F代藥理學研究表明，丹參含丹參酮類、丹參酚酸、揮發油類、多糖類和含氮化合物等化學成分，具有抗凝血、抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用[14]。蒲公英清解、降泄并用，可清熱解毒、消癰散結兼疏肝解郁、通乳，為治療乳癰之首選，《本草備要》言其“專治癰腫疔毒”；蒲公英是具有抗炎作用的代表中藥之一，蒲公英多糖能顯著抑制巨噬細胞的炎癥因子，如一氧化氮、IL-6、IL-1β、TNF-α 等[15]。兒茶為佐藥，具有活血療傷、止血生肌、收濕斂瘡的功效，外用可治療多種外科瘡瘍，《本草綱目》言其可用于“涂金瘡，一切諸瘡”，有“生肌定痛，止血，收濕”之功。郁金既能行氣活血，又能清熱涼血。郁金中的化學成分種類較多，主要有倍半萜類、單萜類、二萜類、多糖類、甾醇類、姜黃素類、生物堿類、油樹脂、多肽類等，具有抗炎、鎮痛、抗氧化等作用[16]。桂枝能溫通經脈，又具有散寒止痛之效。通過數據挖掘技術分析黃芪常用對藥發現，當歸、防己、桂枝、丹參、葛根、甘草、白術7 味中藥與黃芪配伍的頻率較高，黃芪配伍桂枝的抗炎作用顯著[17]。澤蘭為使藥，善活血祛瘀、消腫止痛，在本方中，澤蘭與桂枝、丹參、郁金、當歸等具有活血化瘀功效的藥物合用，可溫寒散血，宣導其活血之力，防止凝聚之虞，增強其他藥物的活血化瘀作用。

本研究通過網絡藥理學分析得到乳腺熏洗方的主要化合物成分有：芒柄花素（黃芪）、毛地黃黃酮（黃芪、丹參、蒲公英）、槲皮素（黃芪、兒茶、蒲公英）、山柰酚（黃芪、兒茶）、脫氫丹參酮（丹參）、丹酚酸（丹參）、芹黃素（丹參、蒲公英）、齊墩果酸與熊果酸（丹參、澤蘭）、芫花素（蒲公英）、β-谷甾醇（當歸、郁金、澤蘭、桂枝）、兒茶素（兒茶、桂枝）等。組方中有多種中藥含有黃酮類化合物，如芒柄花素、槲皮素、毛地黃黃酮、山柰酚、芹黃素、芫花素等，黃酮類化合物可以抑制炎性生物酶的滲出，緩解炎癥造成的局部腫脹，并且具有調節免疫、抗氧化的作用[18]。丹參中含有丹參酮類化合物、丹酚酸，可以抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和分化，具有調節血管微循環的效果[19]；丹酚酸具有促進創面肉芽組織生長的作用，主要依靠增強血管活性來發揮藥效[20]。齊墩果酸存在于丹參、澤蘭中，具有膜穩定作用，可使肥大細胞難以脫顆粒和釋放炎性反應遞質，臨床上也用于骨關節炎等疾病的治療[21]。

在基因蛋白層面，乳腺熏洗方發揮作用的靶點中，有101 個與乳房創面愈合相關，對排序前20 位的靶點行PPI 網絡分析，這些關鍵靶點主要為基質金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）、細胞因子[IL-1β、IL-6、表皮生長因子受體（EGFR）、轉化生長因子-β（TGF-β）、TNF、成纖維細胞生長因子2（FGF-2）等]、黏附分子（ICAM-1）和一些信號轉導蛋白（STAT3、MAPK）等。STAT3 蛋白信號傳導與細胞增殖、分化及凋亡等密切相關，在調控創面愈合方面，通過Jaks 磷酸化或直接二聚化STAT3 蛋白，可以激活HIF-1 DNA轉錄，上調HIF-1 蛋白水平，進而激活VEGF DNA轉錄，上調VEGF 表達，介導血管內皮細胞的新生[22]。STAT3 蛋白也是介導IL-1β、IL-6、TGF-β 等炎性細胞因子功能的主要調節蛋白[23-24]。此外，TNF-α和IL-1β 會抑制TGF-β 誘導的p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路激活，導致神經生長因子表達降低，造成創面愈合延緩[25]。由此，從分子層面推測，乳腺熏洗方可能通過抗炎、促進血管生成和肉芽組織修復等機制，起到促進乳房創面愈合的作用。

在功能作用層面，GO 功能富集分析篩選出的前18 個條目（BP、CC、MF 排序前6 位）和KEGG 通路富集分析篩選得到的前20 條信號通路，主要涉及炎癥反應、氧化應激反應、免疫反應、細胞增殖和凋亡等，VEGF、HIF-1 等信號通路均為創面愈合研究的經典通路[26]。提示乳腺熏洗方可能通過調控VEGF、HIF-1、IL-17、AGE-RAGE、TNF 等信號通路發揮促進乳房創面愈合的作用。通過調控炎性介質與細胞因子的合成和分泌、改善創面血供和微循環、改善創面營養等措施，從整體上改善創面愈合微環境，進而促進創面愈合。

網絡藥理學分析得出乳腺熏洗方促進NPM 術后創面愈合的關鍵靶點和調控的信號通路，對這些候選靶點做進一步臨床驗證才是關鍵。因此，本研究的第二部分基于網絡藥理學分析結果，選擇VEGF信號通路的STAT3、VEGF 蛋白進行精確驗證，發現使用乳腺熏洗方熏洗12 d 后，NPM 術后患者創面肉芽組織的VEGF、STAT3 蛋白表達均較治療前上升。但乳腺熏洗方促進NPM 術后創面愈合的機制復雜，是多因素、多途徑共同作用的結果，未來可設計前瞻性隊列研究，更深入地探討乳腺熏洗方對創面微環境的調節機制。

雖然中藥熏洗療法促進創面愈合的療效顯著，但仍缺乏深入的機制研究。由于使用的外用中藥有些為經典方劑或院內制劑，有些為經驗方，用藥劑量不統一，用藥的有效性尚待驗證?；诙喾N生物信息學方法的網絡藥理學分析，被認為是研究中藥復方作用機制的有效方法。如何將新設備、新技術與外用中藥相結合，對中醫外治法加以完善和改進，更有效地發揮其多靶點、多環節、多層次的綜合調控作用，可能是未來中醫外治法促進創面愈合研究的方向。