同種異體骨軟骨移植修復關節軟骨損傷的生物安全問題

田志,段王平,馬永勝,張城銘,衛小春

(山西醫科大學第二醫院骨科,骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室,山西 太原 030001)

同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)是從組織供者獲得整塊軟骨和軟骨下骨來精確修補受損的關節軟骨,是一種針對局限性大塊關節軟骨損傷的有效治療方式[1]。主要用于青壯年大面積軟骨損傷以及微骨折、細胞治療失敗的軟骨損傷患者[2]。OCA具有不受供區取材限制、提供與損傷部位相同曲度的關節面、骨融合率高、臨床結果可靠等技術優勢,在軟骨損傷修復領域受到廣泛關注[3-5]。但OCA的本質是異體移植,涉及移植物的采集、處理、保存、運輸、手術等一系列過程,保證其生物安全極其重要。OCA生物安全檢測是保證其生物安全的關鍵環節,包括供體生物安全檢測,軟骨組織儲存、處理過程中的生物安全檢測,受體的生物安全監測,軟骨移植過程中生物安全體系建設。本文對OCA修復關節軟骨損傷的相關生物安全內容綜述如下。

1 供體的生物安全

1.1 一般情況篩查

移植物供體的篩選過程應非常嚴格,內容包括：年齡、死因(現病史)、既往史(遺傳病史、傳染病史、慢性自身免疫疾病病史)、外傷及手術史,是否經歷過關節手術甚至重癥監護病房(intensive care unit,ICU)治療;還要對供者四肢關節情況進行評估,家族史等進行調查[6];了解供者有無人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病(hepatitis C virus,HCV)、結核病或其他傳染性疾病的接觸史;有無非法藥物的濫用史、冶游史甚至同性性行為史;有無動物飼養史、接觸史(特別是家禽類,如雞、鴨、鵝等;家畜類,如豬、羊、牛、狗及嚙齒類動物等),為進一步的實驗室篩查提供依據[7]。對昏迷及死亡的供者需明確導致其昏迷或死亡的原因,包括：疫苗接種史、血制品應用史、感染性疾病史、職業暴露史等。同時明確供者的五年內旅居史,排除地方性感染暴露的風險。針對地方性感染暴露史,需要采取針對性、目的性強的供者篩查手段或者受者預防措施來預防地方性傳染病及人畜共患疾病的傳播。

1.2 實驗室檢查

1.2.1 一般常規檢測 對所有供者都應常規檢測C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)和血常規。CRP是敏感但特異性不高的炎癥指標,CRP≥40 mg/L提示存在感染;≥100 mg/L提示有膿毒癥或侵襲性感染可能。血常規主要包括白細胞計數(white blood cell,WBC)和分類計數(包括粒細胞、淋巴細和單核細胞)。對于WBC增多(≥10.0×109/L)或減少(≤3.0×109/L),或者出現“核左移”時,提示可能有感染發生[8]。

1.2.2 病毒學檢測 由于病毒培養技術復雜、要求高,常見血源性傳播的病毒性疾病主要依靠血清學檢測發現。核酸檢測(nucleic acid tests,NAT)可用于發現常規血清學篩查漏診的感染[9-11]。關節軟骨供者需進行篩查的血清學檢查包括：HIV抗體;HBV的血清學檢測,包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;HCV抗體;梅毒螺旋體和非梅毒螺旋體檢測(螺旋體血球凝集試驗或密螺旋體顆粒凝集試驗或熒光密螺旋體抗體吸收試驗+快速血漿反應素試驗);巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)抗體;EB病毒(epstein-barr virus,EBV)抗體[9-11]。其他針對病毒感染傳染性疾病和人畜共患病可以進行篩查的檢測包括：HIV、HCV和/或HBV的NAT;人類嗜T淋巴細胞病毒(human T-cell lymphotropic virus,HTLV-1/2)抗體;單純皰疹病毒IgG抗體;水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)抗體;西尼羅河病毒(west nile virus,WNV)的血清學檢測或NAT;球孢子蟲血清學、類園線蟲血清學和克氏錐蟲血清學檢測;其他人畜共患疾病,如動物源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染檢測[9-11]。

1.2.3 細菌學檢測 2012年一項大樣本量骨移植物易感染性分析結果顯示：移植物細菌感染情況與骨軟骨組織采集團隊的組織獲取經驗、組織采集時間及移植物來源相關;高毒力致病菌(鏈球菌、大腸桿菌等)感染與供者死亡時間、ICU治療史、組織采集部位等相關;低毒力致病菌與組織采集環境、方法、時間、消毒方式相關[12]。除常規實驗室檢測外,血液學檢測還應包括真菌感染以及特殊細菌感染檢測等：(1)降鈣素原(procalcitonin,PCT)：目前臨床常用的判斷膿毒血癥的生物標記物,當PCT≥2 μg/L時,提示供體可能存在膿毒癥,同時PCT數值與感染嚴重程度正相關;(2)(1,3)-β-D-葡聚糖試驗(G試驗)：適用于深部真菌感染的早期診斷(不包括隱球菌和接合菌),敏感性較高但易出現假陽性結果(如鏈球菌血癥),只能提示有無真菌侵襲性感染,不能確定感染真菌種類,目前認為其陰性預測值高;(3)半乳甘露聚糖試驗(galactomannan,GM試驗)：為侵襲性曲霉菌感染的早期診斷提供依據,臨床上通常與G試驗聯合檢測,可以提高對侵襲性真菌病的診斷能力;(4)隱球菌莢膜多糖抗原測定：新型隱球菌檢測的生物標記物,可早期、快速診斷隱球菌感染;(5)γ-干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay,IGRAs)：對輔助診斷活動性結核病與潛伏性結核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)有一定參考價值[8]。除以上血清學檢測,還需對供體血液進行細菌培養檢測,同時記錄取材的關節軟骨大體觀察結果。

2 軟骨組織處理、儲存過程中的生物安全

軟骨采集、處理應在具有骨軟骨采集、保藏資質的保藏機構、實驗室或醫療機構中進行,由具有器官、組織采集操作許可的專業人員操作。為了便于病原體檢測,采集樣本應包括：軟骨、骨組織收集、轉運、儲存過程中常規留取供者的外周血、血清及骨軟骨組織進行病原微生物檢測或培養;同時可考慮采集供者滑膜組織、關節液、松質骨(部分椎體、髂骨)等標本,積極尋找潛在的病原微生物,為后續監測、治療提供指導;軟骨-骨組織、軟骨-骨組織拭子、軟骨-骨組織保存液的細菌、真菌以及病毒培養也應列為生物安全評估的常規檢查手段[9],但由于低毒力致病菌與組織采集污染相關性較高,其培養結果需結合血液學標志物檢測結果共同納入參考標準[12]。常規細菌微生物檢測方法包括：(1)直接涂片染色鏡檢：革蘭染色、抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色、六胺銀染色等能快速檢測所提供樣本中普通細菌、抗酸桿菌、查奴卡菌、新型隱球菌、肺孢子菌等可能的病原體信息,但確診仍需要進一步診斷依據;(2)培養：采集供者血液、關節液等無菌體液、骨軟骨組織保藏液、灌洗液及拭子等進行細菌和真菌培養;(3)基于核苷酸分子技術原理的病原菌快速檢測方法：如環介導恒溫擴增技術、微流控碟式芯片反應檢測技術、多重巢式聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術、實時熒光定量PCR技術、質譜技術。這些快速檢測方法可以明顯縮短病原菌的鑒定時間,對常見的臨床常見細菌、真菌及罕見菌進行檢測,如腸球菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌等[13]。

3 軟骨移植過程中受體的生物安全監測

盡管需進行嚴格的生物安全篩查,但仍然需要向受者、受者家屬強調骨軟骨移植過程中有潛在的細菌和病毒傳播風險,且病原體來源、發病時間及感染性疾病轉歸等風險無法量化[14]。受者年齡、全身一般情況、慢性病史(包括糖尿病史、全身或局部感染史甚至口腔感染史)均會對上述風險造成影響。

受體在移植后的1年內的感染風險較大,血清學常規檢查和血液培養應納入常規監測范圍,血液培養可以檢測到常規檢測漏掉的感染情況?？紤]到部分合并軟骨下骨移植受者可能需要接受免疫抑制治療,對病原體的免疫反應較弱,樣本采集時間和頻次為：骨軟骨移植前期、移植過程中、移植后1個月、移植后3個月、移植后6個月、移植后1年、移植后2年分別采集1次,之后每間隔2年采集1次[15]。對于一些有糖尿病史、免疫抑制劑使用史的受者,樣本采集的頻次需要增加。主動篩查及被動篩查過程包括常規實驗室檢測,以及一系列針對性強的目的性實驗室檢測?；诠擒浌且浦矌?、骨軟骨移植管理平臺的建設和完善,對日常收集的臨床、實驗室檢測信息數據進行整合分析,排除可能出現骨軟骨移植相關的潛在疾病、新興疾病,如人源性或動物源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染檢測。

4 生物安全監測體系建設

骨軟骨移植生物安全體系廣義上應包括：制定人體骨軟骨組織移植法律、法規、管理條例等;完善人體組織尤其是骨軟骨組織移植行業標準、從業規范、管理制度;建立常規行業監督制度、從業人員培訓考核制度、人體組織捐贈及獲取管理制度、骨軟骨移植組織庫管理制度等。

人體組織移植法律、法規、管理條例方面,目前中國未對人體組織捐獻和移植頒布明確的法律、法規。參考2023年《人體器官捐獻和移植條例》,骨軟骨移植過程中,軟骨組織捐獻應當遵循自愿、無償的原則。條例明確規定從事遺體、器官、組織移植的醫療機構需具備所需的設備、設施、技術人員支持;符合人體器官、組織移植倫理審核;完善、健全的器官、組織獲取質量管理和控制制度。遺體器官應通過國務院衛生健康部門建立的分配系統統一分配;嚴格執行器官及組織獲取、運輸、保藏審核登記制度,移植醫師培訓考核制度,接受移植患者資格審核、費用監督、生物安全監測制度。從移植職業機構、供者、受者等多方面監管軟骨采集、運輸、儲存、移植過程。

20世紀90年代末,在美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)的監督下美國組織庫協會(American association of tissue banks,AATB)建立了完整的軟骨獲取、加工、儲存流程,使得OCA移植在臨床商業化應用成為可能。隨著OCA移植的推廣、普及,鑒于軟骨組織供體的不可控性,行業標準、從業規范、管理制度、監督制度、從業人員培訓考核制度、人體組織捐贈及獲取管理制度應參考更為嚴格的質量控制(quality control,QC)標準甚至異種移植相關的標準操作程序(standard operating procedure,SOP)[15]。綜合考慮以下幾個方面：

(1)風險評估。需同時考慮到個體健康、公眾健康的生物安全,說明可能出現的不確定事件及后果,包括：免疫排斥反應;潛在未知細菌、病毒、真菌等微生物傳播可能導致的局部感染、全身感染、甚至移植失敗;潛在未知傳染性病原體傳播可能會導致的人或動物源性傳染病,以及新病原體的隱形傳播。

(2)傳染性病原體細菌、病毒、真菌等篩查。實施病原體篩查的機構需具有成熟的病毒學、細菌學微生物實驗室,對特定病原體、傳染性病原體和動物源性潛在病原體進行檢測;擁有新病原體、難培養病原體甚至病毒分離、培養、鑒定等相關知識、技能和經驗的實驗人員,能區分人源性或動物源性病原體是來自供體或受體本身,如人源巨細胞病毒和動物源巨細胞病毒的區分[15]。

(3)病原體感染監測。在疑似出現同種或異種感染,以下兩種情況應立即通知受者,預警密切接觸人員并上報監管機構：①不易被識別的非異種感染病原體;②已被鑒定清楚的潛在異種感染病原體。當受者出現病原體感染癥狀時,在進行常規診斷檢查的基礎上,應啟動持續篩查程序。骨軟骨移植實施醫療機構需說明和執行篩查程序,列明供體來源、使用軟骨的部位、數量、移植時間。通過骨軟骨移植庫、骨軟骨移植管理平臺的建設和完善,達到滿足常規樣本采集、潛在感染人員監測等主動、被動篩查程序順利實施。

(4)病原體感染處理。同時應注意逆轉錄病毒(包括同種、異種逆轉錄病毒)的傳播風險,如PERV感染問題。需制定相應方案以解決受者PERV以及相似的病毒類病原體檢測陽性的情況,包括：鑒別假陽性,當證實病毒來源于被感染的人類細胞后,應繼續對病毒進行分離;對造成感染的病毒病原體進行鑒定,當新病原體、難培養病原體、異種病原體等感染發生時,需對所鑒定出的病原體進行特異性說明、制定計劃上報上級監管部門、相關的醫療衛生機構和倫理審查委員會,制定臨時計劃并修改臨床研究方案,必要時暫?；蚪K止項目;在骨軟骨移植過程中對受者提供應急方案以及后續醫療、護理以及心理咨詢;制定骨軟骨移植管理辦法保護受者、供體采集人員、手術和護理參與人員等密切接觸人員以及公共健康安全[15]。

(5)骨軟骨移植登記、管理服務平臺。包括：受者術前關節液、血樣、分離血漿等樣本留取、保藏工作;受者常規樣本采集以及高危無癥狀受者針對性樣本采集計劃;死亡受者尸檢檔案計劃,包括組織病理學檢查和病原體培養,受者樣本采集部位包括骨軟骨移植物本身和移植物相關的、導致受者死亡的主要器官;基于骨軟骨移植登記、管理服務平臺擬定規范、標準流程,建議樣本采集流程達到生物安全等級二級水平,檢測流程遵守生物安全等級三級的要求;歸檔樣本均應在-70 ℃以下保存50年以上或直至受者死亡[15]。

針對骨軟骨移植操作、保藏及預后的復雜性,應注重骨軟骨移植相關的受者及密切接觸人群隨訪問題：受者和與受者有體液接觸、以及有皮膚或黏膜接觸的護工和實驗人員等親密接觸的人群同為風險人群,均可能面臨機會性感染甚至人畜共患感染的風險;風險人群與受者接觸需采取防護措施,防止傳染性病原體的傳播;風險人群應延遲涉及體液或其他身體器官的捐獻行為;骨軟骨移植受者須同意將風險告知風險人群并接受定期進行臨床、實驗室檢查、樣本采集以及終身回訪;受者應被告知采集和歸檔的樣本將被抽查檢測,用于評估疾病、病原體感染狀態以及科學研究;受者有責任向監管部門上報其住址和電話的變更情況,以便進行終身回訪,受者應同意其醫療信息可被相關公共衛生部門查詢,并在法律法規允許的范圍內對其信息保密[16]。

同種異體骨軟骨的生物安全檢測,要求供者年齡一般在15～45歲,排除風濕免疫疾病及腫瘤疾病史,取軟骨部位關節軟骨完整、無明顯退行性變;排除供者細菌感染史、全身感染及局部感染;排除供者病毒感染史,包括DNA病毒、RNA病毒。這些流程盡量在指定的中心或組織庫進行,才能保證獲取組織的安全性和質量[5]。

異體軟骨來源相對豐富,其生物學特征和形態結構與自體軟骨相似,是替代自體軟骨移植的主要材料。但同種異體軟骨移植所帶來的生物安全問題是一個需要高度重視的問題,如何規范軟骨移植生物安全監測體系,從而降低其潛在的生物安全風險是目前臨床、科研、社會工作者亟待解決的重要課題。