基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 的疏肝和胃湯化學成分、HPLC 指紋圖譜、化學模式識別及含量測定研究

袁傳裕，胡俊杰，李 娟，劉焱文，劉松林，陳 新

湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430065

疏肝和胃湯（Shugan Hewei Decoction，SHD）是國醫大師梅國強教授在經典名方四逆散的基礎上加味而成，由柴胡、白芍、甘草、枳實、木香、郁金、吳茱萸、白術、黃連、砂仁10 味藥組成；具有疏肝解郁、調達肝氣、行氣散結、除痞導滯、養血滋肝、柔肝止痛、解胃脘氣滯、痞脹不舒的功效，全方疏肝理氣、健脾和胃，主要用于治療“肝郁氣滯”所致的抑郁癥[1]。本課題組前期研究發現，SHD能夠調節抑郁大鼠下丘腦-垂體- 腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能，提高腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、N-甲基-D-天冬氨酸受體1（Nmethyl-D-aspartate receptor，NMDAR1）蛋白表達水平，保護神經元；也可改善肝臟病理狀態，調節大鼠氨基酸代謝、能量代謝和甘油磷脂代謝以減輕抑郁癥狀[2-3]?；谖墨I考證和課題組前期研究，SHD全方藥材數量較多，成分較復雜；其主要成分尚不清楚，進而影響到與其質量控制相關的含量測定。液質聯用技術具有高效、高分辨率、高選擇性、高靈敏度等優點，已廣泛應用于中藥復方的化學成分分析[4-5]。指紋圖譜技術在中藥質量評價、真偽鑒別等領域應用廣泛[6-7]。本研究基于UPLC-Q-TOFMS/MS 技術，對該方中化學成分進行定性鑒別，同時利用HPLC 建立了SHD 的指紋圖譜，并結合3種化學模式識別進行多維度質量評價，且對其中9個成分的含量進行測定，為SHD 后期深入研究以及新藥開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1290 Infinity II 液相色譜系統、6540 四級桿-飛行時間（Q-TOF）液質聯用系統、MassHunter Acquisition 色譜工作站、1260 液相色譜系統，美國Agilent 公司；Heal Force Smart 超純水系統，武漢力康生物醫療科技有限公司；MS105DU 型電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；YS0203 型超聲波清洗機，深圳云奕科技股份有限公司。

1.2 材料

對照品芍藥苷（批號M28GB143089，質量分數≥98%）、檸檬苦素（批號H23J9K65962，質量分數≥98%）、白術內酯II（批號J18HB173939，質量分數≥98%）、甘草苷（批號Z10J8X39611，質量分數≥98%）、槲皮苷（批號J12H13186308，質量分數≥98%）、橙皮苷（批號K09S11L123847，質量分數≥98%）、小檗堿（批號S01A10K94340，質量分數≥98%）、柚皮素（批號L21O10Q100513，質量分數≥98%）、木香烴內酯（批號J22GB152186，質量分數≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；用于質譜的甲醇、乙腈購自德國默克公司；甲酸購自美國邁瑞達公司；用于HPLC 的甲醇、乙腈購自德國默克公司；其他試劑為分析純。

1.3 藥材

10 種飲片均由湖北中醫藥大學李娟教授鑒定為正品。柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根（批號202301006、230202201，產地河北；批號C089221202，產地山西）；甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖（批號230201、C201230101，產地新疆；批號202301018、202302021，產地內蒙古）；白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根（批號230201、202302009、C035220602，產地安徽）；木香為菊科川木香屬植物木香Aucklandia lappaDecne.的干燥根（批號2322050101、202111001、230201、220401，產地云南）；枳實為蕓香科柑橘屬植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果（批號2322120127、2222040206，產地湖北）；吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果實（批號202301004、230101、C554221201，產地江西）；白術為菊科蒼術屬植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖（批號C039230201，產地安徽；批號202306012、202303027，產地浙江）；郁金為姜科姜黃屬植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥塊根（批號202112010、202206008、220800181，產地廣西；批號230101，產地四川）；砂仁為姜科豆蔻屬植物陽春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實（批號221103321、202210027，產地廣東；批號202111011，產地云南）；黃連為毛茛科黃連屬植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖（批號C806221101、221201451、C806221101，產地四川）。SHD 的各個藥材組合見表1。

表1 SHD 的藥材組合Table 1 Combination of SHD medicinal materials

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 成分鑒定 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～5 min，5%乙腈；5～15 min，5%～35%乙腈；15～18 min，35%～45%乙腈；18～22 min，45%～55%乙腈；22～27 min，55%～95%乙腈；27～32 min，95%乙腈；32.1～37 min，95%～5%乙腈；體積流量為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

2.1.2 指紋圖譜及含量測定 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫為0～15 min，5.0%～12.7%乙腈；15～18 min，12.7%～12.8%乙腈；18～22 min，12.8%～16.0%乙腈；22～23.3 min，16.0%～16.1%乙腈；23.3～25.5 min，16.1%～16.3%乙腈；25.5～33 min，16.3%乙腈；33～55 min，16.3%～17.9%乙腈；55～70 min，17.9%～26.0%乙腈；70～72 min，26.0%～31.0%乙腈；72～78 min，31.0%～33.0%乙腈；78～80 min，33.0%～35.0%乙腈；80～83 min，35.0%～45.0%乙腈；83～87 min，45.0%乙腈；87～100 min，45.0%～47.0%乙腈；100～108 min，47.0%～57.0%乙腈；108～113 min，57.0%～70.0%乙腈；113～116 min，70.0%～75.0%乙腈；116～120 min，75.0%～95.0%乙腈；120～125 min，95.0%乙腈；125～125.01 min，95.0%～5.0%乙腈；125.01～130 min，5.0%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；變波長檢測：0～27 min，225 nm；27～76 min；210 nm；76～82 min，287 nm；82～130 min，210 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；采集模式為正、負離子模式；質量掃描范圍m/z50～1 500；去溶劑氣流溫度320 ℃；去溶劑氣流體積流量8 L/min；鞘氣溫度280 ℃；鞘氣體積流量11 L/min；噴霧器壓力275.79 kPa（40 psi）；毛細管電壓4 000 V（負離子模式3 500 V）；噴嘴電壓1 000 V（負離子模式1 500 V）；碎裂電壓150 V。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 成分鑒定 稱取芍藥苷、柴胡皂苷A、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、甘草次酸、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、白術內酯II、木香烴內酯對照品適量，加甲醇制成質量濃度約1 mg/mL 的對照品溶液。

2.3.2 指紋圖譜及含量測定 精密稱定芍藥苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、白術內酯II、木香烴內酯對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為3 058.00、2 666.00、290.30、348.20、1 330.00、304.00、642.00、118.40、4.69 μg/mL的對照品儲備液。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 成分鑒定 取柴胡10 g、白芍10 g、炙甘草6 g、麩炒枳實10 g、郁金10 g、木香10 g、麩炒白術15 g、砂仁10 g、吳茱萸6 g、黃連6 g，置于圓底燒瓶中，加入10 倍藥材質量的純化水，回流提取4 h 后，紗布濾過，取清液，濃縮至約400 mL，冷凍干燥，得到SHD 凍干粉（收率49.3%），稱取12 mg，用50%甲醇定容至5 mL，超聲（500 W、240 kHz）15 min 后過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.2 指紋圖譜及含量測定 按“2.4.1”項下處方比例稱取SHD 全方置于圓底燒瓶中，加入10 倍藥材質量的純化水，回流提取4 h 后，紗布濾過，取清液，冷卻至室溫后精密吸取5 mL，置于100 ℃水浴鍋上揮干溶劑，殘渣加50%甲醇水溶液復溶，定容至10 mL，超聲（500 W、240 kHz）15 min，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

3 結果

3.1 SHD 中化合物的指認與鑒定

取對照品溶液、供試品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件與“2.2”項下的質譜參數進行測定，所得一級正、負離子模式下的基準峰強度（base peak intensity，BPI）圖見圖1。通過分析一級所得的化合物分子離子與二級模式下的碎片離子峰，比較已有對照品與樣品的保留時間并參考相關文獻，從SHD 中鑒定出88 種成分，包括26 個黃酮類成分、27 個萜類成分、18 個生物堿類成分、6 個香豆素類成分、6 個有機酸類成分、2 個苯丙素類化合物、4個其他類成分。其中4 個來自柴胡，4 個來自白芍，16 個來自甘草，21 個來自枳實，13 個來自黃連，7個來自白術，1 個來自砂仁，4 個來自郁金，14 個來自吳茱萸，7 個來自木香。結果見表2。

表2 SHD 的UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析結果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS qualitative analysis results of SHD

3.1.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為基本母核的一類多酚化合物，多以糖苷的形式存在于植物體內。其基本碳架結構為C6-C3-C6[21]。根據B 環的取代位置和C 環C-2 和C-3 位的還原情況可將黃酮分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮、二氫查爾酮、花色素等[22]。

從SHD 共鑒定出黃酮類化合物26 個，按其結構類型可分為黃酮11 個、黃酮醇4 個、二氫黃酮8個、異黃酮3 個、黃烷酮1 個。根據黃酮C 環和A環上的取代基差異可將黃酮簡單地分為羥基取代黃酮、甲氧基取代黃酮、黃酮苷等。相似的，黃酮類化合物會出現丟失C-4 位羰基，即M－CO，C 環形成呋喃環；也可同時丟失C-1 位O 和C-4 位羰基，即M－CO2，C 環形成四元烯烴環。還可發生逆迪爾斯-阿爾德（retro Diels-Alder，RDA）重排，C 環1、2 位與3、4 位斷開，C 環上的2、3 位形成中性分子并連同B 環丟失，C 環1 位O 與4 位羰基相連，生成四元丙內酯環。羥基取代黃酮在分子結構中含有鄰二羥基時可發生脫水重排，即M－H2O，但在一些黃酮苷類化合物中，由于糖基上與黃酮苷元的雙羥基在空間上臨近，也可發生脫水重排；甲氧基取代黃酮由于O 元素的強電負性，易發生MCH3·的異裂[23-24]。以黃酮類成分橘皮素為例，正離子模式出現分子離子峰m/z373 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z358 [M＋H－CH3]+、345 [M＋H－CO]+、343 [M＋H－2CH3]+、329 [M＋H－CO2]+、211 [M＋H－2CH3－C9H8O]+、183 [M＋H－2CH3－C9H8OC2H4]+。通過比對數據庫及文獻報道[25]，證實該化合物為橘皮素，推測裂解途徑見圖2。

圖2 桔皮素裂解途徑預測Fig.2 Prediction of cleavage pattern of tangeretin

3.1.2 生物堿類化合物 生物堿類化合物的特點是結構中至少有1 個堿性N 原子[26]。按結構可分為有機胺類，如麻黃堿；異喹啉類，如小檗堿；喹唑啉類，如吳茱萸堿；吲哚類，如長春新堿等[27]。SHD共鑒定出生物堿類化合物18 個，多數存在于黃連和吳茱萸中，按其結構類型可分為有機胺類1 個；異喹啉類13 個；喹唑啉類2 個；吲哚類1 個。異喹啉生物堿的基本結構為異喹啉環通過1 個飽和六元環與苯環相連。

按異喹啉環上取代基的差異分為多種類型；當異喹啉有甲氧基取代時，易發生β 異裂，失去-CH3后分子結構重排形成羰基，后發生RDA 重排丟失1分子羰基，也可以再失去1 分子-CH3，繼而發生RDA 重排[28]。喹唑啉生物堿基本結構為喹唑啉環與一吲哚環通過飽和六元環相連；從SHD 鑒定到的2種喹唑啉化合物吳茱萸堿與吳茱萸次堿的喹唑啉基團的4 位均有羰基，可發生RDA 重排，丟失1 分子羰基，進而生成苯丙咪唑環，并在此基礎上發生重排反應，丟失1 分子HCN，并生成4 元氮雜環；此反應可重復發生2 次，即發生2 次重排，丟失2分子HCN[29]。以異喹啉類生物堿黃藤素為例，正離子模式可見分子離子峰m/z352 [M]+，其特征碎片離子m/z337 [M－CH3]+、336 [M－CH3－H]+、322[M－2CH3]+、308 [M－CH3－H－CO]+、294 [M－2CH3－CO]+。經文獻報道[30]比對，確定該化合物是黃藤素。裂解途徑見圖3。

圖3 黃藤素裂解途徑預測Fig.3 Prediction of cleavage pattern of palmatine

3.1.3 萜類化合物 萜類化合物是以異戊二烯（C5）為基本單元組成的一類化合物，按異戊二烯單元的數目可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。從SHD 共鑒定出萜類化合物26 個，包括單萜類2 個，如芍藥苷、芍藥內酯C；倍半萜類11 個，如白術內酯I、珊塔瑪內酯等；三萜類13 個，如甘草次酸、檸檬苦素等。倍半萜類化合物含有3 個異戊二烯單元，其分子結構多含有羰基和羥基；在其分子內含有羥基時，一般可發生鄰位脫水，即M－18，并形成1 個雙鍵；由于倍半萜結構中存在多數飽和C 原子，這一反應通?？梢酝茰y該倍半萜所含的羥基數目，即發生幾次脫水反應。含有羰基的倍半萜化合物可發生重排反應，脫去羰基，即M－28。由于上述反正的進行，雙鍵的存在可使與其相連的甲基發生重排裂解，甲基上的1 個H 原子轉移到雙鍵上，單鍵斷裂，即M－14。分子中如果有γH 和雙鍵同時存在時，可以發生麥氏重排，丟失1 分子C2H4，即M－26[31]。以倍半萜類化合物白術內酯III 為例，正離子模式可見分子離子峰m/z249 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z231 [M＋H－H2O]+、203 [M＋H－H2O－CO]+、189 [M＋HH2O－C3H6]+、175 [M＋H－H2O－C3H6－CH2]+、163[M＋H－H2O－C5H8]+。根據文獻報道[32]比對，確定該化合物為白術內酯III，裂解途徑見圖4。

圖4 白術內酯III 裂解途徑預測Fig.4 Prediction of cleavage pattern of atractylenolide III

三萜類化合物含有6 個異戊二烯單元，其一般多與各種單糖或二糖相連，其相對分子質量大，結構復雜。與糖苷相連的三萜類化合物通常會丟失分子內的糖苷，此反應可以1 次丟失1 分子的單糖，也可將所連接的糖苷全部脫去；甘草酸可見上述反應。未與糖苷結合的三萜類化合物多發生重排反應，可丟失的較常見的中性碎片有H2O、CO、CO2等[33]。以三萜類化合物甘草酸為例，正離子模式可見分子離子峰m/z823 [M＋H]+，其特征碎片離子m/z647[M＋H－C6H8O6]+、471 [M＋H－2C6H8O6]+、453[M＋H－2C6H8O6－H2O]+、435 [M＋H－2C6H8O6－2H2O]+、407 [M＋H－2C6H8O6－H2O－C2H4]+。根據與文獻比對[34-35]，確定該化合物為甘草酸，裂解途徑見圖5。

圖5 甘草酸裂解途徑預測Fig.5 Prediction of cleavage pattern of glycyrrhizin

3.2 SHD 指紋圖譜研究

3.2.1 精密度試驗 取同一批SHD 樣品（S5）1 份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定6 次，以3 號峰槲皮苷為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.21%，相對峰面積的RSD 為0.14%～2.32%，表明該方法精密度良好。

3.2.2 重復性試驗 取同一批SHD 樣品（S5）6 份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，以8 號峰槲皮苷為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～0.67%，相對峰面積的RSD 為0.47%～3.36%，表明該方法重復性良好。

3.2.3 穩定性試驗 取SHD（S5）供試品溶液，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，于0、4、8、12、16、20、24 h進樣測定，以8 號峰槲皮苷為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.67%，相對峰面積的RSD 為0.23%～3.86%，表明SHD 供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3.2.4 指紋圖譜的建立及其相似度評價 取10 批SHD 樣品溶液，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012）版”，以S1 號樣品色譜圖為參照圖譜，采用中位數法，時間窗設為0.1 min，通過多點校正進行Marker 峰匹配，建立疊加圖譜及對照圖譜，結果見圖6，確定20 個共有峰，其中2 號峰為芍藥苷、4 號峰為甘草苷、8 號峰為槲皮苷、9 號峰為橙皮苷、12 號峰為小檗堿、13 號峰為柚皮素、14 號峰為檸檬苦素、19 號峰為木香烴內酯、20 號峰為白術內酯II。各樣品之間的相似度在0.958～1.000，結果見表3，表明10 批SHD 樣品存在一定差異。

圖6 10 批SHD 疊加譜圖及對照指紋譜圖 (R)Fig.6 Superimposed spectra of 10 batches of SHD and control fingerprint spectra (R)

表3 10 批SHD 指紋圖譜相似度Table 3 Similarity of fingerprints of 10 batches of SHD

3.3 化學模式識別分析

3.3.1 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將10 批SHD 的20 個共有峰峰面積導入SPSS 27.0 軟件，采用組間聯接的聚類方法，以平方歐氏距離為樣品間距離進行HCA，當平方歐式距離為25 時。SHD 樣品聚為2 類，樣品S2、S4、S8、S10 聚為一類，其余樣品聚為另一類，見圖7。

圖7 10 批SHD 的HCA 樹狀圖Fig.7 Tree diagram of HCA for 10 batches of SHD

3.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將10 批SHD 樣品的20 個共有峰峰面積導入SPSS 27.0 軟件，對20 個峰面積進行標準化處理后進行PCA，結果見表4。前6 個因素的累積方差貢獻率＞85%，且特征值＞1，可以概括SHD 樣品的大部分信息。

使用SPSS 27.0 軟件對10 批SHD 樣品共有峰峰面積標準化處理后的數據為變量，運用SIMCA 14.1 軟件得到10 批SHD 樣品PCA 得分圖見圖8。結果所有樣品均在95%的置信區間內分為2 類，其中樣品S2、S4、S8、S10 聚為一類，其余樣品聚為另一類，與HCA 結果一致。

圖8 10 批SHD 的PCA 得分圖Fig.8 PCA score chart of 10 batches of SHD

3.3.3 正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）使用SPSS 27.0 軟件對10 批疏肝和胃湯SHD 樣品共有峰峰面積標準化處理，將標準化后的數據導入SIMCA 14.1，通過該軟件對10 批疏肝和胃湯SHD樣品進行OPLS-DA。使用有監督模式識別方法進行建模。該模型RX2＝0.824，RY2＝1.000，Q2＝0.931，模型預測參數均大于0.5，說明該模型穩定可靠，有較好的預測能力[36]。OPLS-DA 得分圖見圖9。以變量重要性投影（variable importance projection，VIP）大于1 為標準篩選差異性成分，共篩選出8 個對分類影響較大的成分，分別為峰8、13、6、11、10、12、16、15，見圖10。

圖9 10 批SHD 的OPLS-DA 得分圖Fig.9 OPLS-DA scores chart of 10 batches of SHD

圖10 20 個共有峰的VIP 值Fig.10 VIP value chart of 20 common peaks

3.4 含量測定

3.4.1 線性關系考察 取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行線性回歸，得線性回歸方程分別為芍藥苷Y＝16 672.0X＋37.111，R2＝0.999 8，線性范圍50.10～175.40 μg/mL；甘草苷Y＝32 402.0X＋9.193，R2＝0.999 3，線性范圍14.93～57.59 μg/mL；槲皮苷Y＝44 407.0X－534.610，R2＝0.999 7，線性范圍193.54～647.94 μg/mL；橙皮苷Y＝30 318.0X＋32.836，R2＝0.999 0，線性范圍17.43～61.03 μg/mL；小檗堿Y＝28 874.0X－34.934，R2＝0.999 6，線性范圍33.77～116.81 μg/mL；柚皮素Y＝20 953.0X－0.190 1，R2＝0.999 2，線性范圍0.92～15.20 μg/mL；檸檬苦素Y＝5 786.7X－0.421 9，R2＝0.999 3，線性范圍3.24～25.92 μg/mL；木香烴內酯Y＝19 829.0X＋1.698 3，R2＝0.999 2，線性范圍1.07～4.11 μg/mL；白術內酯IIY＝36 843.0X－25.565，R2＝0.999 7，線性范圍4.33～22.14 μg/mL。

3.4.2 專屬性試驗 取SHD 樣品溶液、混合對照品溶液、50%甲醇溶液及各藥材陰性溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，結果表明供試品溶液與對照品溶液保留時間相同位置的色譜峰與各對照品一致，陰性無干擾，其中峰2 為芍藥苷、峰4 為甘草苷、峰8 為槲皮苷、峰9 為橙皮苷、峰12 為小檗堿、峰13 為柚皮素、峰14 為檸檬苦素、峰19 為木香烴內酯、峰20 為白術內酯II，色譜圖見圖11。

圖11 SHD 樣品溶液、混合對照品溶液、50%甲醇溶液及各藥材陰性樣品色譜圖Fig.11 Chromatograms of sample solution of SHD, mixed reference substances solution, 50% methanol solution and negative samples of medicinal materials

3.4.3 精密度試驗 取SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定6 次，測定并計算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為0.34%、2.31%、0.13%、0.14%、1.37%、0.63%、0.61%、1.88%、0.86%。表明儀器精密度良好。

3.4.4 重復性試驗 取同一批SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，測定并計算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為1.08%、2.61%、0.43%、0.43%、1.31%、0.50%、1.31%、1.45%、1.46%。表明該方法重復性良好。

3.4.5 穩定性試驗 取SHD 樣品（S5），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h 后按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，計算色譜峰峰面積RSD。各成分峰面積的RSD 分別為3.40%、1.18%、0.40%、0.73%、3.42%、2.84%、1.51%、2.47%、0.97%。表明該方法所得供試品在24 h 內穩定。

3.4.6 加樣回收率試驗 取已測定各指標成分含量的SHD 樣品（S5）6 份，精密量取5 mL，分別加入相當于S5 樣品中各指標成分80%、100%、120%的各對照品，按“2.4.2”項下制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，計算得到芍藥苷、甘草苷、槲皮苷、橙皮苷、小檗堿、柚皮素、檸檬苦素、木香烴內酯、白術內酯II 的平均回收率為100.51%、96.80%、103.52%、101.16%、101.77%、103.60%、100.43%、99.02%、99.75%，RSD 分別為2.91%、4.39%、3.70%、2.70%、3.64%、1.86%、2.71%、3.78%、1.96%，表明該方法準確度良好。

3.4.7 多指標成分含量測定 取10 批SHD 樣品，按“2.4.2”項下方法平行制備3 份供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，外標法計算含量，結果見表5。

表5 10 批SHD 含量測定結果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

表5 10 批SHD 含量測定結果 (±s, n = 3)Table 5 Content determination of 10 batches of SHD (±s, n = 3)

樣品 質量濃度/(μg?mL?1)芍藥苷 甘草苷 槲皮苷 橙皮苷 小檗堿 柚皮素 檸檬苦素 木香烴內酯 白術內酯II S1 98.23±0.75 23.42±0.57 430.01±4.35 28.54±0.43 64.02±1.73 10.66±0.23 8.64±0.21 2.10±0.12 7.13±0.28 S2 96.83±2.15 31.72±1.79 289.44±10.17 37.61±1.86 74.62±1.25 6.45±0.08 8.10±0.38 2.96±0.04 8.17±0.31 S3 95.71±1.69 27.71±1.37 373.99±13.29 29.47±1.66 55.11±1.07 8.90±0.13 5.33±0.04 1.28±0.04 5.75±0.26 S4 89.06±1.79 28.48±0.40 317.07±2.52 25.37±0.97 63.29±2.54 5.53±0.22 5.66±0.16 1.98±0.04 4.99±0.03 S5 88.78±3.07 24.72±0.33 380.79±3.51 36.38±1.07 61.02±0.71 10.56±0.74 7.69±0.17 2.25±0.01 7.14±0.38 S6 94.29±0.44 30.05±0.67 415.43±5.40 36.56±1.42 57.27±1.48 10.60±0.44 20.07±0.59 1.30±0.06 5.54±0.18 S7 94.03±1.64 26.54±0.29 427.52±1.80 27.28±0.85 67.39±1.74 11.16±0.31 5.23±0.16 3.07±0.05 10.06±0.07 S8 97.15±1.15 25.41±0.87 325.29±6.43 45.53±0.95 68.42±2.90 7.30±0.09 5.69±0.22 1.08±0.01 6.05±0.22 S9 92.75±0.51 32.45±0.18 396.58±1.69 30.15±0.95 62.21±0.73 10.77±0.04 20.78±0.18 1.48±0.06 5.51±0.28 S10 90.50±1.33 31.70±1.47 308.10±7.11 37.21±0.71 65.19±1.05 7.65±0.22 8.28±0.03 1.70±0.01 5.84±0.06

4 討論

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術從SHD 中共鑒定88 種成分，包括26 個黃酮類成分、15 個萜類成分、17 個生物堿類成分、6 個香豆素類成分、6 個有機酸類成分、2 個苯丙素類化合物、2 個其他類成分。柴胡配以白芍，以柴胡苦辛解表泄熱、疏肝解郁、升舉陽氣，以白芍苦酸養血滋肝、柔肝止痛、平抑肝陽，兩者相配已有千年歷史，在調肝方面尤長[37-38]。枳實破氣散結，除痞導滯，可以用于治療積滯內停、痞滿脹痛，現代研究發現枳實有調節胃腸運動功能和抗炎的作用[39-40]。其中枳實貢獻了21種成分，包括黃酮類（17 種）、有機酸類（2 種）、生物堿類（1 種）、三萜類成分（2 種）；白芍貢獻了4 種成分，包括黃酮類（3 種）、有機酸類（1 種）、單萜類（2 種）和其他類成分（1 種）。本研究從柴胡中鑒定出的化合物較少，其原因可能是由于直接采用水煎煮法制備供試品溶液，而柴胡主要化學成分是皂苷類成分，加之皂苷類成分在熱水中易分解，因此造成本條件下檢出的柴胡皂苷較少[41-42]。后續將結合常溫提取方法和UPLC-Q-TOF-MS/MS 針對皂苷類成分進行鑒定，并利用HPLC-ELSD 方法進行皂苷類成分的指紋圖譜和多成分定量研究。

通過指紋圖譜相似度評價結合CA、PCA 和OPLS-DA，發現不同批次SHD 樣品存在一定差異并聚為2 類，其原因是樣品S2、S4、S8、S10 所用的枳實為同一批藥材，其余樣品為同一批藥材。說明影響SHD 質量差異的主要原因可能是枳實的批次不同；影響SHD 質量的差異成分共8 個，分別為槲皮苷、柚皮素、峰6、峰11、峰10、小檗堿、峰16 和峰15。其中槲皮苷在OPLS-DA 中的VIP值最大，是影響SHD 質量最為重要的成分。該提取方法中，枳實是槲皮苷含量的重要來源，在影響SHD 質量的差異成分中，枳實所提供的黃酮類成分的權重較高。

本實驗前期考察了柴胡皂苷A 和姜黃素在HPLC 圖中的響應，結果發現，柴胡皂苷A 色譜峰峰面積小，強度低，且信噪比（S/N）低于10∶1，不滿足定量所屬的條件；加之在樣品中并未檢出姜黃素色譜峰，故并未選擇以上2 種對照品?？紤]到SHD 全方組成，并參考《中國藥典》對于單味藥材的含量測定方法，結合前文所提及的枳實的高權重性，最終選擇以下9 種對照品。其中，芍藥苷歸屬于白芍；甘草苷歸屬于甘草；小檗堿歸屬于黃連；白術內酯II 歸屬于白術；木香烴內酯歸屬于木香；檸檬苦素歸屬于吳茱萸；槲皮苷、橙皮苷和柚皮素均歸屬于枳實。旨在全面地反映SHD 的質量優劣，在一定程度上反映了SHD 質量的差異。

本研究使用具有高靈敏度、高分辨率的液質聯用技術結合文獻報道和對照品指認，基本闡明了SHD 中化合物的類型以及化合物藥材來源的歸屬；使用控制中藥復方整體質量較常用的方法HPLC 法建立了SHD 的指紋圖譜，兩者結合，既可以提供該方所含化合物信息及其歸屬，又可對該方進行質量控制，為后續新藥研發以及質量標準提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突