酸堿位移結合噴霧干燥法制備染料木素三元包合物體系

王明帥，寧 夏，劉華石，王井俠，段亞輝，耿晨陽，王偉明

黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036

染料木素（genistein，Gen）即金雀異黃素，為異黃酮類化合物[1]?，F代藥理學實驗表明，具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質疏松、調血脂、清除自由基等生物活性，且毒性較低，不良反應較小，因此作為天然抗癌產物而被廣泛研究[2-5]。但研究結果表明，染料木素具有水溶性差、生物利用度較低等缺陷，限制其在臨床上的應用。

環糊精是一種優良載體，可與疏水性藥物分子形成包合物，通常用于增加藥物分子的溶解度和溶解速率[6-8]，但由于成本、生產能力和毒性等多種原因，導致藥物配方中環糊精使用量有限[9-12]。羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是在環糊精羥基上進行化學修飾產生的一種環糊精衍生物[13]，其水溶性更強，毒性更低[14]，在低至中等劑量下，被認為是口服和靜脈注射無毒，被廣泛用于改善水溶性差藥物的溶解度[15]，是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）推薦使用的增溶劑，且多種上市藥物中都有HP-β-CD 存在[16]。據報道，染料木素與HP-β-CD包合物增強了染料木素的溶解度、穩定性、溶解速率和生物利用度[17-18]。

而包合物增溶的另一個方向是與親水性聚合物配合，親水性聚合物具有協同作用，能增加包合物穩定性[19-23]。本研究為解決染料木素水溶性差的問題，采用相溶解度實驗與分子模擬探究三元與二元包合物的增溶效果，并對制備工藝、體外抗癌活性進行系統性研究，對包合物進行表征為開發染料木素抗癌藥物提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SD-1500 型噴霧干燥機，上海沃迪智能裝備股份有限公司；BP-10 型電子天平，德國賽多利斯公司；LC-20A 型高效液相色譜，日本島津公司；HS-DSC-101 型差示掃描量熱儀，上海和晟儀器科技有限公司；Smartlab9 型X 射線衍射儀，日本理學株式會社；Apreo 2 型掃描電子顯微鏡（SEM），美國賽默飛世爾科技公司；RC-806 型溶出儀，天津市天大天發科技有限公司；Spectrum Two 型紅外光譜儀，美國Perkin Elmer 公司；H97 型磁力攪拌器，上海尚普儀器設備有限公司。

1.2 材料

染料木素對照品，批號111704-201302，質量分數99.1%，中國食品藥品檢定研究院；羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）K30，上海阿拉丁試劑公司；非小細胞肺癌A549 細胞，上海細胞資源庫；人乳腺癌MCF-7 細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；細胞計數試劑盒CCK-8，批號G021-1-2，南京建成生物工程研究所；氫氧化鈉、鹽酸，西隴科學股份有限公司；其他均為實驗室分析級試劑。

2 方法與結果

2.1 染料木素測量方法

2.1.1 色譜條件 采用配有光電陣列二極管和自動進樣器的島津LC-20A 進行分析。采用Krmasil C18色譜柱（250 mm×4.6 μm，5 μm）；流動相采用0.05%磷酸水溶液-甲醇（3∶7）；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為260 nm。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取染料木素14.27 mg，加甲醇定容至100 mL 量瓶中，得染料木素對照品儲備液，再取染料木素對照品儲備液4.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得染料木素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取染料木素三元包合物75 mg，加甲醇稀釋至50 mL，再取4 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 輔料空白溶液 取適量的HP-β-CD 與PVP K30 用甲醇溶解、稀釋定容，即得輔料空白溶液。

2.1.5 專屬性 取對照品溶液、供試品溶液及輔料空白溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，所得色譜圖見圖1，結果表明輔料及溶劑不會干擾目標成分的測定，表明該分析方法專屬性良好。

圖1 輔料空白溶液 (A)、染料木素對照品溶液 (B) 和供試品溶液 (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of excipient blank solution (A), genistein reference substance solution (B) and test solution (C)

2.1.6 線性關系考察 精密稱取染料木素對照品15.65 mg 至50 mL 量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，即得313 μg/mL 的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液，用甲醇稀釋制成染料木素質量濃度分別為0.500 8、2.504、12.520、156.500、313.000 μg/mL的對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以染料木素峰面積（Y）與質量濃度（X）作圖，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝74 393X＋40 262，R2＝0.999 8，結果表明染料木素在0.500 8～313.000 μg/mL 與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.7 精密度試驗 取“2.1.3”項下染料木素三元包合物供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，計算進樣精密度，結果顯示染料木素峰面積的RSD 為0.79%。

2.1.8 穩定性試驗 取染料木素三元包合物供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣測定，測得染料木素峰面積的RSD 為0.91%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.9 重復性試驗 按照“2.1.3”項下方法制備染料木素三元包合物供試品溶液6 份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定三元包合物中染料木素含量，結果其RSD 為1.45%，結果表明該方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取染料木素三元包合物9 份，精密稱定，分別按樣品中染料木素含量添加對照品（添加標準80%、100%、120%各3 份），測得染料木素的平均加樣回收率為99.66%，RSD 為1.77%，結果表明該方法加樣回收率良好。

2.2 相溶解度實驗

精密稱取10 mg 染料木素（過量）加入分別含有0～14 mmol/L 的10 mL HP-β-CD 水溶液中混合均勻，另制備含有5%的PVPK30 的三元混合溶液。樣品在恒溫搖床中以（37.0±0.5）℃、150 r/min 的條件下放置72 h 后取出，5 000 r/min 將樣品離心15 min，收集上清液，通過微米過濾器（0.45 μm）濾過，并稀釋。以溶解度為縱坐標，HP-β-CD 濃度為橫坐標繪制溶解度相圖。在物質的量比1 ∶1 的假設下，計算絡合效率和穩定性常數（Ks）[24-26]。

S0為不存在HP-β-CD 時的固有溶解度，m代表溶解相圖上的線性斜率

根據染料木素的溶解度相圖可知，染料木素可與HP-β-CD 形成可溶性包合物，且溶解度隨HP-β-CD 濃度的增加呈線性增長（圖2）。根據Higuchi方程可知，染料木素與HP-β-CD 的相關性可歸類為線性圖（AL）類型，而染料木素的斜率為0.035，遠小于1，由此可知，1分子染料木素與1分子HP-β-CD形成包合物，或者說兩者的化學計量數之比為1∶1。在二元包合物中加入三元物質PVP K30 溶解度進一步增加，并且與染料木素的濃度呈線性相關。HP-β-CD 二元體系增加了7.2 倍，HP-β-CD 與PVP K30 形成的三元體系溶解度增加了10.8 倍。二元體系與三元體系的Ks和絡合效率值分別為397.3 mol?1、3.63%及635.76 mol?1、5.98%。在二元包合物中加入PVP K30 導致Ks和絡合效率顯著提高。PVP K30 作為三元物質的存在通過外部黏附到環糊精表面來增強穩定性，并有助于形成可能導致更高Ks值的共包合物。Ks值小于100 mol?1會產生不穩定的藥物/環糊精包合物，而大于1 000 mol?1的Ks值可能會有阻礙影響藥物吸收。

圖2 二元 (Gen-HP-β-CD) 和三元 (Gen-HP-β-CD-PVP K30) 溶解度相圖Fig.2 Binary (Gen-HP-β-CD) and ternary (Gen-HP-β-CDPVP K30) solubility phase diagrams

2.3 分子對接研究

β-CD 晶體結構的X 射線晶體學結構從蛋白質晶體數據庫（PDB）檢索，PDB：1BFN。利用PyMol獲得β-CD 的坐標文件[27-29]。在β-環糊精的伯羥基上添加了4 個2-羥丙基，采用AutoDock 1.5.6 版用于添加缺失的氫，計算Gasteiger 電荷并生成pdbqt文件。在Chem Draw Ultra6.0 軟件中繪制配體PVP K30[30-32]，分配了適當的2D 取向。通過PM3 方法最小化，并將其保存為pdbqt 格式。通過AutoDock 1.5.6 使用拉馬克遺傳算法進行篩選，并使用對接日志選擇最佳結合構象。使用PyMol 視化工具4.0 進行交互[33-36]。

為了在分子水平上證明PVP K30 有利于增加染料木素包合物的溶解度，利用AutuDock 進行分子對接。分子對接技術，可以準確地推測2 個分子的優勢構型。

為保證結構的合理性，采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA）進行分子對接。當2 個分子形成穩定包合物時，所產生的優勢構象主要取決于，結合位點的殘基的數量。分子對接結果如圖3 所示。對接結果表明，染料木素位于HP-β-CD 疏水腔的寬開口處，一部分位于腔中，另一部分為于腔外。染料木素的酚羥基和環糊精的羥丙基生成氫鍵，而色原酮上的羰基和7-位酚羥基分別與HP-β-CD 的吡喃葡萄糖苷氧原子形成了氫鍵，產生大量的范德華力，這些范德華力證明了包合物的形成。

圖3 二元和三元分子對接圖Fig.3 Binary and ternary molecular docking diagram

采用染料木素二元包合物進一步與PVP K30進行分子對接，結果表明，染料木素和羰基基團與三元包合物中的吡喃葡萄糖苷氧原子產生了相互作用證明三元包合物比二元包合物更加穩定，分子模擬結果仍需其他具體表征結果進行驗證。

2.4 包合物的制備

2.4.1 酸堿位移結合噴霧干燥法制備包合物 取25 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液，加入270 mg 的染料木素與2.7 g 的HP-β-CD 超聲40 min 促進包合，在40 ℃，900 r/min 條件下將相同物質的量的鹽酸PVP K30 溶液加入染料木素溶液中，繼續攪拌30 min，采用相對分子質量100 的透析袋除鹽，得到包合物溶液。采用噴霧干燥法得到干燥包合物（噴霧參數為進風溫度200 ℃，出風溫度85 ℃，風速60 Hz，撞針間隔3 s）。

2.4.2 噴霧干燥法制備包合物 將處方量染料木素溶于無水乙醇，加入HP-β-CD 與PVP K30，超聲40 min 促進包合，在40 ℃、900 r/min 條件下繼續攪拌30 min，將所得溶液噴霧干燥（噴霧參數為進風溫度120 ℃，出風溫度60 ℃，風速60 Hz，撞針間隔3 s）得到包合物。

2.4.3 球磨法制備包合物 取處方量的染料木素與HP-β-CD 及PVP K30，置于球磨罐中在500 r/min下干磨3 h，加入50 倍量的純化水繼續研磨2 h，將得到的混懸液，利用噴霧干燥法干燥（噴霧參數為進風溫度200 ℃，出風溫度85 ℃，風速60 Hz，撞針間隔3 s）。

2.5 溶解度研究

取染料木素及包合物與物理混合物在37 ℃，將過量的樣品加入含有10 mL 蒸餾水的西林瓶中，振搖3 h。將樣品溶液以角速度10 000 r/min 離心（離心半徑100 mm），取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，稀釋。使用定量HPLC 分析染料木素含量，平行3份。結果如表1 所示，染料木素在物理混合物和包合物中的溶解度顯著提高，在只有染料木素存在時飽和溶解度為2 μg/mL，與文獻報道相同[37]，在物理混合物和三元包合物中，物理混合物水溶性比純染料木素增加10 倍［（20.23±3.23）μg/mL］，而酸堿位移法制備的三元包合物的溶解度達到了8.8 mg/mL。染料木素在三元包合物中的顯著高溶解度是由于和HP-β-CD 及PVP K30 形成了三元包合物。并且使用的酸堿位移結合噴霧干燥法相比于其他方法溶解度更高，推測一部分染料木素可能以鹽的形式存在。相比二元包合物，三元包合物由于表面活性劑的添加，有助于降低染料木素和水之間的界面張力提高染料木素的溶解度。Zafar 等[18]使用染料木素、HP-β-CD、TPGS 制了三元包合物，其溶解度比純染料木素高48 倍。

表1 染料木素及包合物的溶解度Table 1 Solubility of genistein and inclusion complexes

2.6 三元包合物的表征

2.6.1 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析 使用差示掃描量熱儀測定HP-β-CD、PVPK30、染料木素、染料木素三元包合物、三元物理混合物的熱特性。將樣品放入鋁坩堝中，以空白鋁坩堝為基準，在氮氣吹掃的條件下，10 ℃/min 升溫，掃描0～400 ℃，研究樣品熱性能。結果如圖4 所示，染料木素、HP-β-CD、PVPK30、物理混合物、三元包合物的DSC 譜圖，可以觀察到，由于水分子的蒸發會在70～130 ℃產生較寬吸收峰，染料木素在298.8 ℃處有明顯的的特征吸收峰，而PVP K30 與HP-β-CD 的為無定型物質不存在明顯吸收峰。物理混合物由于染料木素的含量較少會在298.8 ℃出現較弱的吸收峰，三元包合物中染料木素被包被在疏水腔內因此特征吸收峰消失。因此染料木素的DSC 圖譜可以為包合物的形成提供很好的證據。

圖4 染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物的DSC 圖譜Fig.4 DSC spectra of genistein, PVP K30, HP-β-CD,physical mixture and ternary inclusion complex

2.6.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析 使用FTIR 光譜儀分析前，將各個樣品與KBr 在紅外燈下置于瑪瑙研缽中充分研磨，在4 000～400 cm?1的波數范圍內掃描，掃描分辨率為2 cm?1。通過FTIR 對染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物進行分析，結果如圖5 所示。HP-β-CD 的光譜有3 402.43 cm?1O-H 處的伸縮震動吸收帶，1 647 cm?1處的彎曲振動，1 026.72 cm?1處的C-O-C 伸縮振動峰。而PVP K30 在2 954.01 cm?1處有C-H 伸縮振動，1 664.10 cm?1處的C-O 伸縮振動，1 286.51 cm?1處存在C-N 伸縮振動。染料木素在3 413.68 cm?1的-OH 伸縮振動峰，1 650.03 cm?1處存在C＝O 伸縮振動，在1 617.02、1 518.69 cm?1處呈現苯環的骨架振動峰。三元物理混合物的FTIR 光譜中顯示出，染料木素、HP-β-CD 和PVP K30 的特征波段在2 928.21 cm?1顯示出PVP K30 的C-H 振動，以及HP-β-CD 的3 042.43 cm?1處的O-H 伸縮振動。染料木素三元包合物的紅外譜峰均屬于HP-β-CD 與PVP K30，而染料木素在1 650.03 cm?1處羰基峰和1 430～1 600 cm?1處苯環峰消失，推測染料木素的羰基和芳香環可能被包裹在HP-β-CD 的疏水腔內，在1 652.38 cm?1處的O-H 氫鍵吸收峰可能為包合過程中產生的。

圖5 染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物的FTIR 圖Fig.5 FTIR spectra of genistein, PVP K30, HP-β-CD,physical mixture and ternary inclusion complexes

2.6.3 X 射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）分析 使用X 射線衍射儀測定染料木素、三元包合物、三元物理混合物的XRPD 衍射圖，XRPD測試參數：在電壓40 kV，電流40 mA，測試范圍5°～90°，步距0.02，靶材是Cu 靶。結果如圖6 所示，采用XRPD 分析染料木素、物理混合物、染料木素三元包合物的晶體結構，純染料木素在7.8°、13°、14.6°、18.2°、22.8°、25.0°、26.6°、36.4°、40.4°顯示出多個尖銳的晶體衍射峰證明染料木素的晶體結構，而物理混合物在7.6°、17.9°、22.4°、26.4°存在染料木素的峰值說明物理混合物只是單個成分的疊加，而包合物中染料木素的特征峰值消失，只剩下類似HP-β-CD 的吸收峰推測三元包合物形成了非晶型無定型化合物。

圖6 染料木素、物理混合物、三元包合物的XRPD 圖譜Fig.6 XRPD pattern of genistein, physical mixture and ternary inclusion complex

2.6.4 SEM 分析 使用Apreo 2 型掃描電子顯微鏡測定染料木素、三元包合物、三元物理混合物的形態，使用濺射涂覆機單元用薄金鈀層涂覆樣品，并在加速電壓下分析表面形貌。結果如圖7 所示，從染料木素SEM 圖中可以看出，染料木素為規則的棒狀晶體，物理混合物為各種物質的簡單堆積，各物質結構清晰可見，染料木素仍為棒狀結晶。而染料木素三元包合物中，染料木素的結構消失且粒徑明顯減小，比單獨的染料木素、HP-β-CD 和PVP K30的粒徑要小得多，粒徑的減小導致顆粒表面積的增加，從而增加了三元包合物的水溶性和溶解速率。SEM 觀察結果與XRD 分析結果一致，表明染料木素與HP-β-CD 和PVP K30 形成的三元包合物處于無定型狀態，并證實了染料木素和HP-β-CD 的包合作用。

圖7 染料木素、物理混合物、三元包合物的SEM 圖譜Fig.7 Scanning electron microphotographs of genistein, physical mixture and ternary inclusion complex

2.7 溶出度研究

使用溶出儀評估三元包合物的釋放度，該研究在溶出裝置中進行，使用pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶出介質。準確稱量樣品，并將其置于含有900 mL 容器中，溫度保持在（37.0±0.5）℃，研究過程中將槳設置在75 r/min。在固定的時間間隔（5、15、30、60、90、120 min）取出5 mL 試樣，并補加等量緩沖液。樣品過0.45 μm 的微孔濾膜，稀釋，并使用定量HPLC 分析測定染料木素含量，以建立染料木素、不同制備方式三元包合物的釋放曲線。

如圖8 所示，從圖中可以看出三元包合物的累積溶出度效果高于物理混合物。在30 min 時的溶出度酸堿位移法為93.02%，噴霧干燥法88.92%，球磨法70.05%，最終的溶出度也表明酸堿位移結合噴霧干燥的制備方式更好，酸堿位移結合噴霧干燥法制備的包合物表現出更好的溶出特性，推測部分染料木素以鹽的形式存在，因此，比其他制備方式溶出度更高，染料木素的三元包合物比物理混合物溶出度更高，可能因染料木素被包被在環糊精疏水腔內，形成了氫鍵；增加了藥物的濕潤性等原因。

2.8 包封率

考察包合物處方對三元包合物包封率的影響，固定染料木素-HP-β-CD 的物質的量比為1∶1.8，考察PVP K30 的加入量對包封率的影響。分別加入染料木素-HP-β-CD 總質量1%、3%、5%、7%的PVP K30，考察三元包合物的包封率。在PVP K30 的加入量在1%、3%時，包合物溶液會出現明顯的渾濁，離心后，透析袋除鹽，測定包合物中染料木素的包封率為55%、65%，在5%、7%的加入量時，包合物溶液澄清，離心，除鹽，測定包合物中染料木素的包封率分別為94%、96%，相差不大。所以最終選擇5%的PVPK30 加入量。

2.9 體外抗癌實驗

2.9.1 細胞培養 取A549、MCF-7 細胞，使用各自完全培養基，在5% CO2、（37.0±0.5）℃的CO2培養箱中進行傳代培養。

2.9.2 CCK-8 法測定細胞活性 使用CCK-8 法測定染料木素原料藥與三元包合物的抗癌活性，將癌細胞接種到96 孔板中，細胞密度保持在5×103個/孔、每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2下培養24 h使細胞貼壁。點入100 μL 不同濃度的藥物，相同條件培養48 h，加入100 μL 10%的CCK-8 試劑，繼續培養2 h，利用酶標儀在450 nm 下測定吸光度（A）值，通過公式計算抑制率。

抑制率＝(A對照－A實驗)/(A對照－A空白)

采用CCK-8 法測定染料木素與其三元包合物對MCF-7 細胞株和A549 細胞株的細胞毒性。結果如表2 所示，染料木素及其三元包合物對MCF-7和A549 細胞均有抑制作用，且均具有濃度相關性。與染料木素單獨處理組相比，染料木素三元包合物對細胞活力的抑制作用明顯增強。染料木素的IC50為135.5 μmol/L（A549 細胞）和209.9 μmol/L（MCF細胞），而染料木素三元包合物的IC50為201.9 μmol/L（MCF 細胞）和91.89 μmol/L（A549 細胞），實驗結果表明，所形成的染料木素三元包合物增強了染料木素對癌細胞的抑制作用。

表2 染料木素原料藥及其三元包合物對MCF-9、A549 細胞存活率的影響 (±s, n = 4)Table 2 Effects of genistein raw materials and their ternary inclusion complexes on survival rate of MCF-9 and A549 cells(±s, n = 4)

與原料藥組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs compared with raw material group.

組別 MCF-7 細胞存活率/%10 μmol?L?1 100 μmol?L?1 250 μmol?L?1 500 μmol?L?1 1 000 μmol?L?1染料木素原料藥 94.47±0.56 58.44±0.67 34.84±0.05 18.45±1.00 10.43±0.41染料木素三元包合物 89.05±1.00* 48.36±0.85*** 27.44±0.86** 8.63±1.06*** 4.76±0.77**組別 A549 細胞存活率/%10 μmol?L?1 100 μmol?L?1 250 μmol?L?1 500 μmol?L?1 1 000 μmol?L?1染料木素原料藥 96.81±2.65 90.36±6.61 50.56±8.74 18.03±5.90 9.72±2.31染料木素三元包合物 95.80±2.88 81.74±6.80* 41.62±8.47** 14.37±3.07 2.31±0.09*

3 討論

水溶性差是限制藥物開發與應用的主要原因之一[38]。大量的抗癌藥物為不溶性或脂溶性物質，給藥物開發帶來很大不便。HP-β-CD 是的β-CD 衍生物，與β-CD 相比具有更高的溶解度和更低的腸外毒性。有一定親脂性的染料木素分子能被捕獲到HP-β-CD 的疏水腔中，本研究，通過相溶解度實驗及分子模擬證明三元包合物增溶效果及穩定性高于二元包合物。對三種包合效果較好的制備工藝進行考察，酸堿位移結合噴霧干燥法制備的三元包合物溶解度更高（8.8 mg/mL）。體外抗癌研究中，三元包合物具有更高的抗癌活性，與之前報道一致，含有HP-β-CD 的包合物增加了染料木素抑制細胞生長的能力?？赡苡捎诎衔镄纬稍黾恿巳玖夏舅氐娜芙舛燃凹毎さ耐高^性。另一種原因可能是HP-β-CD 的存在也可增強染料木素抗癌活性，最近的一項研究報道，HP-β-CD 可以通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯來破壞膽固醇穩態和抑制慢性粒細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）細胞增殖。綜上所述酸堿位移結合噴霧干燥制備三元包合物為染料木素的開發提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突