副結核分枝桿菌免疫原蛋白的篩選及免疫保護效果評價

陳凡若，張嘉俊，鹿萍，崔寧，崔瑩瑩，崔子寅，黨光輝，劉思國

中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所/動物疫病防控全國重點實驗室，哈爾濱 150069

0 引言

【研究意義】副結核?。╬aratuberculosis，PTB）是一種由副結核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動物慢性消耗性疾病，能夠引起患病動物持續性腹瀉和肉芽腫性腸炎[1]。近年來，由于養殖業規模的擴增，PTB 的發病率也隨之增加，在內蒙古等多個地區發現[2]。由于動物患上PTB 后會導致其生產性能下降、飼料轉化效率降低、產奶量下降、對其他疾病的易感性增加以及過早淘汰導致的飼養成本增加，養殖業遭受極大的經濟損失[3-5]。目前，由于商用的PTB 滅活疫苗存在干擾牛結核病的檢測、導致注射部位損傷、保護率低等弊端，因此迫切需要開發PTB 新型疫苗[6-7]?！厩叭搜芯窟M展】目前，已經有一些關于MAP 的免疫原性蛋白的研究報道，如 P22、MAP1272c、Ag85C（MAP3531c）、MAP3783 和MAP3701c，這些蛋白均具有作為候選亞單位疫苗的潛力。P22 是MAP 分泌的一種脂蛋白，與油包水佐劑混合，經皮下免疫綿羊可誘導良好的IFN-γ 和抗體反應[8-9]。MAP1272c 是一種細胞壁相關的水解酶，用MAP1272c 與MAP1087、MAP1204、MAP2077c 混合制成的抗原雞尾酒免疫犢牛，能夠降低新生犢牛的MAP 感染率和糞便中MAP的脫落[10]。Ag85C 屬于Ag85 蛋白家族，是高度保守的蛋白質[11]。有研究發現，牛群和小鼠經口感染MAP的過程中，Ag85 是免疫優勢T 細胞抗原，可以誘導快速強烈的T 細胞增殖和IFN-γ 的分泌[11]。MAP3783是一種保守的假定ESAT-6 樣蛋白，MAP3701c 是一種熱休克蛋白。用MAP3701c、MAP3783 和MAP1508混合制成的抗原雞尾酒免疫牛，促進IFN-γ 和抗體的釋放分泌水平上升，且免疫效果穩定，不受年齡的增長而變化[12]?！颈狙芯壳腥朦c】多種融合蛋白能夠增加對MAP 的保護效果。常用的方法是在單一疫苗中使用多種蛋白抗原形成抗原雞尾酒，以及將多種抗原相互連接，形成融合蛋白。據報道，MAP3527 和MAP1519 構建的融合蛋白74F，以及MAP3527 和Ag85B 構建的重組蛋白66NC，均對MAP 感染有著良好的保護作用[13-14]?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬對MAP 的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527這6 個基因，表達5 種融合蛋白58F、62F、69F、46F 和52F，通過IFN-γ ELISPOT實驗篩選出最佳免疫原；隨后將最佳候選免疫原和已報道的66NC 混合，通過IFN-γ ELISPOT 試驗、監測抗體滴度、血清細胞因子，以及檢測感染后免疫小鼠的體重變化、病理學和組織病理學觀察以及組織荷菌數，綜合評價候選亞單位疫苗的免疫原性和免疫保護效果，從而篩選出效果較好的候選亞單位疫苗，為PTB的有效防控奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2022 年5 月至 2023 年2 月在中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所完成。

1.1 實驗動物

6 周齡C57BL/6 雌性小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，飼養于中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物實驗中心。

1.2 載體與菌株

pET28a-3527N-3527C 和pET28a-3527N-Ag85B-3527C 載體由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物疫病防控全國重點實驗室保存。MAP K-10 菌株也是由該實驗室保存。

1.3 引物

參考GenBank中MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c的基因序列，利用Snapgene軟件設計特異性引物 p22-F/R、map1272c-F/R、map3531c-F/R、map3783-F/R 以及map3701c-F/R。根據參照文獻[15]合成MAP K-10 的熒光定量PCR 所用引物和探針。引物由吉林省庫美生物科技有限公司和美國ABI 公司合成（表1）。

表1 特異性引物和探針Table 1 Specific primers and probes

1.4 主要試劑

PrimerSTAR Max 聚合酶、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購自日本Takara 公司；小鼠IL-17A/ IFN-γ/TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow 購自美國GE 公司；MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑購自法國賽比克公司；小鼠脾臟淋巴細胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品有限公司；Mouse IFN-γ Precoated ELISPOT Kit 購自北京達科為生物技術有限公司；Goat pAb to Mouse IgG/IgM/IgG1/IgG2a 購自英國Abcam 公司；Middlebrook 7H9 培養基購自美國BD公司。

1.5 融合蛋白的構建、表達與制備

以提取的MAP K-10 參考株基因組DNA 為模板，分別用 p22-F/R、map1272c-F/R、map3531c-F/R、map3783-F/R 以及map3701c-F/R 引物擴增5 種基因，將其分別克隆于pET28a-3527N-3527C 載體，構建5種重組質粒，并轉化E.coliBL21 誘導表達，根據蛋白分子量大小將重組蛋白分別命名為58F、62F、69F、46F 和52F。以可溶形式表達的58F、62F 和52F 經Ni 柱親和層析純化；以包涵體形式表達的69F 和46F進行變性與復性，經Ni 柱親和層析純化。將pET28a-3527N-Ag85B-3527C 轉化E.coliBL21 誘導表達，經Ni 柱親和層析純化，獲得66NC。測定蛋白濃度，-80℃保存備用。

1.6 動物免疫與感染

1.6.1 疫苗制備 重組蛋白免疫組：重組蛋白分別與MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑以1∶1.5 的比例乳化；61 VG 對照組：取與蛋白等體積的無菌 PBS 與MONTANIDE ISA 61 VG 佐劑以1∶1.5 的比例乳化；MAP K-10 滅活疫苗對照組：取適量MAP K-10，用滅菌水洗滌并重懸后，轉移至EP 管中，置于80℃水浴鍋中滅活30 min。在超凈臺中風干MAP K-10，待菌液完全風干后，對MAP K-10 粉末進行稱重，室溫保存備用。取適量無菌PBS 重懸熱滅活風干后的MAP K-10 粉末，使其終濃度為5 mg·mL-1，與MONTANIDE ISA 61 VG 以1∶1.5 的比例進行乳化。室溫置于高通量組織研磨儀中進行乳化。高通量組織研磨儀的程序設置為：頻率20 次/s，工作時間20 min。吸取乳化后的液體滴至水面，液滴不立即彌散即為乳化成功。

1.6.2 動物分組 候選亞單位疫苗的篩選試驗：21 只雌性C57BL/6 小鼠分為7 組，每組3 只，分別為61 VG 對照組、66NC 對照組、58F 免疫組、62F 免疫組、69F 免疫組、46F 免疫組和52F 免疫組；候選亞單位疫苗的免疫原性與保護效果評價試驗：68 只雌性C57BL/6 小鼠分為4 組，分別為61 VG對照組（16 只）、MAP K-10 滅活疫苗對照組（16只）、58F 免疫組（18 只）和66NC+58F 免疫組（18只）。

1.6.3 動物免疫與感染 61 VG 對照組每只小鼠注射100 μL PBS；MAP K-10 對照組每只小鼠注射500 μg（100 μL）熱滅活的MAP K-10；58F、62F、69F、46F、52F、66NC、66NC+58F 免疫組每只小鼠注射50 μg（100 μL）相應蛋白。接種途徑為背部皮下多點注射。小鼠共免疫兩次，間隔3 周。二免3 周時用MAP K-10 菌株通過腹腔注射感染除空白對照組以外的小鼠，MAP K-10 菌株用無菌PBST 重懸，濃度為1×109CFU/mL，每只小鼠注射100 μL。MAP K-10 菌株的感染方式和劑量參照文獻[14]。

1.7 IFN-γ ELISPOT 試驗

小鼠二免3 周時，使用小鼠脾臟淋巴細胞分離液試劑盒提取小鼠脾淋巴細胞，使用Mouse IFN-γ Precoated ELISPOT Kit 檢測脾臟淋巴細胞分泌的IFN-γ 的細胞量，具體步驟參照使用說明書進行操作。

1.8 ELISA 監測血清特異性抗體

二免3 周、感染2 周和4 周時對各組小鼠采血，收集血清，進行1∶20、1∶40 等作2 倍倍比稀釋，至1∶409 600，-20 ℃保存。取96 孔板，用相應抗原包被后，每孔分別加入100 μL 不同稀釋度的血清樣本，室溫孵育并洗板后，用PBST 溶液對Goat anti mouse IgG、IgM、IgG1和IgG2a進行1∶10 000 倍稀釋，每孔分別加入100 μL，室溫孵育并洗板后，在避光條件下每孔加入TMB 顯色液，孵育顯色后用2 mol·L-1硫酸終止反應，用酶標儀在OD450處檢測光吸收值。IgG 和IgM 的滴度為陽性OD450/陰性OD450值≥2.0時的最大血清稀釋度。

1.9 ELISA 監測血清細胞因子水平

二免3 周、感染2 周與4 周時對各組小鼠采血，使用小鼠IL-17A/ IFN-γ/ TNF-α ELISA 檢測試劑盒檢測血清細胞因子水平，具體步驟參照使用說明書進行操作。

1.10 體重檢測

記錄小鼠感染前和感染2 周的體重，并計算感染2 周小鼠的體重增長率。

1.11 病理學和組織病理學觀察

脫頸處死感染4 周小鼠，在超凈臺中解剖小鼠，分離小鼠肝臟，拍照記錄肝臟上結節和宏觀病變，并根據肝臟表面結節面積百分比做病理學打分。取感染4 周小鼠肝臟尾狀葉，于組織固定液中固定，送至中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所病理實驗室制備病理切片進行H·E 染色，觀察組織病理學變化，并根據肝臟肉芽腫面積百分比進行組織病理學打分。病理學打分遵循以下原則，肝臟表面結節面積百分比打分如下：0=無，1=≤1%，2=＞1%和≤3%，3=＞3%和≤5%，4=＞5%和≤7%，5=＞7%和≤9%，6=＞9%和≤11%,，7=＞11%和≤13%，8=＞13%和≤15%，9=＞15%和≤17%，10=＞17%和≤19%，11=＞19%和≤21%，12=＞21%和≤23%，13=＞23%和≤25%，14=＞25%和≤27%，15=＞27%和≤29%。根據肉芽腫面積百分比對肝臟進行組織病理學打分：0=無；1=≤10%；2=＞10%和≤15%；3=＞15%和≤20%；4=＞20%和≤30%；5=＞30%和≤40%；6=＞40%和≤50%。

1.12 qPCR 檢測組織荷菌數

研磨感染4 周的小鼠肝臟，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，測定細菌DNA 的濃度，將細菌基因組DNA 置于-20 ℃保存備用。取標準品MAP 基因組DNA 進行倍比稀釋，制成標準品模板。以DNA 酶處理過的滅菌水為陰性對照，進行TaqMan熒光定量PCR。由QuanStudioTMDesign & Analysis Software v1.4.3 分析繪制標準曲線。根據標準曲線計算小鼠肝臟荷菌數。

2 結果

2.1 6 種融合蛋白的構建與親和層析純化

用MAP 的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c和map3527基因根據重組質粒模式圖構建5 種重組質粒（圖1-a）。將鑒定正確的5 種重組質粒和 pET28a-3527N-Ag85B-3527C 轉化E.coliBL21，經過誘導表達、Ni 柱親和層析純化，獲得6種融合蛋白58F、62F、69F、46F、52F 和66NC（圖1-b）。

圖1 重組質粒模式圖（a）與SDS-PAGE 檢測58F、62F、69F、46F 和52F 蛋白的純化情況（b）Fig. 1 Pattern of recombinant plasmid (a) and affinity chromatographic purification of 58F, 62F, 69F, 46F, and 52F proteins detected by SDS-PAGE (b)

2.2 IFN-γ ELISPOT 試驗篩選候選免疫原

為了篩選能夠誘導較強免疫應答的抗原，分離二免3 周小鼠脾淋巴細胞，進行IFN-γ ELISPOT 試驗。結果顯示：與MONTANIDE ISA 61 VG（61 VG）對照組相比，58F 免疫組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ的細胞量顯著高于61 VG 對照組與62F、69F、46F 和52F 免疫組（P＜0.001），并且與陽性對照66NC 免疫組無顯著差異（圖2）。以上結果表明，5 種重組蛋白中，58F 能夠誘導強烈的IFN-γ 免疫反應，是免疫效果更好的候選抗原。

圖2 酶聯斑點分析儀檢測抗原刺激脾淋巴細胞后IFN-γ 表達情況Fig. 2 The expression of IFN-γ in spleen lymphocytes stimulated by antigen was detected by ELISPOT

2.3 融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫原性分析

為了比較融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫水平，分離二免3 周小鼠的脾淋巴細胞，進行IFN-γ ELISPOT 試驗，并收集二免3 周小鼠的血清，ELISA檢測血清細胞因子IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 和IgG1、IgG2a抗體水平（圖3）。結果顯示：與61 VG 對照組和MAP K-10 對照組相比，66NC+58F 免疫組小鼠的脾淋巴細胞分泌IFN-γ 的細胞量非常顯著增加（P＜0.01）；58F 免疫組小鼠的脾淋巴細胞分泌IFN-γ 的細胞量高于對照組，但無顯著性差異（P＞0.05）；66NC+58F 免疫組高于58F 免疫組，但無顯著性差異（P＞0.05）（圖3-a、圖3-b）。與兩個對照組和58F免疫組相比，66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A 顯著增加（P＜0.05）（圖3-c）。與61 VG對照組和MAP K-10 對照組相比，58F 和66NC+58F免疫組的IgG1和IgG2a水平均顯著增高（P＜0.05），但兩組無顯著性差異（P＞0.05）（圖3-d、圖3-e）。以上結果表明，融合蛋白66NC+58F 能夠誘導更高的Th1、Th17 型免疫反應和抗體水平，是免疫效果更好的候選抗原。

圖3 二免3 周融合蛋白58F 和66NC+58F 的免疫原性分析Fig. 3 Immunogenicity analysis of fusion protein 58F and 66NC+58F at 3 weeks of secondary immunization

2.4 ELISA 監測血清特異性抗體

為了監測融合蛋白58F 和66NC+58F 誘導的抗體水平，首免后每2 周對各組小鼠進行采血，通過ELISA檢測免疫至感染期間IgG 和IgM 抗體水平（圖4）。結果顯示：與MAP K-10 對照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組在整個監測過程產生的IgG，以及首免2 周、4 周和感染4 周產生的IgM 極顯著增加（P＜0.001），66NC+58F 免疫組在感染2 周產生的IgM非常顯著增加（P＜0.01），但兩組產生的IgG 和IgM在整個監測過程中始終無顯著性差異（P＞0.05）（圖4-a、圖4-b）。以上結果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 均可誘導產生高水平的抗體。

圖4 血清抗體監測Fig. 4 The monitoring results of serum antibody

2.5 ELISA 檢測感染后小鼠血清細胞因子

為了比較融合蛋白58F 和66NC+58F 在小鼠感染后誘導的細胞因子水平的差異，在感染2 周和4 周對各組小鼠進行采血，通過ELISA 檢測IFN-γ、TNF-α和IL-17A 水平（圖5）。結果顯示：感染2 周時，與61 VG 對照組、MAP K-10 對照組和58F 免疫組相比，66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 極顯著增加（P＜0.001）（圖5-a）。感染4 周時，與61 VG 對照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組分泌的IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 非常顯著增加（P＜0.001），但兩組與MAP K-10 對照組相比無差異（P＞0.05），兩個免疫組之間無差異（P＞0.05）（圖5-b）。以上結果表明，融合蛋白66NC+58F 刺激小鼠血清中IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的釋放，能夠誘導較強的Th1和Th17 型免疫反應。

圖5 血清細胞因子檢測Fig. 5 Serum cytokine assay results

2.6 體重檢測

為了比較感染后各組小鼠增重差異，記錄感染前和感染2 周時小鼠的體重，計算小鼠體重增長率（圖6）。與61 VG 對照組相比，58F 免疫組體重增長率顯著增加（P＜0.05），66NC+58F 免疫組體重增長率極顯著增加（P＜0.001），但58F 與66NC+58F 免疫組間無差異（P＞0.05）；與MAP K-10 對照組相比，66NC+58F 免疫組體重增長率非常顯著增加（P＜0.01），58F 免疫組無差異（P＞0.05）。以上結果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 均可抵抗MAP 感染造成的體重下降，66NC+58F 的抵抗效果較58F 更好。

圖6 感染2 周小鼠體重增長率Fig. 6 Body weight growth rate of mouse at two weeks of infection

2.7 融合蛋白58F 和66NC+58F 的保護效果分析

為了評價融合蛋白58F 和66NC+58F 免疫小鼠后的保護效果，筆者分離MAP K-10 感染4 周小鼠的肝臟進行病理學和組織病理學分析，并通過熒光定量PCR 的方法檢測肝臟荷菌數（圖7）。結果顯示：感染4 周時，所有組的肝臟表面均有表面結節，但66N+58F 免疫組肝臟表面結節面積比61 VG 對照組和MAP K-10 對照組更少（圖7-a，紅色箭頭指示）。病理學打分顯示，與61 VG 對照組相比，兩個免疫組的各個臟器病變無差異（P＞0.05）；與MAP K-10 對照組相比，兩個免疫組的肝臟病變非常顯著下降（P＜0.01），但兩個免疫組各個臟器病變之間無差異（P＞0.05）（圖7-b）。感染4 周時，所有組的肝臟均有廣泛性的肝細胞壞死與多發性微型肉芽腫，但66N+58F免疫組肉芽腫面積比兩個對照組和58F 免疫組更少（圖7-c，紅色箭頭指示）。組織病理學打分顯示，66NC+58F免疫組肝臟肉芽腫面積顯著低于61 VG 對照組和MAP K-10 對照組（P＜0.05），且肝臟組織病理得分顯著低于58F 免疫組（P＜0.05）（圖7-d）。感染4 周時，58F免疫組肝臟的荷菌數顯著低于61 VG 對照組（P＜0.05）；66NC+58F 免疫組肝臟的荷菌數顯著低于61 VG對照組和MAP K-10 對照組（P＜0.05）；但兩個免疫組之間的荷菌數無差異（P＞0.05）（圖7-e）。以上結果表明，融合蛋白58F 和66NC+58F 能夠抵抗MAP 感染對小鼠造成的病理損傷，均可降低MAP 在小鼠肝臟中的定植水平，且66NC+58F 的抵抗效果優于58F。

圖7 小鼠臟器病理學、組織病理學和菌落定植分析Fig. 7 Organ pathology and histopathological analysis of mouse

3 討論

3.1 重組亞單位候選疫苗的篩選

MAP 感染主要導致宿主的Th1 免疫反應，其中IFN-γ 是最關鍵的細胞因子，它在T 細胞和巨噬細胞的激活中有著重要作用，從而介導細胞免疫，抑制和殺傷MAP[16-17]。對MAP 感染的控制取決于宿主的Th1免疫反應和Th1 細胞在獲得性免疫階段分泌的IFN-γ對巨噬細胞的激活[18]。因此，篩選出能夠誘導強烈的Th1 免疫反應和IFN-γ 水平的候選免疫原對于開發MAP 亞單位疫苗至關重要。本研究在獲得6 種融合蛋白后，通過IFN-γ ELISPOT 試驗評價融合蛋白免疫原性，確定了MAP 的最佳候選抗原58F。

在結核病和副結核病的亞單位疫苗的開發過程中，越來越多的研究采用了抗原雞尾酒或融合蛋白的策略，以增加亞單位疫苗的免疫效果，最終獲得的亞單位疫苗比起單一抗原可以引起更有效的免疫反應[10,12,19]。本研究將用已報道的MAP3527 和Ag85B構建的融合蛋白66NC 與篩選出的MAP 最佳候選免疫原58F 混合，制成的重組亞單位疫苗66NC+58F 免疫小鼠后，通過IFN-γ ELISPOT 試驗評價其免疫原性，確定了MAP 的最佳候選抗原66NC+58F。

3.2 重組亞單位候選疫苗的免疫原性評價

MAP 感染主要導致宿主的Th1 免疫反應，特點包括IgG2a抗體、IFN-γ 和TNF-α 的產生[18,20]。IFN-γ 和TNF-α 可以激活巨噬細胞的成熟和抗原特異性Th1 細胞的增殖，進而協調細胞介導的免疫功能，是遏制胞內感染的必要條件。TNF-α 缺乏會導致MAP 傳播增強，并在感染部位表現出彌漫性肉芽腫病變[21]。IL-17與IFN-γ 等細胞因子構成促炎細胞因子環境，共同控制疾病的早期發展[22]。本研究通過ELISA 檢測小鼠血清細胞因子，結果顯示，二免3 周時，66NC+58F 免疫組IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的分泌水平顯著高于61 VG 對照組和58F 免疫組，表明融合蛋白66NC+58F能夠誘導較強的Th1 和Th17 型免疫反應。

研究發現，在接種MAP 滅活疫苗的綿羊中，B細胞在保護動物免受MAP 感染方面非常重要[23]。免疫產生的抗體可以提高動物的存活率，減少細菌的傳播[24-25]。由于亞單位疫苗主要誘導宿主體液免疫反應，因此抗體滴度也是評價候選亞單位疫苗的工具之一[17]。本研究通過ELISA 監測小鼠血清抗體水平，結果表明，58F 和66NC+58F 免疫組在免疫過程中均誘導高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a。表明融合蛋白58F 和66NC+58F 能夠刺激機體產生體液免疫和細胞免疫反應。

3.3 重組亞單位候選疫苗的免疫保護效果評價

目前已經鑒定出多種能夠誘導Th1 免疫反應的抗原，但由于牛、羊等反芻動物進入臨床階段前有較長的潛伏期，因此只有少數候選免疫原在牛上進行了保護效果評價[26-27]。小鼠是研究MAP 長期感染最合適的替代模型，主要用來早期篩選候選疫苗，雖然反芻動物的臨床特征如腹瀉和嚴重的腸道病變等癥狀無法在小鼠中復現，但小鼠在感染MAP 時的組織學和免疫學特征與反芻動物相似[28-29]。對于小鼠模型，脾臟、肝臟和腸的細菌負荷量或細菌的糞便脫落可以作為疾病發展的標志。

本研究通過ELISA 檢測小鼠抗體水平和血清細胞因子，結果顯示，感染2 周、4 周時，58F 和66NC+58F免疫組均誘導高滴度的IgG 和IgM，對抵抗MAP 感染具有一定的保護作用；66NC+58F 免疫組IFN-γ、TNF-α 和IL-17A 的分泌水平顯著高于61 VG 對照組和58F 免疫組，表明融合蛋白66NC+58F 能夠誘導較強的Th1 和Th17 型免疫反應。本研究監測了感染2周各組小鼠的增重差異，以評價融合蛋白對感染后小鼠體重的影響，結果顯示，66NC+58F 免疫組小鼠體重的增重效果高于61 VG 對照組和58F 免疫組，更能抵抗MAP 感染造成的體重下降。本研究通過病理學及組織病理學觀察評價融合蛋白58F 和66NC+58F 在感染過程中對小鼠的保護作用，結果顯示，與61 VG對照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組肝臟的病理損傷均明顯減輕，66NC+58F 免疫組較58F 免疫組更輕，表明融合蛋白66NC+58F 能夠抵抗MAP 感染對小鼠造成的病理損傷。本研究通過熒光定量PCR評價融合蛋白58F 和66NC+58F 在感染過程中對小鼠肝臟定植情況的影響，結果顯示，與61 VG 對照組相比，58F 免疫組和66NC+58F 免疫組的肝臟荷菌數均顯著下降，表明融合蛋白58F 和66NC+58F 均可降低MAP 在肝臟的定植水平。

4 結論

成功獲得5 種融合蛋白58F、62F、69F、46F 和52F，其中，58F 誘導強烈的特異性IFN-γ 反應；融合蛋白66NC+58F 能夠誘導小鼠產生高滴度的抗體以及Th1 和Th17 型免疫反應，對MAP 感染有著一定的免疫保護作用，是PTB 重要的亞單位疫苗候選，為PTB新型亞單位疫苗的研究提供重要的科學依據。