腫瘤抑制基因7L通過Wnt/β-catenin信號通路抑制胰腺癌細胞生長的作用機制

陳小麗 田小容 黃曉東 田霞

胰腺癌是最致命的癌癥之一,我國胰腺癌的發病率和死亡率仍在逐年上升,對人類健康構成重大威脅[1-2]。因此,探索胰腺癌發生、發展的分子機制,尋找新的治療靶點,對改善胰腺癌患者的預后尤為重要[3-4]。研究表明腫瘤抑制基因(ST)7L通過調控Wnt/β-catenin信號通路起腫瘤抑制作用并被表征為抑癌基因[5-6]。曲美他嗪可通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制人腦血管平滑肌細胞的增殖、遷移及活性氧表達[7]。當Wnt通路被激活時,β-catenin磷酸化被抑制,導致細胞中β-catenin增加,β-catenin蛋白轉位到細胞核中,與轉錄因子的共調節因子形成復合物,共同激活Wnt靶基因的轉錄,最終參與促進細胞增殖、存活、分化和遷移等基因表達[8-9]。研究發現ST7L基因能夠作為靶基因,在上游基因的調控下參與胰腺癌細胞生長、轉移和耐藥。然而,關于ST7L對胰腺癌細胞增殖及凋亡能力影響的報道甚少。因此,本研究主要探討ST7L對胰腺癌細胞增殖和凋亡能力的影響及其可能的作用機制,以期為胰腺癌的治療提供新依據。

材料與方法

1.材料:臨床樣本:選取于我院就診、病理組織活檢確診為胰腺癌且未行放化療的患者及同期健康體檢者血漿標本各22例,同時收集胰腺癌組織和癌旁組織(距癌組織邊緣≤3 cm)標本13對。取血漿標本在4 ℃下1 000 g離心15 min,隨后轉移至-80 ℃冰箱保存。組織標本離體后先液氮速凍,后儲存于-80 ℃備用。本研究經我院倫理委員會審核批準(KY2019-012),所有受試者均簽署知情同意書。主要試劑:DMEM、RPMI 1640培養基及胎牛血清均購于美國Gibco公司;Trizol及Lipofectamine2000試劑購于美國Invitrogen公司;逆轉錄反應試劑盒購于日本TOYOBO公司;UltraSYBR混合物購于江蘇康為世紀公司;ST7L和β-actin引物購于廣州銳博公司;細胞計數試劑盒8(CCK-8)購于上海碧云天公司;ST7L抗體購于美國Sigma公司;Caspase-3抗體購于美國CST公司;Bcl-2抗體購于美國R&D公司;β-catenin、c-Myc、Cyclin D1及β-actin抗體均購于英國Abcam公司。

2.方法

(1)細胞培養:人胰腺癌細胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1和胰腺導管正常細胞H6C7均來源于中國科學院細胞庫。PANC-1和PaCa-2生長于DMEM培養基,AsPC-1和H6C7生長于RPMI 1640培養基,所有細胞在37 ℃、含5%的CO2的培養箱中進行培養,培養細胞的完全培養基均含有1%青-鏈霉素及10%胎牛血清。

(2)RNA的提取及實時熒光定量(qRT)-PCR:總RNA的提取使用Trizol試劑,隨后將其逆轉錄為cDNA,在20 μl反應體系中進行定量PCR,操作步驟均按照試劑盒說明書進行,ST7L基因mRNA水平按照2-ΔΔCT法通過β-actin進行內源性校正。qRT-PCR用于檢測臨床樣本及細胞系中ST7L的表達水平。

(3)細胞轉染及分組:將細胞接種于6孔板,第2天細胞大部分融合后,使用Lipofectamine2000試劑,將ST7L過表達質粒及空白質粒分別轉染胰腺癌細胞作為ST7L組和對照組,將ST7L敲降質粒及空白質粒分別轉染胰腺癌細胞作為si-ST7L組和si-NC組。轉染步驟嚴格按照說明書進行。

(4)CCK-8檢測:將細胞接種于96孔板,待細胞貼壁相應時間后,向每孔培養液中加入10 μl的CCK-8溶液,充分混合,分別檢測細胞在24 h、48 h、72 h、96 h于450 nm的OD值,反映各組細胞的增殖情況。

(5)流式細胞術:流式細胞術用于分析細胞的凋亡情況,將細胞接種于6孔板,培養3天后,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI),室溫避光條件下孵育15 min,所有樣品在1 h內使用FACSCalibur Ⅱ流式儀進行檢測分析。

(6)Western blot:用細胞裂解液從各組細胞中提取總蛋白,將蛋白與上樣緩沖液混合后100 ℃變性10 min,用10% SDS-PAGE膠分離每個樣品中等量的蛋白質提取物并轉移到PVDF膜上,隨后與相應一抗4 ℃孵育過夜,用羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h,隨后使用ECL發光顯色試劑盒進行顯色顯影,成像儀曝光掃描分析結果。

結 果

1.ST7L在胰腺癌患者血漿、組織及胰腺癌細胞系中的表達情況:胰腺癌患者血漿ST7L表達水平明顯低于健康對照者[(5.64±3.34)比(10.27±7.94),P<0.05]。胰腺癌組織中ST7L的表達水平顯著低于對應癌旁組織[(5.31±2.89)比(12.63±10.36),P<0.05]。ST7L在胰腺癌細胞系PANC-1、AsPC-1、PaCa-2中的表達水平明顯低于胰腺導管正常細胞H6C7[(0.25±0.03)、(0.41±0.04)、(0.18±0.03)比(0.58±0.07),P<0.05]。

2.ST7L對胰腺癌細胞增殖和凋亡能力的影響:ST7L組及對照組細胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均依次升高,ST7L組細胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均明顯低于同期對照組(P<0.05),見表1。ST7L組PANC-1及PaCa-2細胞凋亡率均高于對照組[(34.14±0.61)比(10.67±0.52)、(25.89±0.48)比(13.64±0.70),P均<0.05]。ST7L組PANC-1及PaCa-2細胞凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平均高于對照組[(0.64±0.13)比(0.17±0.04)、(0.55±0.08)比(0.25±0.03),P均<0.05],而Bcl-2表達水平均低于對照組[(0.06±0.02)比(0.57±0.10)、(0.38±0.05)比(0.74±0.08),P均<0.05]。

表1 ST7L組及對照組胰腺癌細胞增殖能力比較

3.4組胰腺癌細胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達水平比較:ST7L組細胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達均低于對照組;si-ST7L組細胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達均高于si-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 4組胰腺癌細胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達水平比較

討 論

由于胰腺癌隱匿的臨床病程和不明確的癥狀,診斷通常較晚。一項多中心研究表明,通過早期篩查檢測到的胰腺癌患者5年生存率為73.3%、中位生存時間為9.8年,而非篩查發現的胰腺癌患者的生存率為1.5年[10]。有研究發現,約5%～10%的胰腺癌是由已知基因突變或具有家族聚集引起的[11]。本研究從胰腺癌發生發展的分子機制出發,探討ST7L對胰腺癌細胞增殖及凋亡能力的影響,以期為胰腺癌的治療提供新思路。

近年來ST7L被發現在多種腫瘤中表達下調,包括肺癌[12]、乳腺癌[13]和肝細胞癌[14],提示ST7L在腫瘤的發生發展中扮演重要角色。我們前期研究發現ST7L作為微小RNA(miRNA)-331-3p的新型靶基因,可減弱miR-331-3p誘導的細胞增殖和上皮間充質轉化(EMT)介導的體外轉移[15]。然而,ST7L對胰腺癌細胞增殖和凋亡能力的影響及作用機制仍未見報道。本研究發現ST7L在胰腺癌患者血漿、組織及胰腺癌細胞系中的表達水平明顯降低,由于ST7L在PANC-1和PaCa-2中的表達明顯降低,且兩者均為高侵襲性人胰腺癌細胞系,因此我們選擇兩者作進一步研究,結果表明ST7L可抑制胰腺癌細胞增殖,促進胰腺癌細胞凋亡。為了進一步探討ST7L發揮作用的分子機制,我們發現過表達ST7L可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活,而抑制ST7L的表達可激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的進化途徑,參與調節關鍵的細胞功能,越來越被認為是抗癌治療的潛在重要靶點[16-17]。Wnt通路的異常激活是不同類型惡性腫瘤的基礎,包括結直腸癌[18]、乳腺癌[19]和肝癌[20]等。研究表明miR-489-3p可通過靶向PR結構域蛋白5抑制Wnt/β-catenin信號通路,調控人急性髓系白血病細胞系U937的遷移和侵襲[21]。當Wnt通路被激活時,β-catenin磷酸化被抑制導致細胞中β-catenin增加并轉位到細胞核中,促進癌基因如c-Myc、Cyclin D1的轉錄,最終促進細胞增殖、分化和遷移等基因的表達[22]。為了探討ST7L對Wnt/β-catenin信號通路的作用,我們檢測了其主要成分β-catenin及關鍵下游效應分子c-Myc和Cyclin D1的表達,結果表明ST7L可減弱β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的表達,提示ST7L在胰腺癌細胞中可能通過降低Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達來發揮抑癌作用。然而ST7L抑制胰腺癌細胞生長的具體機制,干預其表達能否影響胰腺癌的發展并應用于臨床等問題還需進一步研究。

綜上,本研究表明ST7L在胰腺癌中低表達,可能通過降低Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達來發揮抑癌作用,基于ST7L/Wnt/β-catenin信號軸的干預可能為胰腺癌的臨床治療提供分子基礎和實驗依據。