宏基因組二代測序技術對革蘭陽性球菌重癥肺炎中的診療價值

李水文，黃俊平，寧耀貴*

1廈門大學附屬第一醫院重癥醫學科，廈門 361000；2福建醫科大學附屬漳州市醫院重癥醫學科，漳州 363000

ICU 的重癥肺炎病情進展快、并發癥多、病死率高[1]。既往重癥肺炎的患者病原學上以耐藥革蘭陰性桿菌為主，近年來隨著廣譜抗生素的使用，革蘭陽性球菌感染呈不斷增加趨勢[2]。對重癥肺炎的診治，快速而精準的病原學診斷極為重要，能及時指導臨床抗感染治療方案的制定、調整，提高臨床的治療效果。然而，傳統的病原學檢測方法時效性和敏感性較差，給臨床運用帶來了一定程度的限制。近年來隨著基因測序技術的大量研究及快速發展，宏基因組二代測序技術（mNGS）已成為臨床運用的熱點及科學研究的焦點。該技術通過對患者樣本內DNA 或RNA進行高通量測序，可快速、高效、準確地獲取整個檢測樣品內全部病原體基因組信息[3]。mNGS 是重癥肺炎診斷的重要工具，可以提高早期病原菌檢測率，有助于制訂目標性抗感染治療方案，縮短抗生素暴露時間，提高診療效果。本研究通過采用支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）作為標本，使用mNGS 和傳統病原學檢測這兩種方式對革蘭陽性球菌重癥肺炎（severe pneumonia，SP）進行診斷，以探討BALF mNGS 對革蘭陽性球菌重癥肺炎患者的臨床診療價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 取2021 年5 月至2023 年5 月于廈門大學附屬第一醫院重癥醫學科診療的262 例重癥肺炎病例為研究對象。該研究通過廈門大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核批準｛[2022]科研倫審字（037）號｝。所有患者行支氣管鏡檢查，BALF 行mNGS 檢查，簽屬知情同意書。重癥肺炎診斷標準：均符合《中國急診重癥肺炎臨床實踐專家共識》中重癥肺炎的診斷標準。

1.2 BALF 采集方法 ①部位選擇：病變局限者選擇病變段；彌漫性病變選擇右肺中葉或左上葉舌段。②局部麻醉：在灌洗的肺段經活檢孔注入2%利多卡因1～2 ml，行灌洗肺段局部麻醉。靜脈復合麻醉的患者如仍有強烈的氣道反應，同樣可注入2%利多卡因1～2 ml。③注入生理鹽水：支氣管鏡頂端嵌頓在目標支氣管段或亞端開口后，經操作孔道快速注入用37℃或室溫無菌生理鹽水，總量為60～120 ml，分次注入（每次20～50 ml）。④負壓吸引：注入生理鹽水后，立即用合適的負壓（一般推薦低于100 mmHg）吸引獲取BALF，總回收率≥30%為宜。⑤BALF 收集：回收液中包含約10 ml 支氣管末梢和肺泡中的分泌物；棄去前段可能污染的部分，收集其余部分約3 ml 以上立即送檢。

1.3 傳統病原學檢測方法 所有患者的BALF 均按照支氣管肺泡灌洗術相應操作規程獲取，取20 ml BALF 用作微生物學檢查，要求必須2 h 內送檢。嚴格按照第四版《全國臨床檢驗操作規程》及《美國臨床實驗室臨床標準化要求》2014 版（CLSI）進行菌株的分離鑒定與藥敏實驗。

1.4 mNGS 檢測方法 BALF 樣本處理按照SOP 標準程序提取DNA（深圳華大基因），基于自主研發的高通量測序平臺進行基因測序、生物信息分析。PMseq病原微生物高通量基因檢測，基于宏基因組學技術，提取感染標本中全部微生物的核酸經過不同的樣本前處理，在華大自主高通量測序平臺上進行測序，通過高質量高標準臨床級別數據庫PMDB 比對和多項專利技術的智能生物信息分析算法，獲得疑似致病微生物的種屬信息，一次性無偏性的檢測細菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種病原體，顯著提高病原診斷陽性率，指導臨床靶向使用抗生素，協助感染的精準診療。

1.5 mNGS 檢測前后抗感染治療方案的調整 在262例送檢標本中，mNGS 檢出革蘭陽性球菌90 例，其中34 例維持原抗感染治療方案，56 例進行了抗陽性球菌抗生素的調整或升級。在56 例病例中，13 例增加了抗陽性球菌治療的抗生素；34 例升級了抗生素級別（由頭孢類抗生素、喹諾酮類等抗生素升級為惡唑烷酮類或糖肽類抗生素）；9 例因器官功能指標需要進行了惡唑烷酮類和糖肽類抗生素之間的相互調整。

1.6 觀察指標 病原菌分布情況；BALF 中革蘭陽性球菌的檢出情況；革蘭陽性球菌重癥肺炎mNGS 檢出前后抗生素調整的治療效果。監測指標為抗感染方案調整后72 h 患者的心率（heart rate，HR）、呼吸頻率（respiratory rate，RR）、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、氧合指數（arterial partial pressure of oxygen/fractional concentration of inspired oxygen，PaO2/FiO2）等指標。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0 處理數據。計量資料進行正態性檢驗和方差齊性分析，正態分布資料以±s表示，非正態資料以中位數（四分位距）表示，計數資料以例（率）[例（%）]表示。統計學方法采用獨立樣本t檢驗及χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。對于抗感染方案調整前后的指標比較，使用配對t檢驗或者配對Mann-WhitneyU檢驗。

2 結果

2.1 患者一般資料分析 本研究共納入262 例重癥肺炎患者，其中男性175 例，占66.79%；女性87 例，占33.21%；年齡（64.3±15.4）歲（最小年齡15 歲，最大年齡96 歲）。APACHE Ⅱ評分（19.4±5.1）分；SOFA 評分（10.7±3.4）分。其中糖尿病患者93 例，占35.50%；高血壓患者101 例，38.55%；占免疫性疾病患者17 例，占6.49%；惡性腫瘤患者32 例，占12.21%；精神障礙患者7 例，占2.67%；治療結果好轉的患者238例，占90.84%；死亡患者24例，占9.16%。

2.2 mNGS BALF 病原學檢測情況分析 在送檢的BALF mNGS 檢測病原學分布情況，總例數262 例，其中陰性菌檢出146 例，占55.72%；陽性球菌：90 例，占34.35%；病毒20 例，占7.63%；非典型病原體6 例，占2.29%。

2.3 mNGS 與傳統病原學檢測方法培養出陽性球菌的檢測結果比較 在本研究的262 例患者中，mNGS 陽性球菌檢出90 例（34.35%），非陽性球菌檢出172 例（65.65%）；傳統病原學檢出陽性球菌13 例（4.96%），非陽性球菌檢出249 例（95.04%）。見表1。

表1 mNGS與傳統病原學檢測方法培養出陽性球菌的檢測結果比較 [例（%）]

2.4 mNGS 檢測前后抗感染方案調整效果分析 根據mNGS 檢測結果90 陽性球菌重癥肺炎患者中，其中56例進行了抗感染方案的調整。①調整抗感染治療方案后生命體征好轉，心率（HR）由（116.1±14.5）次/min降至（84.9±14.8）次/min、呼吸頻率（RR）由（27.6±4.0）次/min 降至（19.2±2.7）次/min。②炎癥指標下降明顯，CRP 由88.0 mg/L 降至36.0 mg/L，PCT由13.4 ng/ml 降至3.6 ng/ml，IL-6 由83.5 pg/ml 降至32.0 pg/ml。③呼吸系統指標改善，PaO2由（59.2±7.0）mmHg 升至（88.2±7.6）mmHg，PaCO2由44.0 mmHg降至28.0 mmHg，氧合指數PaO2/FiO2由154.0 升至284.5。上述數據的差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表2、表3、表4。

表2 抗感染方案調整前后生命體征變化情況

表3 抗感染方案調整前后炎癥指標情況

表4 抗感染方案調整前后呼吸系統指標變化情況

3 討論

重癥肺炎是ICU 常見病種，這類患者往往具有病情進展迅速、病死率高、花費巨大，預后差等特點。既往研究顯示，重癥肺炎住院患者病死率約為10%，ICU 患者病死率高達30%[4-5]。如何降低ICU 重癥肺炎患者的病死率、提高治療效果、縮短住院時間、減少診治費用是醫務工作者一直在努力的目標。

在對重癥肺炎患者的診治過程中，存在幾個主要的環節，包括有創或無創的呼吸支持、肺保護性通氣、俯臥位治療、依托ECMO 為基礎的超級肺保護性通氣、病原學及藥敏資料的獲取、抗感染方案的制定等。其中病原學及藥敏資料的獲取是非常重要的環節[6]。獲得病原學及藥敏資料后可以指導臨床治療從經驗性抗感染治療轉為目標抗感染治療，提高治療效率。在社區性肺炎中以革蘭陽性球菌、病毒、非典型病原體多見。在院內重癥肺炎中，病原菌分布以鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌為主。革蘭陽性球菌（包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌等）已成為重癥肺炎的重要病原菌，且耐藥性不斷增加[7]。

如何提高對重癥肺炎中革蘭陽性球菌的檢出率，臨床上也一直在探索新的可行性的方法。傳統的醫院內的病原學診斷方法如痰液涂片鏡檢、痰液培養等方法存在陽性率低，培養耗時長，特異度不高等局限性，已經很難及時指導臨床工作[8-9]。利用纖維支氣管鏡直視下進行痰液祛除及肺泡灌洗，可徹底清除分泌物減少標本的污染，同時采集BALF 標本進行細菌培養，可更準確的獲得病原學資料。BALF 作為檢測標本更有助于指導抗生素治療[10]。

mNGS 也稱為高通量測序技術，具有準確率高、檢測速度快、覆蓋面廣以及產出大等特點[11]。目前mNGS 已被廣泛應用于疑難、危重、特殊病原體檢測[12-13]及感染性疾病診斷中[14]。重癥肺炎患者治療過程中進行肺泡灌洗液病原學微生物mNGS 檢測可提高檢測準確率，便于臨床及時調整治療方案，縮短患者治療時間，獲得理想的治療效果，從而降低病死率，改善預后[15]。在本研究中，通過mNGS 對BALF 的檢測，在重癥肺炎的患者中，提高了對革蘭陽性球菌的檢出率。根據檢測結果進行了抗感染方案的調整，患者的臨床治療效果明顯提高。

綜上所述，mNGS 有助于目前臨床診療過程中提高對疾病的診斷，特別是對于感染性疾病病原學資料的獲取，從而提升臨床治療效果。