安羅替尼對NCI-H226細胞糖酵解和增殖作用機制研究

胡益川 朱述陽 朱潔晨

收稿日期：2023-08-13；修回日期：2023-09-26。

作者簡介：胡益川，碩士研究生。

* 通信作者：朱潔晨，主治醫師，主要從事肺癌的診斷與治療方面的研究。E-mail： 396412645@qq.com。

摘 要：探究安羅替尼干預對人肺鱗癌NCI-H226細胞糖酵解、增殖、克隆形成、遷移的影響及作用機制，為肺癌的體外試驗提供參考依據。將人肺鱗癌NCI-H226細胞分為對照組（不做干預）、10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組（20 μg/mL順鉑）。用活細胞計數（CCK-8）、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EdU）、平板克隆形成、乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒、Transwell小室、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）及蛋白免疫印跡（Western blotting）法對增殖活性、增殖率、克隆形成率、乳酸含量、葡萄糖消耗水平、細胞遷移數及上皮細胞間質化（EMT）相關因子表達水平進行測定。對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞增殖活性、增殖率、克隆形成率、乳酸含量、葡萄糖消耗水平及N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和纖維黏連蛋白（FN）mRNA和蛋白表達水平組間比較差異具有統計學意義（P<0.05）。20、40 μmol/L安羅替尼和陽性藥物組細胞增殖活性高于對照組（P<0.05）。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組細胞增殖率、克隆形成率、乳酸含量、葡萄糖消耗水平及N-cadherin、vimentin和FN mRNA和蛋白表達水平高于對照組（P<0.05）。安羅替尼可顯著抑制人肺鱗癌NCI-H226細胞的糖酵解、增殖、克隆形成及遷移。

關鍵詞：安羅替尼；肺癌；糖酵解；癌細胞增殖；克隆形成

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.010

Effects of Anlotinib on Glycolysis， Proliferation and Colony Formation of Lung Cancer Cells

HU Yichuan1， 2， ZHU Shuyang1， ZHU Jiechen1*

（1. Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou 221000， China;

2. Department of Respiratory and Critical Care Medicine， Suqian Zhongwu Hospital， Suqian 223800， China）

Abstract： To investigate the effects and mechanism of anlotinib intervention on glycolysis， proliferation， colony formation and migration of human lung cancer NCI-H226 cells， to provide reference for in vitro test of lung cancer. Human lung cancer NCI-H226 cells were divided into control group which is without intervention， experimental group involving 10， 20， 40 μmol/L anlotinib， and positive control group involving 20 μg/mL cisplatin. The cell counting kit-8 （CCK-8）， 5-acetylene-2′ deoxyuracil riboside （EdU） staining， plate clone formation， lactic acid detection kit， glucose detection kit， Transwell assay， RT-qPCR and Western blotting （WB） assays were used to detect proliferation viability， proliferation， colony-formation ability， lactic acid content， glucose consumption level， cell migration number and expression level of related factor levels. The proliferation activity， proliferation rate， clone formation rate， lactate content， glucose consumption level， N-cadherin， vimentin and fibronectin （FN） of NCI-H226 cells in control group， experimental group and positive drug group. There were significant differences in mRNA and protein expression levels between groups （P<0.05）. The cell proliferation activity of 20 and 40 μmol/L anlotinib and positive drug groups was higher than that of control group （P<0.05）. The cell proliferation rate， clone formation rate， lactate content， glucose consumption level and mRNA and protein expression levels of N-cadherin， vimentin and FN in the experimental group and the positive drug group were higher than those in the control group （P<0.05）. Anlotinib can significantly inhibit glycolysis， proliferation， colony formation and migration of human lung cancer NCI-H226 cells.

Key words： anlotinib; lung cancer; glycolysis; proliferation of cancer cells; colony formation

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 080-089）

肺癌（lung cancer）為全球范圍內對人類健康威脅較大的常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在我國位居首位［1］。由于早期缺乏特異性癥狀，肺癌被發現時大多已為中晚期。在肺癌中，非小細胞肺癌占85%以上［2］。非小細胞肺癌又分為肺腺癌、肺鱗癌和大細胞癌，肺鱗癌占30%［3-5］。肺鱗癌在臨床中具有診斷時分期晚、中心性生長等特殊的病理特征，治療難度較大［6］。因而，了解探究其相關機制對于治療肺癌具有重要意義。腫瘤細胞與正常細胞相比，除了有無限增殖和遷移能力，代謝重排也是其另一重要特征。腫瘤細胞為適應增殖、逃避機體免疫系統殺傷等，在有氧條件下為獲取能量主動選擇糖酵解方式，即為Warburg效應［7］。有研究顯示，多種腫瘤中可見上皮細胞間質化（epithelialization，EMT），其可以通過誘導代謝酶的活性變化來影響腫瘤細胞相關特征的變化［8］。安羅替尼是由中國正大天晴藥業集團自主研發的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，可以有效地抑制血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGF）、成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGF）和血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）等激酶，通過多靶點實現對癌細胞的抑制作用［9-12］。研究表明，在肺癌治療中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑和免疫檢查點抑制劑有一定療效，但多數研究集中在肺腺癌中，對于肺鱗癌臨床用藥的相關研究較少，故進一步開展關于安羅替尼通過糖酵解途徑對肺鱗癌NCI-H226細胞具體機制的研究，可以為其臨床治療肺鱗癌補充試驗依據。因此，本研究旨在探究安羅替尼對肺鱗癌NCI-H226細胞糖酵解、增殖、克隆形成、遷移的影響及作用機制，為肺癌的體外試驗提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、主要試劑與儀器

人肺鱗癌細胞NCI-H226購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。安羅替尼（anlotinib）購自正大天晴藥業集團，順鉑購自上海源葉生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI-1640培養基購自上?；鄯f生物科技有限公司，活細胞計數（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒購自日本Dojindo公司，胰蛋白酶購自美國HyClone公司，乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒購自美國BioVision公司，5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（5-acetylidene-2′-deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，鼠抗人［N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纖維黏連蛋白（fibronectin，FN）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）及β-actin］一抗、二抗包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記的羊抗鼠IgG（H+G）來源于武漢三鷹生物技術有限公司，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。二氧化碳培養箱（MCO18AIC）購自日本三洋電機公司，酶標儀（IMARK）購自美國BIO-RAD公司，GelDoc2000型凝膠成像系統購自美國Backman公司。

1.2 方法

1.2.1 NCI-H226細胞培養

將NCI-H226細胞（密度≥80%）接種于培養板或培養皿中，使用RPMI-1640完全培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），并置于37℃、5% CO2、70%～80%濕度的培養箱中培養。

1.2.2 分組及給藥

將NCI-H226細胞分為對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組，對照組細胞不做干預，10、20、40 μmol/L安羅替尼組分別以10、20、40 μmol/L安羅替尼進行干預，陽性藥物組加入20 μg/mL順鉑進行干預，每組重復3次。

1.2.3 NCI-H226細胞的增殖活性測定

將細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104個/孔。細胞分組與給藥同1.2.2。分別加藥處理24 h后，各孔加入體積分數為10%的CCK-8溶液；細胞與CCK-8試劑在37℃、5% CO2培養箱中孵育培養1 h后，在酶標儀上檢測各孔細胞在450 nm處的光密度（OD450 nm）值。

1.2.4 NCI-H226細胞的增殖率測定

藥物處理24 h后，分別與10 μmol/L EdU溶液在37℃、5% CO2培養箱中孵育培養2 h；然后，細胞先后經受4%組織細胞固定液室溫固定15 min、0.3% Triton X-100溶液室溫通透10 min和TAMRA染色反應體系溶液室溫避光孵育30 min。最后，按照說明書用試劑盒提供的Hoechst 33342溶液對細胞進行核復染。固定、通透、反應之間分別用3% BSA進行3次洗滌。在熒光顯微鏡下觀察并采集EdU紅色熒光信號和Hoechst 33342藍色熒光信號，并用ImageJ軟件進行細胞數目確定。增值率計算公式如下：

增殖率/%=紅色細胞數/藍色細胞數×100% （1）

1.2.5 NCI-H226細胞的克隆形成率測定

將接種于6孔板的細胞（2×105個/孔）培養24 h后，經固定（甲醇15 min）、染色（結晶紫30 min）、清洗（磷酸鹽緩沖液）風干后拍照，計算細胞克隆形成率。公式如下：

細胞克隆形成率/%=（克隆細胞數/接種細胞數）×100% （2）

1.2.6 NCI-H226細胞上清液中乳酸含量與葡萄糖消耗水平測定

用乳酸含量檢測試劑盒檢測細胞上清液中的乳酸水平，用葡萄糖含量檢測試劑盒檢測上清液中的葡萄糖消耗水平，以不含細胞的對照孔培養液中的葡萄糖質量濃度作為初始質量濃度。按如下公式計算葡萄糖消耗量：

葡萄糖消耗量=初始葡萄糖質量濃度－實測葡萄糖質量濃度 （3）

1.2.7 NCI-H226細胞的遷移能力測定

各組細胞在藥物干預24 h后，重懸在無血清的RPMI-1640培養基中，并調整細胞密度為每毫升4.5×105個細胞。取200 μL細胞懸液接種到Transwell小室的上室中，下室則填充500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。將上述細胞遷移體系置于37℃、5% CO2培養箱中，24 h后，下室膜表面的細胞與甲醇室溫孵育15 min，再與1%結晶紫染色液室溫孵育20 min。最后，將小室置于光學顯微鏡下觀察，并采集細胞圖片。ImageJ軟件分析計算遷移細胞數量（小室下表面紫色細胞數量）。

1.2.8 NCI-H226細胞中EMT相關因子mRNA

表達情況測定

取干預24 h時的NCI-H226細胞，利用細胞/組織總RNA提取試劑盒提取各組干預后的細胞總RNA，具體步驟按照說明書進行；利用超微量分光光度計法檢測提取RNA樣品的質量濃度及純度，取1 μg RNA作為模板，在逆轉錄試劑盒的幫助下在PCR儀中合成模板鏈cDNA；然后，取2 μL cDNA在SYBR qPCR MasterMix、特殊引物對的幫助下在實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀中進行cDNA擴增。以GAPDH為內參，根據循環數（Ct）和2–ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達水平，引物序列見表1。

表1 EMT相關因子RT-qPCR引物序列

Tab. 1 Primer sequence of EMT-related factors RT-qPCR

Gene Primer sequence

GAPDH F： 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′

R： 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′

E-cadherin F： 5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′

R： 5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′

Vimentin F： 5′-GCGTGACGTACGTCAGCAATATGA-3′

R： 5′-GTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTT-3′

N-cadherin F： 5′-AGAGGAAGACCAGGACTATGACTTGAG-3′

R： 5′-TACTGTGGCTCAGCGTGGATAGG-3′

FN F： 5′-TGGAGGAAGCCGAGGTTT-3′

R： 5′-CAGCGGTTTGCGATGGTA-3′

1.2.9 NCI-H226細胞中EMT相關因子蛋白表達

水平測定

將細胞接種于6孔板，接種密度為1×105個/孔。各組細胞在藥物作用24 h后，被放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液重懸并裂解；在4℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清液，即總蛋白樣品。蛋白樣品先經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80～120 V恒壓法）進行蛋白分離，再經過電泳法（300 mA恒流法）進行蛋白轉膜。載有蛋白的聚偏二氟乙烯（polyvinglidene fluoride，PVDF）膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，在4℃進行一抗孵育過夜或室溫一抗孵育2 h；接下來，進行室溫二抗孵育2 h。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進行3～5次膜洗滌。使用凝膠成像系統拍照記錄，并用ImageJ軟件進行蛋白灰度分析。

1.3 統計學分析

用GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以平均值±標準差（x±s）表示，差異性分析采用單因素方差分析（多組間）和新復極差法檢驗（Dunnetts t）（兩組間），P<0.05表示差異有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 安羅替尼抑制NCI-H226細胞的增殖活性比較

干預24 h后，對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞增殖活性分別為0.92±0.06、0.81±0.05、0.54±0.06、0.45±0.03、0.53±0.04，組間比較差異具有統計學意義（F=51.314，P<0.05）。對照組和10 μmol/L安羅替尼組間比較無統計學意義（P>0.05）。20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組細胞增殖活性低于對照組（P<0.05）。具體情況詳見圖1。

2.2 安羅替尼抑制NCI-H226細胞的增殖率

干預24 h后，對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226增殖率分別為（0.54±0.03）%、（0.46±0.04）%、（0.36±0.03）%、（0.26±0.03）%、（0.30±0.02）%，組間比較差異具有統計學意義（F=44.499，P<0.05）。對照組和10 μmol/L安羅替尼組間比較無統計學意義（P>0.05）。20、40 μmol/L安羅替尼和陽性藥物組細胞增殖率低于對照組（P<0.05）。NCI-H226細胞的增殖率情況見圖2。

2.3 安羅替尼抑制NCI-H226細胞的克隆形成能力比較

為了研究NCI-H226細胞的群體依賴性和增殖能力，本研究用平板克隆法測定了細胞的克隆形成能力。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組處理24 h后，NCI-H226細胞的克隆數呈劑量依賴性降低。對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞克隆形成率分別為（55.97±4.88）%、（46.63±5.32）%、（37.30±2.71）%、（12.30±4.26）%、（6.30±2.99）%，組間比較差異具有統計學意義（F=80.873，P<0.05）。對照組和10 μmol/L安羅替尼組間比較無統計學意義（P>0.05）。20、40 μmol/L安羅替尼和陽性藥物組細胞克隆形成率低于對照組（P<0.05）。NCI-H226細胞克隆形成情況見圖3。

2.4 安羅替尼抑制NCI-H226細胞的乳酸生成與

葡萄糖消耗水平比較

干預24 h，對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞乳酸含量分別為（27.80±2.34）、（22.45±2.37）、（16.65±1.90）、（14.79±1.38）、（13.70±1.52）μmol·10-5 cell，葡萄糖消耗水平分別為（17.63±0.61）、（14.42±0.61）、（8.67±0.77）、（6.66±0.72）、（6.37±0.35）μmol·10-5

cell，組間比較差異具有統計學意義（F乳酸含量=27.867，P<0.05；F葡萄糖消耗水平=191.309，P<0.05）。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組細胞乳酸含量、葡萄糖消耗水平低于對照組（P<0.05）。具體情況詳見圖4。

2.5 安羅替尼抑制NCI-H226細胞的遷移能力比較

干預24 h后，對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞遷移數分別為（66.67±2.52）、（35.33±5.03）、（16.00±2.65）、（10.00±2.65）、（10.33±2.89）個，組間比較差異具有統計學意義（F=161.698，P<0.05）。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組細胞遷移數低于對照組（P<0.05）。細胞的遷移情況詳見圖5。

2.6 安羅替尼對NCI-H226細胞中EMT相關因子mRNA表達水平比較

RT-qPCR檢測結果顯示：對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組E-cadherin mRNA相對表達量分別為1.00±0.09、1.19±0.03、1.56±0.06、1.73±0.06、1.85±0.06，N-cadherin mRNA相對表達量分別為1.00±0.10、0.75±0.03、0.55±0.06、0.44±0.04、0.38±0.05，vimentin mRNA相對表達量分別為1.00±0.10、0.73±0.06、0.54±0.05、0.44±0.09、0.40±0.04，FN mRNA相對表達量分別為1.00±0.11、0.87±0.04、0.70±0.07、0.64±0.06、0.48±0.04，組間比較差異具有統計學意義（FE-cadherin mRNA=87.843，FN-cadherin mRNA=54.231，Fvimentin mRNA=36.721，FFN mRNA=25.221，P均<0.05）。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組E-cadherin mRNA相對表達量高于對照組，N-cadherin、vimentin、FN mRNA相對表達量低于對照組（P<0.05）。具體情況詳見圖6。

2.7 安羅替尼對NCI-H226細胞中EMT相關因子的蛋白表達水平比較

蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）檢測結果顯示：對照組、10、20、40 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組NCI-H226細胞E-cadherin蛋白水平分別為0.22±0.04、0.43±0.02、0.51±0.05、0.63±0.02、0.63±0.02，N-cadherin蛋白水平分別為0.64±0.04、0.36±0.03、0.25±0.02、0.16±0.02、0.19±0.02，vimentin蛋白水平分別為0.65±0.03、0.64±0.04、0.55±0.01、0.47±0.04、0.44±0.02，FN蛋白水平分別為0.74±0.02、0.65±0.04、0.43±0.02、0.45±0.04、0.33±0.02，組間比較差異具有統計學意義（FE-cadherin=80.755，FN-cadherin=147.455，Fvimentin=67.650，FFN=108.835，P均<0.05）。10、20、40 μmol/L安羅替尼組和陽性藥物組E-cadherin蛋白高于對照組，N-cadherin、vimentin、FN蛋白低于對照組（P<0.05）。具體情況詳見圖7。

3 討論

肺癌作為常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率逐漸升高［15］。目前臨床上主要采取手術治療、放化療、靶向治療等手段對肺癌進行治療，但肺癌的局部復發、遠處轉移涉及復雜的生物學過程［16-17］。肺鱗癌屬于肺癌中的一種組織學類型，其增殖、遷移涉及諸多功能及結構異常。Warburg效應是指在腫瘤細胞生長繁殖時，即使氧氣足夠，它們依舊會進行糖酵解代謝反應，葡萄糖消耗加快，乳酸產量增加［18］。安羅替尼具有全面、多靶點、高選擇性、強效抑制的特點。相關研究表明，安羅替尼可以有效抑制多種癌細胞增殖和轉移［19-20］。本研究結果顯示，安羅替尼可以抑制肺癌細胞的增殖和遷移，這與前人關于安羅替尼抗癌功能的試驗結果相一致［21］。吳國成等［22］的研究表明，黃連素能夠調節非小細胞肺癌A549中的糖酵解水平。在本研究中，NCI-H226細胞經安羅替尼干預處理后乳酸含量與葡萄糖消耗水平逐漸降低，說明安羅替尼能夠抑制肺鱗癌NCI-H226細胞糖酵解水平、增殖、克隆形成及遷移。以上結果揭示了安羅替尼在肺癌糖酵解、增殖、克隆形成及遷移過程中發揮重要作用。

研究顯示，腫瘤細胞代謝重編與EMT進程及腫瘤細胞轉移關系密切［23-24］。EMT是指上皮細胞在一些因素作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得浸潤和遷移能力，變成具備間充質細胞形態和特性的細胞的改變，被認為是腫瘤細胞發生發展和轉移過程中至為關鍵的環節。抑制EMT被認為是治療腫瘤細胞轉移的有效方式。在乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌等的遷移過程中均伴隨著EMT的發生［25-28］。在EMT過程中，上皮表型細胞的減少和間質表型細胞的增加，使細胞變成紡錘狀，在此過程中，細胞的運動性和遷移能力更強［29-30］。De Marcondes等［31］的研究表明，安羅替尼抑制直腸癌細胞的遷移與EMT關系密切。本研究檢測了安羅替尼處理NCI-H226細胞24 h后EMT的表達情況，發現處理后NCI-H226細胞N-cadherin、vimentin和FN表達均顯著下降，而E-cadherin表達明顯升高。這些結果說明，在安羅替尼處理后，NCI-H226細胞的EMT進程被抑制，癌細胞遷移能力受到抑制，表明安羅替尼能夠抑制肺鱗癌NCI-H226細胞的EMT進程。

綜上所述，安羅替尼可抑制人肺鱗癌NCI-H226細胞糖酵解水平、增殖、克隆形成、遷移及EMT進程。本研究以期為進一步豐富安羅替尼治療肺癌提供新的試驗基礎。

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