隱丹參酮對銅綠假單胞菌的生長及生物膜形成的抑制作用

馬書恒 繆林坪 陳荻秋 韓麗 張富凱 賀氣志

收稿日期：2023-09-11；修回日期：2023-09-27。

基金項目：國家自然科學基金青年項目（82100040）；湖南省教育廳科學研究項目（湘教通〔2022〕323號-22B0899）；湖南省大學生創新創業訓練項目（湘教通〔2021〕197號-3905）；湖南省大學生創新創業訓練計劃重點支持領域項目（湘教通〔2023〕237號-38）；長沙醫學院大學生創新創業訓練項目（長醫教〔2023〕51號-108）。

作者簡介：#表示為共同第一作者。

* 通信作者：賀氣志，副教授，主要從事中醫藥抗感染的相關研究及生物傳感器設計。E-mail： 314190831@qq.com。

摘 要：為研究隱丹參酮（cryptotanshinone）對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生長和生物膜形成的影響及其機制，采用微量稀釋法測定隱丹參酮對銅綠假單胞菌的最小抑菌質量濃度（MIC），利用結晶紫染色法、倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響，再采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測隱丹參酮對銅綠假單胞菌生物膜形成相關基因LasI、LasR、RhlI和RhlR的表達的影響。隱丹參酮對銅綠假單胞菌的MIC為800.0 μg/mL；結晶紫染色后，隱丹參酮的質量濃度為800.0 μg/mL時抑制菌膜效果最佳，且呈劑量依賴性（P<0.01）；利用激光共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對生物膜的形成和分布，200.0 μg/mL時抑菌效果顯著提升。在200.0～800.0 μg/mL的質量濃度范圍內，800.0 μg/mL的隱丹參酮對LasI、LasR、RhlI和RhlR基因的表達具有抑制作用（P<0.01）。隱丹參酮抑制銅綠假單胞菌生物膜形成機制可能是通過下調LasI等基因的表達。本研究表明，隱丹參酮可以作為群體感應抑制劑干預銅綠假單胞菌的耐藥，為臨床多重耐藥銅綠假單胞菌（MDR-PA）的治療提供參考。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；生物膜；隱丹參酮；群感系統；耐藥性

中圖分類號：R378.99+1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.011

Inhibitory Effect of Cryptotanshinone on Biofilm Formation of Pseudomonas aeruginosa

MA Shuheng1a#， MIAO Linping1b#， CHEN Diqiu1a， HAN Li1b， 2， ZHANG Fukai1b， HE Qizhi1b， 2*

（1. Changsha Medical University a. The First Clinical College， b. School of Basic Medical Science， Changsha 410219， China;

2. Hunan Provincial Key Laboratory of the Research and Development of Novel Pharmaceutical Preparations， Changsha 410219， China）

Abstract： To investigate the effects of cryptotanshinone on the growth and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and its mechanism， the minimum inhibitory concentration （MIC） of cryptotanshinone on P. aeruginosa was determined by microdilution， and the effect of cryptotanshinone on? P. aeruginosa biofilm formation was observed by crystal violet staining， inverted microscope and laser scanning confocal microscope， and the effect of cryptotanshinone on P. aeruginosa biofilm formation was measured by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The effect of cryptotanshinone on the expression of genes related to P. aeruginosa biofilm formation was detected by RT-qPCR. The MIC of cryptotanshinone on P. aeruginosa was 800.0 μg/mL; after crystal violet staining， the best inhibition of biofilm was observed at the mass concentration of cryptotanshinone of 800.0 μg/mL in a dose-dependent manner （P<0.01）. The formation and distribution of biofilm by cryptotanshinone were observed by confocal laser microscopy， and the inhibition effect was significantly enhanced at 200.0 μg/mL. In the range of 200.0～800.0 μg/mL mass concentration， cryptotanshinone at 800.0 μg/mL mass concentration inhibited the expression of LasI， LasR， RhlI and RhlR genes （P<0.01）. The mechanism of cryptotanshinone inhibition of? P. aeruginosa biofilm formation may be through the down-regulation of LasI and other genes expression. The present study suggests that cryptotanshinone can be used as a group-sensing inhibitor to intervene in the drug resistance of P. aeruginosa， which can provide a reference for the treatment of multi-drug-resistant P. aeruginosa （MDR-PA） in the clinic.

Key words： Pseudomonas aeruginosa; biofilm; cryptotanshinone; quorum sensing; drug resistance

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 090-096）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是常見的條件致病菌，是導致醫院內感染和呼吸及相關性肺炎的主要原因，在囊性纖維化病人和免疫缺陷個體中引起的發病率和死亡率較高。PA對多種抗生素具有耐藥性，包括氨基糖苷類（aminoglycosides）、喹諾酮類（quinolones）和β-內酰胺類（β-lactams）。PA產生多重耐藥性的原因主要是其具有多種內生性、獲得性和適應性抗生素耐藥機制。其中，生物膜介導的適應性耐藥可以產生多重耐藥持久細胞，阻止抗生素治療靶點的合成，從而形成多重耐藥性［1-3］。

群體感應（quorum sensing，QS）系統是細菌之間通過自誘導信號分子進行交流的信號通路，其通過監測細菌密度和調控細菌行為調節細菌生物膜形成。PA的群感系統分別有Las、Rhl、PQS和IQS 4個系統，Las和Rhl系統是PA主要的2個QS系統。Las和Rhl系統都受到N-?；呓z氨酸內酯（N-acyl-homoserine lactone，AHL）自誘導信號分子調節，LasR和RhlR基因決定生成轉錄調節因子，LasI和RhlI基因決定生成合成酶，產生AHL同系物3OC12-HSL和C4-HSL自誘導信號分子。隨著細菌密度的不斷增大，自誘導信號分子達到一定閾值，LasR和RhlR分別與3OC12-HSL和C4-HSL結合，Las和Rhl系統被激活，調節細菌生物膜的形成［4-5］。有研究發現，該系統可造成細胞凋亡從而破壞腸上皮屏障［6］。

隱丹參酮（cryptotanshinone）是一種二萜醌類化合物（圖 1），提取自植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge），具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用，同時還具有對人體毒副作用小的特點［7-8］。此外，隱丹參酮還可以抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等浮游細菌 ［9-10］ 的生長。然而，對于隱丹參酮對生物膜抑制作用機制的研究還很缺乏。因此，我們假設隱丹參酮可能通過抑制Las和Rhl系統的表達抑制PA生物膜的形成。本研究采用體外觀察的方法檢測隱丹參酮對PA生物膜形成的抑制作用，為PA感染的治療和耐藥性的研究提供依據。

圖1 隱丹參酮的化學結構

Fig. 1 The chemical structure of cryptotanshinone

1 材料與方法

1.1 材料

隱丹參酮、1%結晶紫溶液購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇購于北京蘭博康斯科技有限公司；PA為臨床分離菌，由長沙醫學院第一附屬醫院提供；12孔板、96孔板、溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養基、UNlQ-10柱式總RNA分離試劑盒等購于生工生物工程（上海）股份有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 隱丹參酮對PA最小抑菌濃度的測定

活化的PA接種至液體LB培養基，37℃搖床過夜培養8 h，取對數生長期的菌液，使用液體LB培養基稀釋至1.5×108 CFU/mL菌懸液備用。使用液體LB培養基將隱丹參酮稀釋至質量濃度為0～800.0 μg/mL。在96孔板中，每個孔加入100 μL的菌懸液和100 μL稀釋后含隱丹參酮的培養液，混合后于37℃培養24 h，使用酶標儀測定OD600 nm值（細菌培養液在600 nm波長處的吸光值）。液體LB培養基作空白對照，每組設3個復孔。

1.2.2 結晶紫染色法觀察隱丹參酮對PA生物膜

形成的影響

將100 μL 1.5×108 CFU/mL的 PA菌液接種到96孔板中，分別加入隱丹參酮（0～800.0 μg/mL）溶液，于 37℃恒溫培養箱中靜置培養48 h。吸出浮游菌，使用PBS緩沖液沖洗孔板3次，向每個孔中加入100 μL甲醇固定15 min，棄去甲醇溶液，使用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次。向每個孔中加入100 μL 1%結晶紫溶液，并在室溫下染色5 min。隨后吸出1%結晶紫溶液，用蒸餾水洗去多余的染液，自然風干后，向各孔中加入100 μL 體積分數為33%的冰醋酸溶液溶解5 min，用酶標儀在570 nm處測量培養孔中溶液的OD570 nm值（細菌培養液在570 nm波長處的吸光值），根據獲得的OD570 nm值測定生物膜形成的能力［11］，每組設3個復孔。

1.2.3 顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

取12孔細胞培養板，孔中放入無菌玻片，每孔分別加入1 mL菌液和1 mL各質量濃度的隱丹參酮溶液（0～800.0 μg/mL），37℃靜止培養24 h后，吸出多余液體，使用PBS緩沖液洗滌3次，甲醇固定15 min后，生理鹽水洗滌3次，自然風干。每孔加入500 μL配制好的結晶紫染色劑或SYTO9染色劑，避光染色15 min后，吸出染色液，使用生理鹽水洗滌3次。取出玻片，制片后放于倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察PA生物膜形成情況。

1.2.4 隱丹參酮對PA生物膜形成相關基因表達的影響

將PA接種于96孔板，每孔加入200 μL LB培養基。每個孔中加入不同質量濃度的隱丹參酮溶液（0～800.0 μg/mL），37℃靜置培養48 h。收集浮游細菌，離心，收集沉淀物，使用UNlQ-10柱式總RNA分離試劑盒提取沉淀物細胞的總RNA。按照生產廠家提供的程序對生物膜形成的相關基因LasI、LasR、RhlI和RhlR進行RT-qPCR，并從中獲得RT-qPCR數據。RT-qPCR分析所用引物見表1。重復試驗3次。

表1 引物信息

Tab. 1 Primer information

Gene Primer sequence

LasI

F： GAAATCGATGGTTATGACGC

R： CGGCACGGATCATCATCTTC

LasR

F： ATGGCCTTGGTTGACGGT

R： TCAGAGAGTAATAAGACCCAAATTAACG

RhlI

F： TCAGGTCTTCATCGAGAAGC

R： CGTTGCGAACGAAATAGCG

RhlR

F： TGGATCCGGCGATCCTCAAC

R： GCTCTAGAGCTTCTGGGTCAGCAACT

注：引物序列來自文獻［12-13］ 。

Note： Primer sequences from the literature［12-13］.

1.2.5 數據分析

采用SPSS 25.0軟件對試驗數據進行統計分析。數據以平均值±標準差（x±s）表示，藥物干預組與空白對照組的差異采用單因素方差分析，P<0.05，差異有統計學意義。

2結果與分析

2.1 隱丹參酮對PA最小抑菌質量濃度的測定

隨著隱丹參酮質量濃度的增加，PA的生長顯著受到抑制（圖 2）。25.0 μg/mL的隱丹參酮對PA生長的抑制并不顯著；50.0 μg/mL的隱丹參酮對PA生長有顯著抑制（P<0.05）；800.0 μg/mL的隱丹參酮對PA的生長完全抑制（P<0.01）；隱丹參酮對于PA生長的MIC為800.0 μg/mL。這說明隱丹參酮對于PA有抑菌活性。

2.2 結晶紫染色法觀察隱丹參酮對PA生物膜

形成的影響

利用結晶紫染色法測定不同質量濃度隱丹參酮對PA生物膜形成的影響（圖3）。由陰性對照孔3次OD570 nm值計算出平均值及標準差的3倍作為臨界值（optical delnsity critical，ODC），其大小為0.04，PA的OD570 nm為1.55，有很強的生物膜形成能力。加入100.0 μg/mL的隱丹參酮，PA的生物膜形成開始明顯減少（P<0.05），隨著隱丹參酮質量濃度的增加，生物膜形成逐漸減少，當加入質量濃度為800.0 μg/mL的隱丹參酮時，生物膜形成被完全抑制（P<0.01）。結果證明，隱丹參酮能有效抑制PA生物膜的形成。

2.3 結晶紫染色觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

結晶紫染色后于倒置顯微鏡下觀察生物膜的形成情況（圖4）?？瞻讓φ战M形成的生物膜密集、均勻。隨著隱丹參酮質量濃度增大，生物膜形成量呈現依賴性減少。隱丹參酮質量濃度達到100.0 μg/mL時，生物膜顯著減少；質量濃度達到800.0 μg/mL時，幾乎無生物膜生長。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響（圖5）?？瞻讓φ战M的PA形成片狀的生物膜，均勻覆蓋在玻片上，浮游細菌較少。質量濃度小于100.0 μg/mL的隱丹參酮作用于PA，生物膜形成時未有顯著的抑制效果，PA仍以生物膜形式集中黏附于玻片表面；隱丹參酮質量濃度為100.0 μg/mL時，PA形成的生物膜開始減少，分布較分散，生物膜周圍有少量的浮游細菌；隨著質量濃度的增加，PA的數量及生物膜形成逐漸減少，隱丹參酮質量濃度為800.0 μg/mL時，PA幾乎不形成生物膜，細菌比較分散。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察的結果與倒置顯微鏡觀察的結果相同。

2.5 隱丹參酮對PA生物膜形成相關基因表達的影響

為探究隱丹參酮抑制PA生物膜形成的機制，在不同質量濃度隱丹參酮作用下測定生物膜形成相關基因的表達。LasI、LasR和RhelI、RhlR基因分別組成Las系統和Rhl系統，可以調節PA的毒力因子和生物膜的形成。試驗結果表明（圖6）：隱丹參酮可以抑制Las和Rhl系統中LasI、LasR、RhlI和RhlR基因的表達（P<0.05）；隱丹參酮質量濃度為100.0 μg/mL時，LasI基因表達量相較于對照組未有明顯差異，LasR、RhlI和RhlR基因的表達被顯著抑制（P<0.05）；隱丹參酮質量濃度為200 μg/mL時，4個基因表達量均顯著下降（P<0.05）；隱丹參酮質量濃度為800.0 μg/mL時，4個基因的表達量下降50%以上（P<0.05）。由上述結果可以得出，隱丹參酮能夠通過抑制PA的Las和Rhl系統抑制生物膜的形成。

3 討論

PA是導致醫院內感染的常見細菌之一，常見于燒傷及免疫低下相關患者的繼發感染中。在臨床應用的抗感染治療過程中，由于PA本身存在較強的固有耐藥性，并且隨著抗生素的濫用，其產生了多重耐藥性。PA的感染治療成為了臨床工作的重點和難點。國內外對PA的耐藥機制展開了大量的研究，研究結果表明，生物膜的形成是PA耐藥機制的主要原因之一［14-15］。因此，抑制PA的生物膜形成對解決其耐藥問題起著重要作用。

研究發現，中草藥含有多種抑菌活性成分，且作用效果顯著。 Wang等［16］的研究證明，魚腥草酸鈉可以有效控制PA的生物膜分散能力，并可以通過藥物劑量依賴性的方法控制關鍵生物膜調控劑bdlA基因的表達及其有關蛋白質的形成，也可以控制QS體系中的Las的表達；Guo等［17］證明，穿心蓮內酯可以通過干擾QS系統降低雞致病性大腸桿菌的致病性。此外，中藥還具有價格低廉、副作用小、不易產生耐藥性等優點。丹參是天然的草本植物，有活血化瘀、鎮靜安神等藥效。研究發現，其有治療心血管疾病和惡性腫瘤的功效［18-19］，而對細菌感染的治療報道較少。隱丹參酮是提取自丹參的脂溶性物質，具有抗菌抗炎，抗腫瘤、抗氧化等活性。薛明等［20］的研究顯示，隱丹參酮對于金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制生長作用。本研究通過試驗測定隱丹參酮的MIC為800 μg/mL，表明其對PA的生長具有抑制作用，具有抗菌活性。

PA的多重耐藥性與生物膜的形成密切相關。一些研究表明，隱丹參酮對金黃色葡萄球菌具有抗生物膜活性［21］。在本研究中，我們進一步研究了隱丹參酮對PA的抗生物膜活性。在結晶紫染色法中，隨著隱丹參酮質量濃度的增加，OD570 nm值呈劑量依賴性減少。當使用800 μg/mL的隱丹參酮時，PA的生物膜形成完全被抑制。激光共聚焦掃描顯微鏡和倒置顯微鏡結果顯示，隱丹參酮能顯著降低生物膜的分布和形成。這些結果表明，隱丹參酮可以通過破壞生物膜干預PA多重耐藥性的產生。

PA生物膜的形成受多種因素的調節。QS系統依靠細胞密度進行調節，是調控生物膜形成的關鍵因素之一。PA主要依賴于Las和Rhl兩個LuxI/R群體感應系統。LasI產生自誘導信號分子3OC12-HSL，LasR與信號分子結合成為LasR：3OC12-HSL復合體，激活包括RhlR在內的許多基因的轉錄。RhlR被激活后，RhlR結合RhlI產生的自誘導因子C4-HSL形成RhlR：C4-HSL復合物，調節生物膜的形成［22］。在過去的十幾年中，人們針對研制PA的群感效應研發了不同的抑制劑，通過干擾Las和Rhl系統或拮抗LasR和RhlR的方式使生物膜的結構被破壞或形成受阻。Ishida等［23］的研究利用一種合成的群體感應抑制劑，N-?；h戊酰胺（C15H29NO），抑制3OC12-HSL和C4-HSL與其同源受體的結合，干擾Las和Rhl系統，導致PA生物膜的形成受損。G?kalsin等［24］的研究證明，在植物、藻類和地衣中常見的類胡蘿卜素玉米黃質，通過結合群體感應信號受體LasR和RhlR來阻斷毒力基因LasB和RhlA的表達，減少了PA生物膜的形成。楊磊等［25］研究了大葉桉揮發油對PA生物膜抑制效果以及相關基因的表達，發現植物相關提取物可以對PA生物膜形成的相關基因產生作用。為了研究隱丹參酮抑制PA生物膜形成的機制，我們選擇Las和Rhl系統相關基因作為藥物干預研究的候選基因。隨著隱丹參酮質量濃度的增加，這4個關鍵基因的表達量逐漸降低。當隱丹參酮質量濃度達到800 μg/mL時，相對表達量下降到50%以下，說明隱丹參酮可以通過抑制Las和Rhl系統抑制PA生物膜的形成。AHL是Las和Rhl系統的自誘導信號分子，由LasI和RhlI產生。因此可以推測，AHL的產生可能受到隱丹參酮的抑制，從而導致生物被膜形成的減少。

綜上所述，本研究表明，隱丹參酮對PA生物膜的形成具有抑制作用，為治療PA的感染和干預其多重耐藥性的產生奠定了基礎。隱丹參酮抑制PA生物膜的形成機制可能是隱丹參酮抑制Las和Rhl系統的相關基因，進而影響PA的群體感應系統以及生物膜的形成。因此，隱丹參酮作為PA生物膜形成的群體感應抑制劑具有良好的研發潛力。

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