鴿毛滴蟲病診斷及疫苗研究進展

張春平

鴿毛滴蟲病，又稱為口腔炎癥，是鴿群常見的一種以口腔、咽喉為典型發病部位的寄生蟲病[1]。其病原為鴿毛滴蟲（Trichomonas gallinae），屬原生動物門單細胞原蟲，能夠通過口腔進入鴿體內，感染消化道及呼吸道[2]，引起患病鴿食欲下降，精神萎靡；嚴重者，蟲體可進入內臟，形成不同器官的病灶，進而影響患病鴿的生存；并且鴿一旦感染毛滴蟲，易造成其他疾病的混合感染，其中以幼齡鴿發病及死亡率為最高[3]。

1? 流行病學

鴿毛滴蟲在全世界廣泛分布[4]，主要通過接觸性傳播，各年齡段鴿群均可感染。其中成年鴿感染毛滴蟲后大多不發病，呈帶蟲傳播，最終可使鴿群大面積感染。而幼鴿由于其免疫功能不完善，其感染后發病率及死亡率都較高，青年鴿次之。國外部分地區鴿毛滴蟲感染率高達75.78%[5]。在我國影響較大的主要是山東、廣東、河北等肉鴿養殖量大的省份。2006年廣東省11家鴿養殖場的毛滴蟲感染情況調查結果顯示，65.8%的鴿子感染毛滴蟲[6]。而2008年四川地區2萬只鴿子的調查結果顯示，其毛滴蟲平均感染率高達75.12%[7]。山東省2016年的調查結果顯示，鴿群毛滴蟲平均陽性率在14.9%～31.1%之間[8]，而2006年該地區陽性率超過60%，鴿毛滴蟲的感染率有所下降，分析主要原因是對疾病的重視、科學喂養及藥物的合理使用。近年來由于甲硝唑的限用及耐藥性的產生，各地感染率有所反彈。

2? 診斷

毛滴蟲病是危害鴿子養殖經濟的主要疾病之一，其發病率高、傳染性較強，嚴重制約鴿養殖產業的發展。通常養殖戶對發病鴿的診斷，僅僅停留在臨床癥狀的初步判斷階段，由于病癥相對于感染的滯后性，存在著發現不及時、淘汰不徹底的情況，極易造成重大的經濟損失。因此市場上需要一種高效、便捷、低成本的檢測手段，能夠定期對鴿群進行早期的診斷篩查，提高養殖效率，降低養殖成本。而現階段的研究結果仍無法形成高效穩定的檢測產品。

2.1? 鏡檢法

鏡檢法是最直觀的毛滴蟲檢測法，通常被視為其他檢測方法的判定標準。將滅菌棉簽用生理鹽水浸濕后，插入鴿口腔或嗉囊內取樣；然后在載玻片上滴一小滴生理鹽水，將采樣棉簽在生理鹽水中晃動數次；將載玻片直接置于光學顯微鏡下進行觀察?？赏ㄟ^毛滴蟲的梨形形態、具有鞭毛以及典型的滾動運動的波動膜進行分辨[9]。但該檢測方法靈敏度較低，需要檢測樣本中大量存在的病原，且存在采樣部位、采樣手法有差異，在感染初期容易造成假陰性的結果。

2.2? 培養-鏡檢法

此法可視為鏡檢法的擴大效應方法，孫炎戊等[10]將經直接鏡檢法檢測后的鴿口腔粘液樣品棉簽放入肝浸肉湯培養液中，折斷棉簽后，置于37 ℃生化培養箱中恒溫培養12 h，吸取培養液5～10 L，放于光學顯微鏡下10×10倍鏡檢，鏡檢有活動的梨形或橢圓形蟲體即可判定為毛滴蟲感染陽性，否則為陰性。相比直接鏡檢法，此方法檢出率顯著提升（20%～38.3%），且陽性樣本毛滴蟲蟲體數量明顯增多，可見大量毛滴蟲在游動，活性良好。但此方法對于操作人員、儀器、環境要求較高，且耗費時間較長，不適宜于大規模臨床應用。

2.3? ?Dot-ELISA方法

羅峰等[11]建立了斑點酶聯免疫吸附試驗定性檢測鴿毛滴蟲抗原的檢測方法，采用抗原抗體結合的原理進行毛滴蟲檢測。70個樣品中，48個鏡檢陽性樣品用本方法檢測有44個呈陽性，陽性符合率為91.7%；22個鏡檢陰性樣品用本方法檢測有12個呈陰性，陰性符合率為54.5%。結果表明，本方法建立的斑點酶聯免疫吸附與鏡檢結果的總符合率為80%，但由于其操作程序復雜，成本高，假陽性較多，仍需進一步優化以適用于大規模臨床檢測。

2.4? 分子診斷技術

現代分子生物學的深入研究，使得疾病的檢測手段有著日新月異的變化，能夠更好地解決過去診斷方法的弊端。目前，用于鴿毛滴蟲檢測的分子生物學手段主要為聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）。Robinson等[12]針對禽毛滴蟲SSU rRNA基因進行巢式PCR，在英國雀類中成功檢測出毛滴蟲病原，開啟了禽毛滴蟲SSU rRNA基因研究。Solís等[13]針對SSU rRNA基因，建立了SYBR綠色實時熒光定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法，對禽毛滴蟲進行定量檢測。除此之外，還有包括FeHyd基因等多種分子標志物可用于毛滴蟲的診斷，但市場上尚缺少特異性更強、重復性更好及敏感度更高的靶標用于研發鴿毛滴蟲的早期篩查產品。

3? 疫苗研究進展

隨著鴿養殖業的不斷發展，疾病對其影響越發顯著。由于鴿毛滴蟲病發病率高，傳染性強，且檢測手段不成熟，一旦鴿群出現癥狀，此時治療或淘汰均易造成重大經濟損失，因此，疫苗的研究迫在眉睫。毛滴蟲屬于寄生蟲，區別于病毒和細菌，寄生于細胞中，且具有生活史，免疫系統難以清除，因此寄生蟲疫苗的開發相較于病毒和細菌難度更大，目前尚無成熟的毛滴蟲疫苗產品上市，但部分滅活疫苗及亞單位疫苗被證實有一定的免疫保護效果。近年來，研究者對于疫苗的研發力度持續增加，一些有希望能成為疫苗候選靶標的蛋白被廣泛研究。

3.1? 滅活疫苗

羅峰[14]等將鴿毛滴蟲進行體外培養，擴增達到一定數量后進行超聲破碎滅活，稀釋后加入油佐劑乳化成油包水劑型疫苗，用以免疫鴿子。兩次免疫后抗體水平顯著提升，對帶蟲鴿、健康鴿均有較強的免疫刺激作用。使用毛滴蟲強毒株攻毒后免疫組未發生死亡，相比之下對照組死亡率為18.7%。此結果證明了全蟲的滅活疫苗可以一定程度上保護健康鴿、帶蟲鴿，可減少毛滴蟲的感染。但此方法中全蟲的破碎率有待研究，若破碎不全可能會因活蟲殘留而造成大范圍感染的問題，后續研究應重點考慮其安全性及質量控制方面的問題。

3.2? 亞單位疫苗

亞單位疫苗，尤其是體外表達重組亞單位疫苗，作為基因工程疫苗的重要手段，其優勢為體外構建含有目標抗原的重組表達系統，通過體外表達純化后制備成疫苗，高效且質量易于控制。粘附蛋白是毛滴蟲病原的一種重要的致病性功能蛋白，此類蛋白主要起到粘附作用，結合宿主細胞并幫助病原逃避宿主的免疫系統。其中研究最為廣泛的為AP33基因，羅鋒等[15]通過大腸桿菌表達系統成功表達了鴿毛滴蟲AP33基因，并進行攻毒保護性試驗，結果表明該方法中制備的鴿毛滴蟲AP33重組亞單位疫苗能夠刺激機體產生特異性中和抗體，保護率高達100%，證明鴿毛滴蟲粘附蛋白AP33基因可以作為基因工程疫苗的候選靶標。

張帥[16]根據陰道毛滴蟲G3蛋白部分基因序列ORF設計引物，經PCR成功擴增獲得鴿毛滴蟲G3蛋白基因序列，通過原核表達載體構建重組表達菌株，獲得重組蛋白，制備成疫苗后免疫小鼠，收獲的抗體可識別該蛋白，免疫原性較好，但尚缺少抗體對病原的中和活性研究及靶動物攻毒保護性實驗數據，暫無法判斷其是否可作為疫苗的候選靶標。

3.3? 表位肽疫苗

表位肽疫苗是基于亞單位疫苗進一步優化，利用結構生物學等學科對抗原結構進行解析，找到蛋白結構域，并預測其中起到關鍵作用的一系列抗原表位肽段，將其串聯構建于表達系統中進行表達，純化后制備成疫苗。與亞單位疫苗相比，表位肽疫苗的靶向性更強，機理更為清晰，干擾性較少，免疫原性更為突出。陳文杰等[17]對粘附蛋白AP33進行軟件分析，研究其二級結構、特性及抗原表位位點，尤其是B細胞表位及T細胞表位，后續的目標是將上述表位排列組合、串聯甚至重復串聯，通過原核表達或真核表達系統進行重組表達后制備成疫苗，以期具有更強的免疫原性。

4? 展望

我國鴿養殖業蓬勃發展，疾病防控問題愈發重要。目前，鴿毛滴蟲感染嚴重且危害鴿養殖經濟的健康發展。研究表明目前的通用藥物甲硝唑易于殘留，對人類有一定副作用，因此被限制使用（肉鴿中不可檢出）。隨著甲硝唑等藥物的大肆濫用，以及鴿毛滴蟲強大的繁殖能力，蟲體的耐藥性顯著增強；隨著蟲體的快速、大量繁殖，未來出現超級耐藥蟲株的可能性大大增加，這將給養殖業帶來毀滅性的打擊。因此對于毛滴蟲的防控應采取以預防為主、淘汰為輔的凈化方針。目前，鴿毛滴蟲病暫無商業化疫苗上市，現有的各種疫苗研究報道中同樣存在一些尚待解決的問題，未來仍需進一步研究更具中和活性的靶標，并致力于解決疫苗安全、有效、質量可控的諸多問題。

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