基于網絡藥理學及分子對接探討柴胡注射液退熱的分子機制

張雨潔 胡珊珊 史元元 朱青梅 李東鋒

新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，新疆 烏魯木齊 830011

柴胡注射液（Chaihu Injection，CI）是北柴胡（Bupleurum chinense DC.）經水蒸氣蒸餾法制成的注射劑，主成分為柴胡揮發油[1-2]。2020 版《中華人民共和國藥典》收載的北柴胡為傘形科植物柴胡的干燥根。該藥在1941 年研制，1954 年實現工業化生產[3]。2022 年8 月至2023 年1 月新疆醫科大學第一附屬醫院急診有273 例發熱患者使用該藥，單用者119 例，聯合萘普生片者79 例，聯合安痛定注射液者65例，聯合萘普生片及安痛定注射液者10例。期間不良反應上報0 起，其退熱效果好且較為安全。既往研究中柴胡主要含三萜皂苷類、揮發油、黃酮類等成分，具有解熱、抗炎、抗病毒、保肝、抗腫瘤、降血脂、調節免疫等作用[2]。但對其退熱機制的研究尚存在一定空缺，本研究旨在通過網絡藥理學及分子對接探究該機制。

1 資料與方法

1.1 CI活性成分篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-like，DL）≥0.18 檢索柴胡活性成分，同時結合文獻補充。從PubChem 數據庫[5]中收集分子結構。

1.2 CI活性成分對應的靶點蛋白篩選

從UniProt 蛋白質數據庫[6]中查詢活性成分對應的靶點，并進行整理。

1.3 發熱相關靶點篩選

以“ fever”為關鍵詞在GeneCards 數據庫[7]、DurgBank 數據庫[8]、人類在線孟德爾遺傳數據庫（online Mendelian inheritance in man，OMIM）[9]中檢索、去重。

1.4 CI退熱靶點篩選及蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction network，PPI）網絡的建立

使用Venny 2.1 平臺對1.2 和1.3 的結果取交集。使用STRING 數據庫[10]對交集靶點進行互作分析。

1.5 構建“ CI-活性成分-靶點基因-發熱”網絡

把1.4 的結果導入Cytoscape 軟件[11]，并進行分析獲得“ CI-活性成分-靶點基因-發熱”網絡關系。

1.6 基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過DAVID 數據庫[12]獲取GO、KEGG 信號通路信息（P≤0.01），取前20 位結果進行分析解讀。

1.7 分子對接

從PDB 數據庫下載核心靶點結構信息，使用PyMOL 軟件對結構進行預處理。利用AutoDock 軟件處理靶蛋白，AutoDock Vina 模擬分子對接。

2 結果

2.1 藥物成分靶點

將數據庫中的活性成分與文獻報道[2，13]的檸檬烯（limonene）、α-姜黃烯（α-curcumene）等12 個成分進行整合，見表1。有17 個柴胡活性成分對應210 個靶點。

表1 柴胡注射液活性成分

2.2 Venn圖

將210 個藥物靶點與1208 個疾病靶點取交集，獲得102 個CI 退熱的關鍵靶點，使用Venny 2.1 作圖，見圖1。

圖1 CI 和發熱交集靶點Venn 圖

2.3 PPI網絡

PPI 網絡中有101 個點存在相互關系，點之間有1634 條連線，平均節點度值為32.4，平均局部聚類系數值為0.676，表明這些蛋白質之間有較多相互作用且在生物學上是部分相連的。見圖2。

圖2 柴胡注射液退熱靶點PPI 網絡

2.4 PPI網絡拓撲分析

以鄰近中心度數值>中位數0.5824、中介中心性數值>中位數0.0037、度值>中位數37 進行數據整理，獲得核心靶點17 個，包括IL-6、TNF、AKT1 等，見表2。

表2 CI退熱核心靶點

2.5 “ CI-活性成分-靶點基因-發熱”網絡關系

用Cytoscape 3.9.1 軟件建立關聯網絡，點與點之間的關聯以線條進行連接，連線越多表明存在的相互作用關系密切，核心作用的可能性越大，見圖3。

圖3 “ CI-活性成分-靶點基因-發熱”關系網絡

2.6 GO功能富集

GO 分析獲得生物過程（biological process，BP）條目584 個，涉及對外來刺激的反應、細胞對腫瘤壞死因子的反應、炎癥反應、對脂多糖的反應、血管生成、缺氧反應等過程；得到細胞成分（cellular component，CC）條目60 種，涉及細胞外隙、細胞表面、小窩等；獲得分子功能（molecular function，MF）條目103 項，涉及酶結合、蛋白質結合等。選取P值排序選前10 位條目作圖，見圖4。

圖4 GO 功能富集分析

2.7 KEGG通路富集

通過分析獲得156 條通路信息（P< 0.01），涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨細胞病毒感染、Toll樣受體等信號通路。取前20 位作氣泡圖，見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析

2.8 分子對接驗證

以活性成分的度值排名靠前、相互連接關系多為條件，選出8 個活性化合物以及10 個核心靶點進行分子對接，見表3。取結合能低、結合能力強的4 組信息，即槲皮素-PTGS2、山奈酚-PTGS2、異鼠李素-PTGS2、槲皮素-TP53，進行可視化作圖，見圖6。

圖6 CI 成分與靶蛋白結合模式圖

表3 CI成分與核心靶蛋白的結合能（kJ/mol）

3 討論

CI 是普通感冒、流感及瘧疾等所致發熱的常用制劑之一。發熱多為病原體引起機體應激反應，白細胞釋放內源性致熱源穿過血- 腦屏障，影響體溫調節中樞的體溫控制導致發熱[14]。該藥臨床應用多、退熱效果顯著。分子對接中山奈酚、異鼠李素、槲皮素與核心靶點的結合能最低、結合構象更穩定。既往研究中槲皮素的抗炎作用與抑制細胞因子產生、降低環氧合酶和脂氧合酶表達相關[15]。山奈酚可調節促炎酶活性和炎癥基因表達[16]，通過抑制轉錄因子、黏附分子以及基質金屬蛋白酶等途徑發揮抗炎作用[17]。異鼠李素可通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的產生，發揮出強效的抗炎活性[18]。這3 種成分是CI 退熱的中心活性成分。

KEGG 結果提示CI 退熱作用與AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨細胞病毒感染等通路相關。它們均可觸發NF-κB、MAPK 途徑，另外還涉及PI3KAKT-mTOR、C/EBPs 途徑等。通路激活后引起多種促炎細胞因子的表達，如IL-1、IL-6、GM-CSF、IL-8。其中，IL-1 與lL-1RI 結合可觸發Toll 樣受體信號通路。該通路能識別脂多糖、肽聚糖、脂蛋白及病毒后活化成熟樹突細胞，提供獲得性免疫的共刺激信號，促進lL-1β、IL-1α、IL-6、TNF-α 等細胞因子表達[19]。

PTGS2、TP53 是分子對接中最有可能發揮作用的靶點，PTGS2 的生物學功能是通過生成PGE2 和PGD2 進而控制身體溫度、保護心血管健康、調節情緒等。TP53 編碼抑癌蛋白能對多種細胞產生應激反應，調節靶基因表達從而誘導細胞周期阻滯、凋亡、DNA 修復等。

此外本研究結果提示CI 可能通過脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、癌癥途徑等相關通路發揮作用。綜上所述，本研究探討了CI 退熱中心成分、核心靶點和通路之間的網絡關系。但本研究局限在于分子對接驗證是模擬狀態，初步闡述了機制，今后將進一步探索CI 的作用機制。