內皮素-1調控SOCC/TGF-β參與房顫大鼠發生心房纖維化

賈卓然,代曼玉,梁士楚,吳 健,薛楊誠,張定欣,沈 兵,趙 韌

心房顫動(atrial fibrillation,AF)是最常見的心律失常,我國成年人AF患病率為1.6%,較之前明顯升高[1]。心房結構重構和電重構引發并維持AF,目前認為,心房纖維化是AF主要病理基礎,但心房纖維化的發生發展的機制研究缺乏,對于心房纖維化的有效干預靶點仍有待探究。內皮素系統在維持心血管穩態中發揮重要作用,是治療心血管系統疾病的重要靶標之一。大量研究[2-4]發現,AF患者外周血和心房組織內皮素-1(endothelin-1,ET-1)含量升高,參與心房纖維化過程。鈣庫操縱性鈣內流是鈣離子進入細胞內的主要模式之一,對細胞分化、增殖、凋亡具有重要調控作用,其中,鈣感受器基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)、鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1,Orai1)是鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels,SOCC)的主要功能蛋白。研究[5]表明ET-1通過介導胞外鈣離子內流及胞內鈣庫釋放調控胞漿鈣離子濃度,最近的研究[6]顯示,SOCC的激活參與ET-1在缺血再灌注過程中介導的冠脈收縮,但SOCC的激活是否參與AF心房纖維化過程及是否與ET-1調控相關尚不明確。該研究通過構建AF大鼠模型及體外HL-1細胞實驗,研究AF心房結構變化及心房組織中ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β和COL-1蛋白表達情況,探究ET-1及SOCC在AF發生過程中的關聯,并探討ET-1對AF心房纖維化的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 經安徽醫科大學倫理委員會批準(倫理學批號:No.LLSC20190530),14只健康雄性成年Sprague-Dawlay (SD)大鼠來自安徽醫科大學動物實驗中心,體質量220 g左右,組間體質量無統計學差異,心率450次/分左右,竇性心律,依隨機數字原則分為對照(normal control,NC)組、房顫(atrial fibrillation,AF)組,統一標準飼料喂養,自由飲水,動物實驗室12 h/12 h明暗交替,濕度50%左右,溫度維持在 24 ℃左右并通風良好。

1.1.2主要試劑和儀器 ET-1 (貨號:HY-P71446)購自美國MedChemExpress公司; 乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)(貨號:A6625)購自上海Sigma-Aldrich公司;氯化鈣(CaCl2)(貨號:ST365)及BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0010)購自上海碧云天生物科技有限公司;小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA) (貨號:NS-028541)購自北京梓熙生物科技有限公司;Orai1 siRNA (si Orai1) 序列:sense (CCUCAACUCGGUCAAAGAG),antisense (CUCUUUGACCGAGUUGAGG);一抗 Anti-TGF-β (貨號:BF 8012)、ET-1 antibody(貨號:DF6125)、Anti-Orai1 (貨號:DF 7956)、Anti-GAPDH (貨號:AF 7021)、山羊抗小鼠二抗 (貨號:S0002)及山羊抗兔二抗(貨號:S0001)購自美國Affinity Biosciences公司;STIM1抗體(貨號:GTX54855)購自美國 GeneTex公司; 一抗Anti-COL1 (貨號:R 26615)購自ZENBIO Biosciences公司;一抗Anti-Tubulin (貨號:10094-1)購自美國Proteintech Biosciences公司;HE染色試劑盒(貨號:G 1120)及Masson三色染色試劑盒(貨號:G 1340) 購自北京索萊寶生物科技有限公司;減血清培養基(opti-minimal essential medium,Opti-MEM)(貨號:31985070)購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.US.。小鼠心房肌細胞HL-1細胞 (貨號:FH1101)購自上海富衡生物科技有限公司。心臟超聲儀器購自美國General Electric HealthCare公司(型號:Vivid E95 Ultra Edition);體式輔助顯微鏡(型號:BX53F2)購自日本Olympus Corporation;二氧化碳培養箱(型號:HF90)購自上海力康生物醫療科技控股有限公司。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠分組及AF模型構建 將14只SD大鼠隨機分為NC組和AF組,每組7只。NC組大鼠10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥固定于鼠板上,四肢伸展用絕緣彈力帶牽拉固定,針形電極分別刺入四肢皮下,記錄正常心電圖。暴露大鼠尾靜脈,靜脈注射生理鹽水0.1 ml/100 g,每日尾靜脈注射1次,連續注射7 d,再次記錄心電圖;AF組大鼠同樣記錄正常心電圖后,暴露大鼠尾靜脈,靜脈注射CaCl2-Ach混合液0.1 ml/100 g(混合液濃度為CaCl210 mg/ml + Ach 66 ug/ml新鮮配制),每日尾靜脈注射1次,連續注射7 d,記錄心電圖,出現典型AF心電圖表現說明模型構建成功(P波消失,代之以大小不等f波并持續時間>2 s)。

1.2.2超聲心動圖 以50 mg/kg劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉全身麻醉兩組SD大鼠,膠帶固定大鼠四肢,使其背部朝下仰臥于鼠板上,充分暴露心臟所在位置,除去表皮毛發,打開心臟超聲儀器,準備完成后使用探頭(型號:12 s)尋找大鼠心臟位置,M型頻譜掃描速度為200 mm/s,測定左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)及射血分數(ejection fraction,EF),計算左室分數縮短率(fractional shortening,FS)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%。采用模式追蹤法在胸骨旁長軸切面主動脈竇水平測量左房內徑(left atrium diameter,LAD),計算模型建立前后LAD、EF及FS的差值,并分別表示為ΔLAD、ΔEF及ΔFS。每項參數測量3次,計算平均值。

1.2.3心房組織HE染色和Masson染色 以50 mg/kg劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉全身麻醉兩組SD大鼠,無菌手術器械打開胸腔,取出心臟,無菌PBS液沖洗后,置于顯微鏡下分離出心房組織,固定脫水后制備石蠟切片。HE染色:將石蠟切片依次放入二甲苯醇Ⅰ浸泡10 min,無水二甲苯醇Ⅱ浸泡約10 min,無水二甲苯醇Ⅲ浸泡10 min 后用無水乙醇Ⅰ浸泡5 min,無水乙醇Ⅱ浸泡5 min后,依次按照由高到低濃度梯度乙醇溶液浸泡20 min,用蘇木精液染液處理5 min后水洗1 min,復用0.5%的鹽酸乙醇分化液處理30 s,水洗1 min 后用碳酸鋰藍化處理30 s,水洗2 min,加伊紅液染色處理3 s,流水沖洗1 min,依次按照由高到低濃度梯度的乙醇脫水后二甲苯沖洗使組織透明,滴加中性樹膠,蓋玻片封片,顯微鏡下觀察。根據Masson染色試劑盒說明進行Masson染色。PBS緩沖液清洗切片3次,每次10 min,滴加鐵蘇木精染色液4 min后水洗,酸性乙醇溶液分化10 s,Masson藍化液染色3 min,再次水洗1 min,麗春品紅液染色1 s,弱酸水沖洗1 min,磷鉬酸溶液分色2 min,苯胺藍染液染色1 min,乙醇脫水后二甲苯沖洗使組織透明,滴加中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.2.4Western blot 法檢測心房組織ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β和COL-Ⅰ蛋白表達 取大鼠心房組織,加入適量裂解液,冰上研磨,4 ℃,12 000 r/min,離心20 min,取上清液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白含量,配平后行Western blot試驗,轉膜后5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h,之后加入稀釋一抗ET-1 (1∶1 000),Orai1 (1∶1 000),STIM1 (1∶1 000),TGF-β(1∶1 000),COL-Ⅰ (1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后室溫孵育相應稀釋二抗(1∶2 000)2 h,PBST洗膜后加入ECL顯影液顯影曝光。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值,檢測各組心房組織中ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β、COL-Ⅰ的相對蛋白表達水平。

1.2.5細胞培養、分組和轉染 復蘇HL-1細胞,從液氮罐中取出細胞凍存管,37 ℃水浴解凍,1 000 r/min 離心5 min 后,均勻接種于60 mm細胞培養皿,加入10%培養基約2 ml,于37 ℃恒溫,5% CO2細胞培養箱培養。細胞傳代,第3代傳代至6孔板,細胞貼壁程度至正常70%時進行細胞小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA)的轉染,更換為Opti-MEM。將HL-1細胞分為4組:NC組(對照組)、ET-1組(ET-1處理)、Si Orai1組(Si Orai1轉染使Orai1表達降低)、ET-1+Si Orai1組(Si Orai1轉染使Orai1表達降低并使用ET-1處理)。以lipofectamine 3000為轉染試劑,Si Orai1組加入si Orai1溶液,轉染濃度為100 nmol/L,置于37 ℃恒溫,5% CO2培養箱繼續培養,6 h后更換新鮮10% DMEM培養基,轉染48 h后進行Orai1蛋白表達量檢測;ET-1組使用50 nmol/L的ET-1處理HL-1細胞24 h;ET-1+Si Orai1組即HL-1細胞在使用Si Orai1轉染48 h后,使用50 nmol/L的ET-1處理24 h ;對照組細胞不做處理,置入37 ℃恒溫,5% CO2培養箱培養48 h。

1.2.6Western blot法檢測細胞Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達 將細胞從培養箱中取出,冰上操作,吸盡原培養基后加入細胞裂解液,搖床震蕩20 min充分裂解后轉至EP管,4 ℃高速離心機12 000 r/min離心10 min,取上清液進行BCA蛋白定量后行Western blot實驗,依次上樣、電泳、轉膜,轉膜后5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h,之后加入稀釋一抗Orai1 (1∶1 000),STIM1 (1∶1 000),TGF-β(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后加入相應稀釋二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h后,均勻滴加顯影液后曝光。用ImageJ軟件分析條帶灰度值檢測蛋白表達水平。

2 結果

2.1 AF組與NC組大鼠心電圖與超聲心動圖相關指標的比較心電圖記錄結果顯示NC組大鼠呈竇性心律(圖1A),AF組大鼠可見典型AF心電圖表現(圖1B);大鼠超聲心動圖數據顯示,與NC組大鼠相比(0.028±0.009) mm,AF組大鼠左房ΔLAD (0.119±0.013) mm增大(t=5.75,P<0.001),而ΔEF、ΔFS兩組差異無統計學意義(t=1.70、2.49,均P>0.05)。見圖1C。

圖1 兩組大鼠心電圖及超聲心動圖的比較

2.2 AF組大鼠心房組織病理變化情況SD大鼠心房組織HE及Masson染色結果顯示,NC組心房肌細胞排列整齊,形狀基本一致,AF組可見大片藍色膠原纖維沉積(圖2A),AF組大鼠心房組織纖維化增加(t=3.52,P<0.05)。見圖2B。

圖2 兩組大鼠心房組織纖維化情況的比較

2.3 AF組大鼠心房組織中ET-1、COL-1、Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達增多利用Western blot檢測心房組織中ET-1、纖維化相關蛋白COL-Ⅰ及TGF-β表達情況與SOCC功能蛋白Orai1、STIM1表達水平,結果顯示,與NC組大鼠相比,AF組大鼠心房組織中ET-1、COL-1及TGF-β蛋白表達增多(t=2.92、5.19、2.45,均P<0.05),此外,AF組心房組織中Orai1、STIM1蛋白表達也增多(t=3.58、5.21,均P<0.01)。見圖3。提示AF大鼠在ET-1蛋白表達增多的同時發生心房纖維化。

圖3 兩組大鼠心房組織中ET-1、COL-1、Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達的比較

2.4 ET-1對HL-1細胞Orai1、STIM1、TGF-β表達情況影響Western blot檢測結果顯示,HL-1細胞接受濃度為50 nm/L的ET-1處理24 h后,Orai1、STIM1、TGF-β的表達上調(t=4.36、4.85、5.69,均P<0.05);當細胞中SOCC功能蛋白Orai1表達敲減后,ET-1+Si Orai1組細胞中TGF-β的表達與NC組差異無統計學意義,然而,相較于ET-1組,其表達呈下調趨勢(圖4),提示ET-1促進HL-1細胞TGF-β的表達過程中,SOCC功能蛋白參與其中。

圖4 ET-1對HL-1細胞Orai1、STIM1和TGF-β表達情況影響

3 討論

目前,心房結構重構、電重構、異常鈣離子電流和自主神經系統變化在AF的發生發展中發揮重要作用,其中以心房纖維化為主要表現的結構重構是AF發生和維持的關鍵[7]。許多途徑如腎素-血管緊張素-醛固酮系統、氧化應激和信息傳遞途徑能夠調節心房纖維化,TGF-β是其中一個關鍵調節器[8]。當前研究[9-10]表明,沙庫巴曲纈沙坦通過降低TGF-β表達和通過影響心房肌的鈣離子通道抑制心房纖維化的進展。最新研究[11]發現乳脂球-EGF因子8通過負向調控TGF-β/Smad2/3抑制心房纖維化,但具體作用機制尚不明確。臨床上,AF患者亟需改善心肌重構治療新途徑[12],但對于心房纖維化尚無明確的治療策略,AF患者心房纖維化的機制需要更多的探索與研究。本研究顯示AF大鼠心房增大,心房發生纖維化,同時ET-1/SOCC/TGF-β信號通路關鍵蛋白表達上調,抑制SOCC的同時抑制了HL-1細胞中的TGF-β蛋白的表達,初步表明了ET-1/SOCC/TGF-β信號通路對心房纖維化的促進作用,拮抗其中相關分子可能能夠有效干預AF和心房纖維化進展。

ET-1是人類重要的內皮素亞型之一,主要由內皮細胞分泌,可以作為細胞因子或與其受體結合在組織纖維化中發揮重要作用,心臟中存在ETA和ETB受體,其中內皮素受體拮抗劑波生坦已被證明可以減少高血壓和修復性心肌纖維化動物模型中纖維化心肌的重構[13]。最近研究[2]表明,AF患者血清ET-1水平顯著升高,與AF持續時間呈正相關,且在射頻消融術后復發的AF患者中ET-1水平較高,表明ET-1在AF發生和維持過程中發揮重要作用。AF患者心耳ET-1和COL-Ⅰ表達及膠原纖維沉積增多,且COL-Ⅰ表達水平與ET-1表達水平呈正相關,提示ET-1可能通過促進心房纖維化而參與AF的發生[3],但具體機制尚不明確。本研究顯示AF大鼠心房組織中ET-1表達增加,HL-1細胞培養后ET-1誘導TGF-β合成增加,提示ET-1/TGF-β可能參與AF和心房纖維化的過程。

SOCC與心肌纖維化的發生密切相關。Orai1和STIM1作為SOCC兩個重要分子基礎,在心肌重構過程中發揮重要作用。藥理研究[14]表明,SOCC和非選擇性陽離子通道是ET-1誘導平滑肌收縮、絲裂原活化蛋白激酶磷酸化和花生四烯酸釋放的重要鈣內流途徑。但ET-1誘導的心肌纖維化過程中,SOCC是否參與其中尚不明確。最近研究[15]表明,Orai1介導的Ca2+內流的上調,增強人心房成纖維細胞的增殖和遷移能力。本研究顯示HL-1細胞中Orai1表達降低后ET-1的誘導不再使TGF-β蛋白表達水平升高,表明Orai1參與ET-1誘導心房纖維化的過程。

綜上所述,本研究探索了通過ET-1/SOCC/TGF-β信號通路促進AF大鼠發生心房纖維化,拮抗該信號通路中相關分子如Orai1可能會有效干預心房纖維化在AF發生中的進展。此結果為改善AF患者心房纖維化提供了新的治療方向與藥物靶點。然而ET-1是作為細胞因子或是與其受體結合調控SOCC/TGF-β尚未得到具體研究,因此也將成為下一步實驗的研究重點。