褪黑素通過SIRT1-BMAL1通路減輕神經病理性疼痛的機制研究

王鎮池,李 銳

神經病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是一種常見的慢性痛。臨床調查及動物試驗[1]均表明,機體在一個晝夜循環內對于傷害性刺激的反應不盡相同,一些與傷害性感受相關的介質表達也并非一成不變[2]。機體生理功能中的晝夜節律由內部自我維持的分子振蕩器控制,稱為生物鐘,可影響多種生理過程[3]。褪黑素有助于調節人類的晝夜節律和其他生理功能,同時也已被證明可治療疼痛相關疾病,在人類和動物模型的疼痛手術過程中應用[4]。

沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)失活是NP的關鍵因子,因此激活 SIRT1蛋白進而減輕氧化應激所導致疼痛值得深入研究。時鐘蛋白(CLOCK protein,CLOCK)/腦和肌肉ARNT樣蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMAL1)異二聚體作為生物鐘的起始關鍵物,被調節細胞內節律性的基因所表達[5]。SIRT1能夠將BMAL1去乙?；?抑制CLOCK-BMAL1介導的時鐘相關基因的轉錄,同時也可抑制由于氧化應激所致導神經膠質激活,最終使得NP的疼痛癥狀得到緩解。大部分與氧化損傷相關的酶已被證明在一天內的特定時間會達到峰值,其中抗氧化酶Gpx1[6]尤為重要。該研究旨在研究褪黑素對NP夜間加重的影響,并通過SIRT1-BMAL1通路探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 96只SPF級健康雄性C57/B6小鼠,8周齡,體質量20 g,購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,室溫22～24℃,相對濕度40%～50%,房間晝夜周期為12/12 h,適應性飼養1周,按隨機數字表法分為3組:假手術組(S組)、NP組和褪黑素治療組(melatonin,NP+M組),每組24只。將所有試驗小鼠飼養至指定光照模式環境中,即12 h光照(光照期8:00—12:00)與12 h黑暗(黑暗期20:00—8:00)交替,持續至少3周;將自然時間轉換為授時時間(zeitgeber time,ZT),光照起點定為ZT0,ZT12-23為黑暗期,所有黑暗期操作均在紅光下進行。

1.1.2主要試劑與儀器 褪黑素(貨號:HY-B0075)購自美國MCE公司;組織裂解液(貨號:P0013B)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(貨號:P1046)、BSA(貨號:ST023)、Triton X-100(貨號:P0096)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0010)和抗熒光淬滅封片液(貨號:P0131)等均購自上海碧云天生物技術有限公司;Western blot山羊抗兔二抗(貨號:31460)、Western blot山羊抗鼠二抗(貨號:31430)、熒光山羊抗兔二抗(貨號:A-11011)、熒光山羊抗鼠二抗(貨號:A11011)購自美國Thermo公司;鼠抗β-actin 抗體(貨號:A2228)購自美國Sigma公司;鼠抗SIRT1 抗體(貨號:ab110304)、兔抗Gpx1抗體(貨號:ab108427)、兔抗小膠質細胞激活標記物離子鈣結合適配器分子1(ionized calcium-binding adaptermolecule-1,iba-1)抗體(貨號:ab178846)購自英國Abcam公司;兔抗BMAL1抗體(貨號:14020)購自美國CST公司;兔抗脊髓神經元標志物神經元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)抗體(貨號:26975-1-AP)、兔抗星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)抗體(貨號:16825-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司。von Frey 觸痛儀(型號:NC12775)購自美國IITC公司;蛋白電泳和轉移設備(型號:1658033)購自美國Bio-RAD公司;全自動化學發光圖像分析儀(型號:5200)購自上海天能科技有限公司;倒置顯微鏡(型號:Vert.A1)購自德國蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1NP小鼠模型的建立 參照文獻[7]采用坐骨神經慢性縮窄性損傷(chronic constriction injury,CCI)制備NP模型。戊巴比妥 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉后,右側股骨上方剃毛、消毒鋪巾,股骨外側切開 2 cm 左右的皮膚,鈍性分離肌肉,暴露出右側坐骨神經主干分離神經周圍的組織后在神經主干部位,用6-0鉻制羊腸線以腿部不出現抽搐為標準結扎3道,間隔1 mm。假手術組僅進行前面的幾個步驟,不結扎坐骨神經。壓迫止血后,用縫針和 5-0手術縫合線分別對切口部位的肌肉和皮膚進行縫合。NP+M組根據文獻[8]在術后7 d開始于每日晝夜轉換點(ZT12)給予腹腔注射10 mg/kg褪黑素,持續至術后14 d,其他組腹腔注射同等體積生理鹽水。術后14 d于不同時間點(ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22)分別取1只小鼠脊髓備用。

1.2.2疼痛行為檢測 術前1 d和術后1、3、7、10和14 d不同時間點(ZT4、ZT10、ZT16和ZT22)測定小鼠機械縮足反應閾(paw withdrawal mechanical threshold,PMWT)[9]。將小鼠置于帶金屬網底的有機玻璃籠內,待其適應環境30 min,等小鼠各種活動基本消失后,采用 von Frey 觸痛儀的刺激針緩慢接觸右側足底,記錄出現縮足反應時的壓力值。重復測量 3 次,間隔大于5 min,取其平均值作為 PMWT。

1.2.3Western blot 術后14 d,在ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22時點,取小鼠L4-6 節段脊髓置于-80 ℃ 冰箱中保存。Western blot法檢測SIRT1、BMAL1和Gpx1蛋白表達。將脊髓組織加入RIPA裂解液,研磨后,13 200 r/min離心15 min,取上清液測定蛋白濃度。配制 10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,上樣后電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉、TBST 洗滌后分別加入鼠抗 β-actin 抗體(1∶10 000)、鼠抗SIRT1 抗體(1∶1 000)、兔抗BMAL1抗體(1∶1 000)、兔抗GPX1抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜,TBST漂洗3次,每次10 min。滴加相應的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗 (1∶10 000),搖床上反應2 h,TBST漂洗3次,每次10 min。隨后在成像系統上顯出蛋白條帶。ImageJ圖像分析軟件測定條帶灰度值,以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值來反映目的蛋白的相對表達水平。

1.2.4免疫熒光組織化學染色 術后14 d用戊巴比妥鈉麻醉動物,暴露胸腔后,經左心室進針,緩慢灌注 0.9%的生理鹽水,然后迅速灌注 4%的多聚甲醛,并切下右心耳。灌注完畢后,取出脊髓 L4-6 節段,放置 4%多聚甲醛中固定2 h,于4 ℃下30%的蔗糖容液中脫水過夜。將脊髓進行冰凍切片,厚度為 10 μm。在含有 5%BSA 和0.3%Triton X-100 的 PBS 中于室溫下孵育1 h,PBS 清洗3次,每次 5 min。將脊髓切片與一抗鼠抗SIRT1 抗體(1∶100)、脊髓神經元標志物兔抗NeuN抗體(1∶500)、小膠質細胞激活標記物兔抗iba-1抗體(1∶1 000)、星形膠質細胞標記物兔抗GFAP抗體(1∶500)[10]4 ℃避光孵育過夜。PBS 清洗3 次,每次 5 min,然后與各一抗偶聯的山羊二抗 (1∶1 000) 室溫避光孵育1 h。后續步驟在避光條件下進行,使用抗熒光淬滅封片液對細胞核進行染色,PBS 清洗3 次,每次5 min,曬干,封片。在熒光顯微鏡下拍片觀察。

1.3 統計學處理使用SPSS 22.0軟件進行統計分析,小鼠的PMWT用均數±標準差來表示,采用重復測量的方差分析來比較不同時間點之間的差異性;Western blot結果組間比較采用單因素方差分析,當差異存在方差齊時比較采用t檢驗,否則使用 Bonferroni法進行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NP對小鼠PMWT的影響及晝夜變化本研究結果顯示,小鼠 CCI后患爪出現不堪重負、足趾并攏現象,表示小鼠NP模型制備成功。與S組比較,NP組小鼠術后3 d ZT4時點 PMWT開始下降,且至少持續至術后第14天ZT22時點(其中術后3 d :t=5.56、6.73、7.68、7.10,術后7 d:t=7.56、5.51、7.85;、15.44,術后10 d:t=8.55、9.66、11.91、9.55,術后14 d :t=11.00、5.47、13.84、12.60,均P<0.05)。與NP組相比,NP組小鼠術后7、10、14 d ZT22時點PMWT下降(t=5.95、4.30、4.70,均P<0.05),其余各時點差異無統計學意義,表明NP組疼痛行為存在晝輕夜重現象;然而NP+M組小鼠術后7、10、14 d ZT22時點與ZT10時點相比,PMWT差異無統計學意義(均P>0.05),說明晝夜轉換點給予褪黑素平衡了這種晝夜差異。見圖1。

圖1 S組、NP組及NP+M組各時間點小鼠的PMWT (n=12)

2.2 SIRT1相關蛋白在NP晝夜節律發揮作用以及褪黑素夜間鎮痛效果與NP組ZT10時點相比,NP組小鼠術后14 d ZT22時點SIRT1、BMAL1和Gpx1均降低(t=8.608、5.459、4.476,均P<0.05);表明NP組夜間SIRT1、BMAL1和Gpx1表達低于日間。與NP組相比,NP+M組ZT14時點SIRT1(t=8.761,P<0.05)與 BMAL1(t=4.738,P<0.05)升高,而Gpx1于ZT18時點升高(t=6.95,P<0.05)。提示 NP+M組SIRT1、BMAL1和Gpx1蛋白表達水平在夜間有所改善。見圖2。

圖2 Western blot法檢測小鼠腰段脊髓組織中SIRT1、BMAL1及Gpx1表達的比較

2.3 小膠質細胞激活在褪黑素緩解NP晝夜差異中發揮作用NP組L4-6段脊髓背角熒光免疫顯示,NeuN、GFAP和iba1分別標記神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞; SIRT1在脊髓背角與小膠質細胞共表達,與神經元、星形膠質細胞沒有共表達。見圖3。與NP組ZT10時點相比,NP組小鼠術后14 d ZT22時點小膠質細胞激活數量降低(t=7.234,P<0.05),而NP+M組小鼠無明顯差異。與NP組ZT22

圖3 SIRT1蛋白在脊髓背角表達熒光圖 ×200

時點相比,NP+M組小鼠術后14 d ZT22時點小膠質細胞激活數量升高(t=14.14,P<0.01)。見圖4。表明小膠質細胞在褪黑素通過SIRT1-BMAL1通路減輕NP夜間加重中發揮重要作用。

圖4 NP和褪黑素對小膠質細胞在小鼠腰段脊髓背角激活數量的影響

3 討論

臨床發現傷害性、神經性、中樞性和混合性疼痛狀態均存在晝夜節律模式[11]。本研究在嚙齒動物中建立了慢性疼痛的晝夜節律,通過機械縮爪閾值測試評估CCI手術后嚙齒動物的疼痛狀態,結果顯示NP組小鼠休息期(嚙齒動物的夜間)的疼痛閾高于活動期(嚙齒動物的日間)。

SIRT1是一種NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；?具有脫乙?；匦?可以調節抗氧化酶活性[12],也可以通過去乙?；瘉砜刂粕镧娀?如BMAL1)的表達,從而調控生物鐘的分子轉錄。晝夜節律的轉錄-翻譯反饋機制中,CLOCK 在其 Lys537 殘基處乙?；疊MAL1,從而允許隱花色素1(cryptochromes 1,CRY1) 的募集[6]。有研究[13]表明SIRT1是晝夜節律基因表達的調節因子,在小鼠肝細胞和成纖維細胞中以晝夜節律的方式積累,并且是幾個核心時鐘基因(包括Bmal1、Rorγ、Per2和Cry1)的高強度晝夜節律轉錄所必需的,即SIRT1表達水平的變化可以影響晝夜節律相關蛋白表達進而參與諸多病理反應。在小鼠脊髓中 SIRT1可能通過對BMAL1的去乙?；瘉砀蓴_核心時鐘基因來實現NP的晝夜調節。本研究結果表明CCI引起的疼痛存在晝輕夜重的節律性變化,同時,Western blot分析結果表明,SIRT1和BMAL1在脊髓背角中的表達在晝夜之間也存在差異,說明SIRT1-BMAL1通路很有可能在NP中的晝夜節律相關調節發揮著重要作用。

NP中氧化應激也發揮著一定效應。脊髓小膠質細胞內活性氧 (reactive oxygen species,ROS)由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2誘導產生,進而誘發疼痛超敏。谷胱甘肽 (glutathione,GSH) 是一種強大的抗氧化劑,可在硒依賴性蛋白 Gpx1催化的過程中中和 ROS,從而將 GSH 轉化為谷胱甘肽二硫化物 (oxidized glutathione,GSSG) 的氧化態,通過谷胱甘肽還原酶催化 GSSG 還原為 GSH 的反應,從而中和 ROS。Gpx1受到BMAL1激活后,表達水平上升,可通過抗氧化發揮緩解NP作用。然而對于這一系列反應定位仍需進一步研究。

此外,本研究通過對脊髓背角進行SIRT1雙熒光免疫標記,結果表明,在雄性CCI組小鼠的脊髓背角中,SIRT1免疫熒光的細胞沒有被NeuN或GFAP雙標記,相反,大多數SIRT1陽性細胞被iba-1雙標記,并且NP組小鼠脊髓被激活的小膠質細胞數量在晝夜之間存在差異,提示影響NP晝夜節律紊亂的SIRT1主要定位于脊髓小膠質細胞內。

褪黑素是一種眾所周知的強抗氧化劑,參與多種細胞過程,如轉移、增殖和凋亡。同時有研究[14]表明,褪黑素能夠通過恢復基因表達的節律模式來改變各種晝夜節律基因的水平以調節晝夜節律紊亂。因此提示褪黑素有可能通過SIRT1作用于生物鐘來改善NP的晝夜紊亂。本研究在 CCI 小鼠疼痛的晝夜轉換點使用褪黑素進行干預,觀察到用藥后小鼠痛敏晝夜紊亂行為改善以及小膠質細胞受激活狀態晝夜差異性改變。

綜上所述,褪黑素減輕神經病理性疼痛夜間加重,其機制可能與激活小膠質細胞進而促進SIRT1-BMAL1通路蛋白表達有關。然而,本實驗仍然有很多不足,如尚未研究NP后各蛋白間相互作用情況,尚未對SIRT1干預后的疼痛影響加以分析;尚未完善褪黑素給藥時間點并加以比較以及尚未在細胞層面上對于疼痛發生部位的細胞加以鑒別。