雙氫青蒿素對非小細胞肺癌細胞誘導的CD8+T細胞抗腫瘤免疫應答的影響

王南楠,劉 宇,凌惠娟,牛 可,朱亞玉,陳禮文

肺癌是一種發病率和病死率均高的疾病。據統計[1],每年全球大約有200萬例新增肺癌病例和180萬肺癌死亡病例,其中約一半發生在亞洲。在2020年,中國約有85萬例新確診肺癌病例和71.5萬例肺癌死亡病例[2]。肺癌中80%～85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。中晚期NSCLC患者主要使用放化療、免疫治療和靶向藥物治療等手段,這些全身治療方法雖然能給患者帶來較好的治療效果,但也存在明顯的毒副作用。目前,從中草藥中開發毒性低、療效高的抗癌藥物是包括NSCLC在內的腫瘤治療藥物研究的熱點。

青蒿素是一種從已知的中草藥黃花蒿中提取出的化合物,雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是該化合物的第一代衍生物[3],1973年屠呦呦 等[4]用硼氫化鈉還原青蒿素并合成了DHA,它具有強大的抗瘧活性以及低毒性和安全性。近年來,青蒿素及DHA等藥物被發現在包括肺癌在內的多種癌癥中發揮抗癌作用,但其具體的抗癌機制仍需進一步探究。該研究旨在探討DHA對NSCLC細胞生長及其誘導的CD8+T細胞免疫應答的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料 NSCLC細胞系A549細胞(上海富恒生物技術有限公司);外周血來源于同一健康志愿者;RPMI-1640培養基(上海源培生物科技股份有限公司,貨號:L210KJ);胎牛血清(美國Gibco公司,貨號:10091148);CCK-8試劑盒、0.25%胰酶消化液、1%青-鏈霉素、二甲基亞砜DMSO(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C0037、C0201、ST488S、ST038);DHA(美國Selleck公司,貨號:S2290);人外周血淋巴細胞分離液(Ficoll)、0.1%結晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司;貨號:P8900、G1062);CD3單抗(德國Nobimpex公司,貨號:B104-0005);抗人CD3-FITC、抗人穿孔素-PE和抗人顆粒酶素B-PC5.5(美國BioLegend公司,貨號:300405、308195、372211);抗人CD8-APC(武漢Elabscience公司,貨號:E-AB-F1110E);固定破膜劑(美國賽默飛世爾科技公司,貨號:88-8824);絲裂霉素C(美國GlpBio公司,貨號:GC12353);重組人白介素(interleukin-2,IL-2) (美國Peprotech公司,貨號:200-02);

1.1.2主要儀器 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司,型號:HF90/HF240);多功能酶標儀(濟南愛來寶儀器設備有限公司,型號:ST-960);流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司,型號:CytoFLEX)

1.2 方法

1.2.1實驗藥物配置 DHA用DMSO充分溶解并配置成50 mmol/L的母液,-20 ℃保存;IL-2開蓋前以10 000～12 000 r/min離心30 s,用PBS充分溶解,配置成50 000 U/ml的溶液,-20 ℃保存。

1.2.2A549細胞培養 A549細胞使用含10%的胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養,待到細胞密度長至80%～90%左右進行傳代,后續實驗采用第3代細胞。

1.2.3CCK-8實驗 將A549細胞以5×103個/孔接種于96孔板中,置于培養箱中貼壁過夜,對照組和DHA組分別加入DMSO和不同濃度的(25、50、100 μmol/L)DHA培養24、48、72 h,配置CCK-8試劑與RPMI-1640培養基混合溶液(1∶10),棄去96孔板中的舊培養基,在3個不同待測時間均加入100 μl/孔的CCK-8混合液,置于37 ℃培養箱反應1 h,酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度值并計算細胞抑制率和半抑制濃度(half maximal inhibitory concentrate,IC50),根據IC50分析和實驗結果選擇最適宜的濃度和處理時間,后續實驗DHA處理組均采用該濃度和時間。

1.2.4集落形成實驗 將A549細胞分為對照組和DHA組,鋪到6孔板上,貼壁過夜后,分別予以DMSO和50 μmol/L(即A549細胞IC50臨近濃度)的DHA處理24 h,胰酶消化,用RPMI-1640培養基重懸,調整細胞濃度為1×103個/孔并接種于新6孔板中,37 ℃培養箱中培養8 d,棄去舊培養基,1 ml/孔甲醇固定30 min,0.1%結晶紫染液1 ml/孔染色30 min,染色結束后拍照,用ImageJ軟件計算集落形成數,實驗重復3次。

1.2.5A549細胞與淋巴細胞共培養 10 μg/ml絲裂霉素預處理對照組、DHA組(50 μmol/L)A549細胞2.5 h,胰酶消化重懸后調整細胞濃度為5×104個/ml,加入提前用1 μg/ml CD3單抗預包被的12孔板中,放入培養箱中等待A549細胞貼壁。用EDTA管抽取健康志愿者新鮮血液20 ml,緩慢加入Ficoll分離液中并形成明顯的分層界面,室溫下2 500 r/min離心20 min。離心后用無菌巴氏吸管小心吸取白膜層,即淋巴細胞層,PBS洗滌細胞后離心3次,每次1 500 r/min、10 min,得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)。將PBMC用RPMI-1640培養基重懸并接種于培養皿中,培養箱靜置培養1.5 h后吸取上清液并分離出淋巴細胞,調整細胞濃度為5×105個/ml,加入經預處理的A549細胞并建立1 ml共培養體系,每2 d添加200 U/ml的IL-2并進行1次半量換液,培養2周。

1.2.6流式細胞術檢測CD8+T細胞的數量及功能 吸取上述共培養的12孔板中培養液,1 000 r/min離心5 min后去上清液,加入配置好的CD8-APC、CD3-FITC抗體稀釋液(1∶20),避光孵育15 min。使用固定破膜試劑對T淋巴細胞進行固定破膜,然后加入顆粒霉素B-PC5.5和穿孔素-PE抗體稀釋液(1∶20),避光條件下室溫反應15 min,PBS重懸細胞,于流式細胞儀上機完成流式細胞檢測,實驗重復3次。

2 結果

2.1 DHA對A549細胞生長的影響CCK-8法檢測結果顯示,與0 μmol/L的DMSO對照組抑制率(2.01%)相比,25、50和100 μmol/L的DHA對A549細胞24 h增殖的抑制率分別為23.56%、53.50%和91.26%,均高于對照組(t=6.75、18.43、33.17,均P<0.01)。見圖1A。計算出A549細胞的IC50為46.26 μmol/L。接著比較IC50臨近濃度(50 μmol/L)DHA處理A549細胞在不同時間的細胞抑制率,結果顯示24、48、72 h的細胞抑制率分別為53.50%、63.84%和69.91%,呈現時間依賴性增加(t=61.35、12.35、7.33,均P<0.01)。見圖1B。進一步采用集落形成實驗檢測DHA對A549細胞的作用,結果顯示,DHA處理24 h后的A549細胞集落形成明顯減少(t=-8.97,P<0.01)。見圖1C、D。以上結果表明DHA以時間依賴方式和濃度依賴方式抑制A549細胞的生長。

圖1 DHA對 A549細胞的生長的影響

2.2 DHA處理對A549細胞誘導的CD8+T細胞增殖的影響流式細胞術檢測結果顯示,與對照組相比,50 μmol/L DHA處理組的CD8+T細胞數量上升。見圖2A。對照組和DHA處理組的CD8+T細胞的比例分別為51.95%±2.77%和73.58%±5.77%,其差異具有統計學意義(t=5.86,P<0.01)。見圖2B。表明DHA預處理的NSCLC A549細胞能夠刺激CD8+T細胞的生長。

圖2 流式細胞術檢測兩組CD8+T細胞比例

2.3 DHA處理對共培養體系中CD8+T細胞的抗腫瘤免疫應答的影響流式細胞術檢測結果顯示,對照組和DHA處理組表達穿孔素的CD8+T細胞比例分別為0.62%±0.54%和4.46%±0.05%。見圖3A、B。表達顆粒酶B的CD8+T細胞比例分別為2.63±0.56%和9.67±0.70%。見圖3C、D。與對照組相比,DHA處理組的CD8+T細胞表達的穿孔素和顆粒酶B水平均明顯提升(t=13.58、12.35,

圖3 流式細胞術檢測CD8+T細胞功能

均P<0.01)。以上結果均表明DHA預處理的NSCLC A549細胞能夠誘導CD8+T細胞的抗腫瘤免疫功能。

3 討論

本研究結果表明,DHA能夠抑制NSCLC的生長和集落形成能力。Liao et al[5]研究表明,DHA能夠通過將NSCLC A549細胞的細胞周期停滯于G1期來抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。Han et al[6]研究結果表明,DHA能誘導細胞鐵死亡從而刺激內質網應激和DNA損傷,最終促進癌癥免疫原性細胞死亡,同時,DHA還能激活免疫細胞,在NSCLC荷瘤小鼠中表現出優異的抗癌療效。胡冰琪 等[7]研究表明,DHA能夠抑制NSCLC的遷移、侵襲和血管生成擬態。這些都證明了DHA能夠通過多種機制發揮抗腫瘤作用。此外,DHA還對多種腫瘤具有抗癌效果。例如,Rac1 siRNA可通過抑制核因子κB活化來促進DHA對結腸癌的抗癌作用[8],DHA還能通過增加肝癌細胞內活性氧的水平從而促進肝癌細胞凋亡[9]。另外,DHA還能通過調節細胞周期蛋白的信號傳導來抑制胃癌細胞的生長和侵襲[10]。以上研究均表明DHA具有廣泛抑制腫瘤的作用,很可能是癌癥治療的新方向。

CD8+T細胞在抗腫瘤免疫應答中起到重要作用,CD8+T細胞的浸潤增加表明可能產生有效的抗腫瘤免疫反應。本研究結果顯示DHA處理的A549細胞能夠明顯提升CD8+T細胞的比例,這表明DHA處理的A549細胞能夠誘導抗腫瘤免疫。Hu et al[11]研究表明,在建立的NSCLC小鼠模型中,DHA能夠通過抑制共信號分子CD276的表達來抑制NSCLC的增殖和侵襲,且對健康組織無明顯毒副作用,另外,該研究還表明,DHA能夠通過阻斷B7-H3來誘導腫瘤中CD8+T細胞的浸潤。Han et al[12]實驗結果也表明,在結直腸癌中,DHA以誘導細胞鐵死亡的方式抑制腫瘤生長并增強了CD8+T細胞的腫瘤浸潤能力,此外,DHA還能夠增強程序性死亡受體配體-1免疫檢查點抑制劑的療效。這些研究結果均表明DHA能夠刺激腫瘤微環境中CD8+T細胞的浸潤,與本研究結果一致。

本研究還表明DHA處理的A549細胞能夠刺激CD8+T細胞表達穿孔素和顆粒酶B,誘導CD8+T細胞的抗腫瘤免疫應答?；罨募毎拘訲淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)是體內最有效的免疫效應細胞,能通過多種途徑發揮抗腫瘤免疫效應。一般認為,腫瘤免疫中CTL主要通過兩種途徑誘導腫瘤細胞死亡,即穿孔素-顆粒酶途徑和Fas-FasL途徑[13]。Zhang et al[14]研究結果顯示,在黑色素瘤肺轉移的小鼠模型中,DHA增加了腫瘤中CTL的浸潤及其顆粒酶B分泌的水平,研究結果在一定程度上與本研究一致。也有其他研究[15]證明,在胰腺癌中,適當濃度的DHA有利于T細胞亞群的擴增并上調穿孔素和顆粒酶B的表達。但DHA誘導CD8+T細胞免疫應答的具體機制仍不清楚,細胞因子在其中發揮的作用也仍待進一步研究。

綜上所述,本研究表明DHA能夠抑制NSCLC細胞的增殖,同時DHA促進了NSCLC A549細胞CD8+T細胞抗腫瘤免疫應答。該研究結果為DHA在NSCLC治療中的應用提供了實驗依據,DHA可能會成為腫瘤免疫治療的新策略。