雙光子顯微成像系統的應用及開放管理模式探索

馮婉倩

（溫州醫科大學科研實驗中心，浙江溫州 325035）

傳統的單光子顯微成像技術利用400～700nm的可見光進行Z軸向激發，激光照射在標本上，染料分子吸收單個光子發射出熒光。在此基礎上，激光共聚焦系統通過引入共軛小孔，在一定程度上去除了非焦平面的雜散光，提高了成像分辨率，但在成像深度方面仍有很大的限制。通常，我們利用共聚焦技術觀察的普通標本厚度不超過200μm，透明化標本的厚度不超過500μm。相比之下，多光子顯微成像技術通過點激發熒光顯著提高了成像深度，使得觀察活體標本的深度可達800μm，透明化標本厚度最大可達8mm。同時，該技術具有天然的切片效果，且空間分辨率幾乎沒有損失，其XY軸分辨率可達200nm，Z軸分辨率最大為500nm。因此，多光子顯微鏡在大小鼠、兔、斑馬魚、果蠅等模式動物活體XYZT多序列成像方面具有顯著的應用優勢，已成為研究胚胎、不同組織和器官中各種類型細胞的形態與功能的有用工具。盡管多光子顯微鏡的光損傷小，但其熱毒性較高，相較于共聚焦技術的成熟穩定，還需進一步摸索條件?；铙w樣本通過轉基因、病毒標記、免疫熒光標記、小分子探針標記、血管注射染料等方法進行標記，操作復雜，需手術暴露成像部位，成像效果在很大程度上依賴于實驗技能水平。本文通過總結多光子顯微鏡的配置參數、成像特點、工作原理及在不同應用中的操作特點，能夠更好地服務于教學和科研。

溫州醫科大學已建成國家級工程中心、省部共建國家重點實驗室以及省部級重點實驗室等多個重點研究平臺。學?，F有的醫學遺傳學重點實驗室、模式生物技術應用重點實驗室、臨床檢驗診斷、中醫藥研究院、基因組學研究院、分析測試中心等多個科研平臺在前期已建立較為完善的科研體系。近年來，科研實驗中心大型儀器平臺的建立與運行為學校和附屬醫院的科研發展、疾病防治和精準治療提供了支持。目前，平臺配置了一臺OLYMPUS正置雙光子顯微鏡（FVMPERS），配備了兩臺光譜物理紅外飛秒脈沖激光器，型號分別為Insight X3和Mai Tai Deepsee，波長分別在680～1 300nm和690～1 040nm可調，具備雙光子激發、同步雙掃、四軸校準、三維拼接四大重要技術。該儀器自裝機以來，使用率高，總使用次數達1 600余次，服務時長超過2 100小時，用戶主要分布在藥學院分析測試中心、眼視光醫院、基礎醫學院、第一和第二臨床醫學院、公共衛生與管理學院等機構，涵蓋了藥學/藥理學（神經藥理學）、藥物分析、藥劑學、生物材料與再生醫學、光控視覺發育和腦功能的分子機制、急性肺損傷的炎癥消退機制等多個研究方向，滿足了校內外眾多課題組在基礎研究方面的需求。

一、雙光子顯微鏡發展概況

20世紀90年代，Denk等人[1]發明了第一臺雙光子顯微鏡，并首次應用于生物樣本。此后，雙光子技術在生物醫學研究中的應用取得了爆炸性的增長。雙光子顯微成像基于多光子吸收理論，即熒光基團在同時吸收兩個光子的能量后被激發，當受激電子回到基態時，大部分能量以熒光形式發射的過程。在這個過程中，紅外飛秒脈沖激光器提供了高強度、非線性、長波長（＞700nm）的近紅外激光，使得激發的發射光被高數值孔徑的物鏡限制在焦點周圍，激發體積通常小于毫微微升。此外，雙光子顯微鏡的瞬時能量更高，導致其吸收譜線更寬，單個激發光可激發出不同的熒光。因此，雙光子顯微鏡可以基于組織成分的內源性屬性差異，進行無標記成像來觀察組織自發熒光。目前，商業化定制或半定制的可調諧鎖模鈦藍寶石近外飛秒激光器已替代可見激光源，在商品化的雙光子激光掃描顯微鏡中被大量引入，推動多光子顯微鏡技術在更廣泛的生物醫學研究領域的擴展[2]。

雙光子顯微鏡以其高信噪比和優越的生物組織穿透深度，結合三維層掃描分辨率的優點，成為重要的活體成像技術。許多活體神經生理過程的觀察和體內微環境的動態變化都需要毫秒級的掃描速度?，F代雙光子儀器利用聲光轉換器代替檢流計，能將掃描速度提高幾個數量級，對于活體觀察具有非常好的優化特性。我們利用聲光轉換器代替檢流計能顯著提高掃描速度，為活體觀察提供了非常好的優化特性?；铙w成像面臨的另一大難題是隨著深入活體組織樣本，不可避免地會出現熒光標記減弱的問題。為了解決這一問題，研究和應用各類專用于紅外校正的高數值孔徑、長工作距離物鏡及高靈敏度檢測器已成為當前的主要發展方向，更利于雙光子顯微鏡在活體觀察中的應用。

近年來，雙光子顯微鏡還被廣泛結合多種儀器應用于觀察多種生理狀態下不同疾病模型的變化及作用。例如，雙光子顯微鏡與二次諧波（second harmonic generation，SHG）顯微鏡結合，可以對膠原蛋白等具有特定序列排列的結構蛋白進行成像，在糖尿病、老化、癌癥等病理學和生理學研究上發揮重要作用。雙光子顯微鏡結合熒光壽命成像（FLIM）配件可以測量溶液離子濃度、折射率等參數[3]。雙光子顯微鏡結合膜片鉗技術可以改進活體腦組織切片神經元深層成像效果。此外，雙光子顯微鏡還能與等離子激光共振效應結合[4]，提高非線性過程的信號強度。因此，其在材料科學方向也展現出深遠的應用前景。

二、雙光子顯微技術的應用

（一）雙光子顯微鏡獲取活體血流圖像操作

為了獲取活體血流圖像，建立一個穩定的觀察窗口是進行活體實驗的前提，因此隔離活體動物呼吸和心跳的影響是尤為重要的。真空負壓裝置能夠吸附器官和軟組織，有效地防止活體器官組織在顯微成像時發生抖動。使用者需調整活體成像器官固定儀吸附探頭的角度和位置到樣本上方，再通過調節旋鈕讓吸盤與組織完全貼緊直至吸力穩定，在調節過程中要避免壓力過大導致血流因人為因素停滯或減緩，否則可能影響實驗結果的判斷。

雙光子專用FV31S-SW軟件的觀察方法如下：首先點擊IR Laser Immision打開激光，并在激光設置界面輸入擬使用的激發光波長。兩臺激光器能夠發出不同波段的近紅外光，激發多種染料的熒光，有效避免各個染料之間發生串色現象。X3激光器適用于激發各類熒光蛋白成像，而Mai Tai激光器因其脈寬更窄，適用于深層成像和刺激，可用于激發組織自發熒光以顯示血管結構。通道參數的設置需切換到檢測器控制面板，勾選所需的檢測通道，打開平均線性降噪和防串色功能，掃描分辨率選擇512X512（全畫幅）像素，將采集速度控制在2μs/pix左右，上述參數的應用通常能夠獲得較高信噪比的圖像。熒光強度的調節可以通過改變激光強度和檢測器電壓實現，同時使目標樣品到達最佳焦平面，激光功率越高，信號越強，但也更容易使染料發生淬滅。一般情況下，我們推薦活體實驗的激光功率在不高于20%范圍內調節，同等條件下，建議優先調節檢測器電壓HV值。最后時間序列掃描功能在Time Lapse設置模塊進行設置，需設置的參數包括拍攝的圖像數量Cycles，并點擊Acquire進行獲取以及采集完成后，可再選擇一定數量的微血管（測量直徑≤10μm）進行線掃描，從而完成對血流速度的量化分析[5]。

（二）雙光子顯微鏡腦成像技術要點

大多數腦科學研究樣品為腦組織切片或離體培養的神經元細胞，無法全面地反應大腦在三維空間內微環境的結構與功能。因此，實現活體皮層的高分辨率成像對于理解大腦血管、神經網絡動態變化規律以及情感、記憶之間的聯系具有重要意義。大腦皮層由大量的神經元和膠質細胞組成，其上方被顱骨組織包覆。顱骨的致密結構具有強烈的散射效應，是觀察腦皮質血管結構和分析神經元信號的主要障礙。為了克服這一障礙，傳統的顱骨清除方法，包括開窗法和磨骨法，雖然在一定程度上能滿足研究要求，但具有局限性。例如，開顱窗很難避免相關的炎癥反應，由于骨的再生，實驗人員需要反復將顱骨磨薄至25μm以下，對實驗技能要求較高，且無法實現無創的腦光學成像。相對而言，活體顱骨透明化方法允許進行大面積重復成像，幾乎不引起皮層損傷和炎癥，代表了一種新型的、安全有效且易于處理的顱窗技術[5]（如表1）。近年來，活體光透明化試劑的進一步發展為雙光子顯微技術在生物醫學光學成像領域的應用提供了重要手段。透明化試劑的作用包括軟化顱骨和匹配折射率兩個方面，其成分通常包括陰離子表面活性劑、金屬離子螯合劑、膠原蛋白水解酶以及甘油等。構建一個透明化顱窗大約只需15分鐘，結合雙光子顯微鏡，能夠反復成像皮層淺層的樹突棘、小膠質細胞和毛細血管[11]。

表1 顱窗手術方法比較

在神經科學研究中，鈣信號是神經元—神經膠質細胞之間主要的信息傳遞者。研究表明[12]，為了捕捉到鈣離子的快速變化，每幀圖像的掃描時間應控制在200ms以內。鈣閃爍的快速成像需在LSM Imaging面板切換到Resonant快掃模式，以Roundtrip方式進行掃描，調節Roundtrip掃描孔徑使細胞胞體邊緣實體化，將拍攝頻率控制在33赫茲左右。由于最快掃描速度的限制，實驗人員可以通過提高激光功率和檢測器電壓的比值的方法增強圖像信噪比，實時監測神經元內的鈣信號進行一段時間的記錄。圖像處理軟件Cellsense能夠對被記錄圖像中實時信號的變化進行分析，具體做法為以監測時間為橫坐標，單個神經元熒光信號強度變化為縱坐標進行作圖，形成的波形圖中一個波峰即代表一個動作電位。

（三）雙光子顯微鏡原位觀察方法

眾多腦部疾病在發展進程中，以腦組織局灶性缺血為核心，誘導生成一系列炎癥因子，最終對神經元造成不可逆的損傷。因此，活體腦血管形態觀察、血液流速分析是判斷腦組織損傷程度的重要指標。實際研究過程通常要求測量同一視野下的數據進行術前與術后的比較，定位需精確到同一根血管或同一個神經元。然而，腦小血管是體內最復雜的血管網絡系統，包含直徑介于40～200μm的微小動脈、小動脈和小靜脈，實驗人員很難對活體對象的同一根微小血管進行原位觀察和反復對比。雙光子顯微鏡的高倍物鏡和Map拼接功能能夠拍攝全顱窗內的微小血管，再通過前后比較可以較好找到初始視野，無需特異性染色標記。這是一種簡便的原位血管觀察方法。

原位血管觀察流程主要依據雙光子軟件的Map地圖拼接功能，小鼠全顱窗的定義方法是利用Point Register工具沿著顱窗邊緣劃出輪廓，再圈選整個顱窗，進一步標記Num of Areas。與常規觀察類似，檢測通道和每個區域的熒光強度和焦平面都需設置正確以確保圖像分辨率達到最佳。設置完成后，拍攝模式選擇Resonant，添加8-10次平均降噪處理，軟件完成所有操作后MATL中開始拍攝。拍攝完成得到的圖像需在大圖拼接模塊進行Splicing拼接。小鼠經手術處理后，實驗人員通過比對Areas的血管走向和形態找到相同視野，拍攝同一根血管圖像。高分辨率的實驗分析需要在Cellsense軟件中進行消卷積處理，此操作可顯著提高圖像質量。

三、雙光子顯微鏡管理思路

（一）雙光子儀器校準與維護

溫濕度是影響儀器系統穩定性的重要因素。儀器室的環境溫度應恒定在18～22℃，濕度應維持在40%～60%。此外，外置NDD檢測器具有極高的感光靈敏度，環境光會使其性能下降。因此，實驗人員啟動軟件之前，需關閉室內燈，使顯微鏡主機周圍區域保持在黑暗狀態。為了確保輸出穩定的激光束，IR脈沖激光器需要在每次實驗之間預熱至少30分鐘，并由專業人員定期進行檢測，檢測內容包括以下：主激光器Insight X3和副激光器Mai Tai DeepSee的電流應分別穩定在10.3mA和6.51mA左右，濕度顯示在10%以下，移動波長功率曲線。其中，X3激光器應在900nm達到最大功率，呈現為中間高，兩邊下降的平寬型正態分布樣。當實際功率大于指標功率時，這說明激光器正?？捎?。Mai Tai激光器在800nm時功率最大，功率曲線應呈現為中間高，兩邊快速下降的陡窄型正態分布樣。當DeepSee power/Mai Tai power＞85%時，這說明激光器正?？捎?。在激光器的日常維護中，我們要注意激光器電源及水冷系統需常年保持開啟，定期檢查除濕通氣管和冷卻液管是否暢通，及時更換冷凝液進行循環冷卻，以維持飛秒激光器的恒定溫度在21℃下才能工作。另外，實驗人員要根據樣本的觀察需求，選擇配備相應的物鏡鏡頭，使用浸液系物鏡時，將物鏡頂端浸入有標本的介質中，避免超過電絕緣區，每次浸沒使用后，需用中性洗滌劑清洗前端鏡頭。

（二）雙光子儀器培訓與開放使用

大型儀器設備是衡量各高?？蒲袑嵙Φ闹匾笜酥?，而一個健康的共享機制則是儀器平臺可持續發展的關鍵條件之一。通過實施申請培訓—考核—授權使用的流程，用戶能夠熟練掌握儀器的基礎知識，并根據他們所具備的相應儀器操作能力的等級進行分類，進而開放不同的使用時段。這一做法不僅可以優化儀器的使用效率，而且能培養用戶獨立操作科研設備和創新實踐的能力。目前，平臺培訓主要以集中培訓為主，輔以定制化培訓。雙光子顯微鏡作為專人專管的儀器，其培訓方案分為理論培訓和上機培訓兩部分，均由儀器管理員負責開展。理論培訓的內容涵蓋了儀器的工作原理、結構、應用及預約使用流程。以FVMPE-RS型號為例，其重要部件包括SpectraPhysics雙飛秒激光器系統、多光子掃描系統、無針孔反射熒光4通道NDD檢測器和全電動物鏡聚焦式顯微鏡主機。其特點表現在使用共振式掃描振鏡可以實現高速觀察，而使用Galvanometer掃描振鏡則能實現高分辨成像，同時，根據物鏡和激光波長的不同，可以自動進行擴束，以實現高效率的成像。配備的負色散補償系統可以最大程度地降低對標本的損壞，從而在較低激光功率下觀察樣本。理論培訓結束后進行上機培訓，內容包括開關機、軟件使用流程及實操訓練。我們給用戶培訓時要演示正確的開關機順序，強調按照標準流程開機，分為9步：1.打開電動顯微鏡BX63部件控制器；2.打開電動載物臺控制器電源；3.打開汞燈電源；4.打開掃描系統控制部件FV30-PSU；5.打開同步光刺激組件FV30-SIMMP；6.打開雙激光器引入裝置；7.打開操控屏TPC；8.待TPC顯示Start Operation后才能開啟SW軟件；9.在軟件中打開激光。上述兩部分培訓經考核，成績均合格后由儀器管理員在大儀預約系統上授權使用。

四、結束語

在體監測細胞功能、生物物質分泌過程和血管形態對于我們理解體內臟器病變的發展進程、揭示相關的病理機制并開展相應的治療手段起著關鍵作用?；铙w光學成像是研究臟器組織結構和功能的一種重要方法。雙光子顯微技術常用于血管、淋巴、神經的精細結構成像，并在活體動物研究中具有特殊優勢。在實驗過程中，為了獲得高分辨率的圖像，我們需要注意以下幾點：1.手術過程中，實驗人員的動作要細致，時刻關注出血情況，避免污染觀察窗口；2.透明化效果決定成像深度和圖像信噪比。因此，在透明化試劑配制過程中，實驗人員要確保澄清透明無沉淀，且應現配現用，透明時間需要充足，上機前要防止窗口產生氣泡干擾。

雙光子顯微鏡價格昂貴，維護復雜。因此，在日常使用的基礎上，強化平臺管理制度、制定系統化培訓方案、建設多樣化信息交流平臺是維持儀器穩定狀態、發揮大型科研儀器設備使用效益、加快科研成果產出的有利策略。本文介紹了超快速雙光子在體顯微成像系統的基本原理和組成，探討了雙光子顯微鏡在活體研究中檢測方法的建立和觀察要點，以及其創新管理模式，旨在為廣大高校實驗技術員提供借鑒思路。