葛根素口服給藥對急性酒精中毒解酒作用的研究

范志銘，張耿強，蔡舒冰，李曉霞，何宇

（廣州醫科大學第六臨床學院，廣東清遠 511500）

急性酒精中毒（acute alcohol intoxication，AAI）是指短時間攝入大量酒精或含酒精飲料后而引起的中樞神經系統功能紊亂狀態，臨床表現為行為和意識異常[1]。此外，持續大量飲酒還可誘發肝細胞廣泛壞死，進而發展成急性酒精性肝炎（acute alcoholic hepatitis，AAH），嚴重者損傷臟器功能，危及生命[2]。調查指出，我國飲酒人群及人均飲酒量呈不斷攀升的趨勢，酒精濫用及依賴成為公共衛生問題[3]，急性酒精中毒已成為急診科最常見的中毒之一。無論是國內還是國外，發病均呈上升趨勢，嚴重危害人民健康。因此，尋找有效的解酒預防藥物受到人們的普遍重視。

葛根[Pueraria lobata（Willd）Ohwi]為豆科植物野葛的干燥根，葛根素（Puerarin）是從中分離得到的主要生物活性成分，化學名為8-β-D-葡萄叱喃糖-4，7-二羥基異黃酮（8-β-D-Glucopyranosy-7，4-hydroxyisoflavone）。葛根在解酒、治酒病方面的明確療效自古以來就有記載?！侗静菅芰x》中記載以葛根解酒護肝，曰：“病酒及渴者，行之甚良”?，F代藥理研究結果表明，葛根素具有擴張冠脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收縮功能、降低血液黏稠度、改善循環等作用，可以降低小鼠酒精吸收量，加速酒精代謝，提高對酒精耐受量的作用[4]。葛根素制劑有注射液、凍干粉針劑、滴眼劑等，在臨床時一般選擇注射給藥，但未有口服給藥。近年來，不少關于葛根素注射液不良反應的報道出現，輕者可表現為紅斑、瘙癢、皮疹、丘疹等皮膚黏膜改變，重者會導致變態反應、藥物熱、溶血性貧血、過敏性休克等全身癥狀，其安全性引起了醫藥界的高度重視。這大大威脅著用藥者用藥安全，亟需改進[5]。鑒于葛根素注射液的使用不便及高不良反應率，本研究通過葛根素口服給藥，不但使用方便，而且可避免其注射給藥帶來的不良反應。

因此，本研究通過觀察葛根素口服給藥后急性酒精中毒小鼠的肝系數和血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）濃度，對小鼠翻正反射消失時間和軀體麻痹癥狀持續時間的影響，以及小鼠肝組織病理形態學變化，探討葛根素口服給藥對急性酒精中毒的解酒保護作用，為葛根素解酒保肝制劑的開發提供實驗依據。

一、材料和儀器

（一）實驗動物

清潔級健康小鼠24只，雌雄不拘，體重為20～24g，由廣州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（粵）2021-0168。動物飼養條件：普通級動物室；室溫：（25±2）℃；相對溫度：（40±2）%；通風、光照良好，采用標準飼料喂養，自由攝食飲水。

（二）藥品及試劑

生理鹽水；紅星二鍋頭（由北京紅星股份有限公司第一分公司生產，產品標準號為：GB/T10781.2）；葛根素溶液（用生理鹽水配備成濃度為0.3g·ml-1的溶液）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT/GPT）測定試劑盒（由中生北控生物科技股份有限公司提供，產品批號：182651）；其余均為分析純、生化試劑。

（三）實驗儀器

HH-W420型數顯三用恒溫水箱（常州金壇精達儀器制造有限公司）；722s可見光分光光度計（上海棱光技術有限公司）；JJ300A型電子天平（美國雙杰兄弟〔集團〕有限公司）；OLYMPUS CX23高清數碼拍攝顯微鏡（湖南亮晰光學儀器有限公司）。

二、方法

（一）動物分組、造模及給藥

本研究隨機將小鼠分為正常對照組、模型組和葛根素組，每組8只。除正常對照組外，其余各組小鼠均按0.15ml·10g-1灌胃56°二鍋頭白酒進行造模[6]。葛根素組按照0.3g·ml-1葛根素溶液0.2 ml·10g-1灌胃，正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

（二）指標檢測

給藥2h后，研究人員觀察各組小鼠酒精灌胃前后有無死亡，外觀、行為活動、精神狀態等有無明顯異常，觀察藥物灌胃后各組小鼠有無出現死亡、興奮狂躁、共濟失調、活動減少、嗜睡等表現，觀察并記錄小鼠翻正反射消失的時間（當小鼠出現動作不協調的癥狀時，輕柔地翻轉小鼠，使之處于側臥位，20s之內不能自主翻正，則判斷翻正反射消失。當小鼠恢復自行翻轉時，則認為翻正反射恢復）和軀體麻痹癥狀持續時間（從翻正反射消失至恢復翻正反射的總時長）。待小鼠軀體麻痹癥狀解除，麻醉后尾靜脈取血5mL，常溫下靜置血樣15min，4℃、400g離心10min，取血清按試劑盒說明書檢測小鼠血清中的ALT濃度，之后處死小鼠，測量小鼠的體重，取肝組織，測量肝臟濕重，計算小鼠的肝系數（肝系數＝肝臟濕重/小鼠重量×100%）。

（三）組織病理形態學觀察

研究人員取肝實質部位，于10%甲醛溶液中固定，常規石蠟浸潤包埋并制作成厚度為4μm的連續石蠟切片，置于電熱恒溫干燥箱中，60℃烘烤2h，烘烤完畢對干燥的石蠟切片進行二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟后，蒸餾水洗，蘇木素溶液染色5min、1%鹽酸乙醇分化30s、0.5%伊紅水溶液染色3min，進行常規HE染色，水洗沖掉殘留染液，切片經梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封片。使用光學顯微鏡于10×40倍視野下隨機選擇一個視野觀察并拍照，觀察肝臟組織病理學變化。

（四）統計學方法

本研究采用 SPSS 25.0統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料數據以表示，組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05認為差異有統計學意義。

1.葛根素對急性酒精中毒小鼠中樞神經系統的影響

酒精灌胃后，各組小鼠均無出現死亡，小鼠均出現明顯的醉酒狀態，先表現為躁動不安，后表現為活動減少和動作不協調，緊接著隨后出現昏迷、昏睡、軀體麻痹，而葛根素組小鼠給藥后精神狀態、活動能力均較模型組明顯改善。翻正反射時間反應醉酒潛伏期。與模型組相比，葛根素組小鼠給藥后精神狀態、活動能力明顯改善，葛根素組翻正反射消失時間為[（368.80±115.80）s]，軀體麻痹癥狀持續時間為[（13.77±2.76）s]。與模型組翻正反射消失時間[（173.30±90.50）s]和軀體麻痹癥狀持續時間[（25.22±7.93）s]相比，翻正反射消失時間延長（P＜0.05），軀體麻痹癥狀持續時間縮短（P＜0.05），說明葛根素口服給藥可減輕急性酒精中毒小鼠的中樞神經系統癥狀。葛根素對急性酒精中毒小鼠神經系統的影響詳見表1。

表1 葛根素對急性酒精中毒小鼠神經系統的影響（± s，n=8）Table 1 Therapeutic effects of pueraria on central nervous system in acute alcohol intoxications mice（± s，n=8）

與模型組比較：*P＜0.05，*P＜0.05

組別 劑量/ml·10g-1小鼠體重/ g翻正反射消失時間*/ s軀體麻痹癥狀持續時間*/ min正常對照組 NS 21.42±0.74 ——模型組 NS 21.65±1.04 173.30±90.50 25.22±7.93葛根素組 0.20 21.76±0.98 368.80±115.80 13.77±2.76

2.葛根素對急性酒精中毒小鼠肝功能的影響

肝系數反映小鼠肝臟的腫脹程度，是肝臟炎癥嚴重程度的指標。當肝臟出現水腫、充血或炎癥時，肝系數會明顯增大。正常對照組肝系數為[（5.53±0.32）%]，葛根素組為[（5.72±0.36）%]，模型組為[（7.22±0.93）%]。與模型組相比，葛根素可降低肝系數（P＜0.05），具有統計學意義（如圖1）。研究人員處死小鼠，取出肝臟，模型組小鼠的肝臟炎癥癥狀較其他組明顯，體積增大、質地堅實、邊緣圓鈍、包膜緊張、充血紅腫。HE染色鏡下顯示，正常對照組小鼠肝臟形態正常，模型組小鼠肝臟匯管區肝細胞出現大塊帶狀壞死，細胞腫脹，炎性浸潤，胞質疏松呈網狀，出現嗜酸性變，胞核固縮碎裂，壞死細胞約占82%，而葛根素組小鼠肝細胞散在壞死，約占69%，葛根素組壞死肝細胞百分占比低于模型組，肝細胞壞死情況明顯改善（如圖2）。另外，肝細胞內含有大量的ALT，受損的肝細胞會釋放大量的ALT入血，導致血清中ALT濃度明顯上升。正常對照組血清ALT濃度[（28.04±1.70）μg·L-1]，葛根素組為[（107.88±1.88）μg·L-1]，模型組為[（252.90±9.72）μg·L-1]。從實驗結果來看，模型組小鼠血清中ALT濃度顯著升高，葛根素可抑制血清ALT濃度的升高（P＜0.05），有效防治急性酒精性肝炎（如圖3）。結果表明，葛根素口服給藥可保護急性酒精中毒小鼠的肝功能。

圖1 各組小鼠的肝系數

圖2 小鼠肝臟HE 染色結果

三、討論

根據上述實驗結果，葛根素口服給藥對急性酒精中毒小鼠具有一定的解酒作用，能縮短小鼠翻正反射消失時間和軀體麻痹癥狀持續時間，還可降低肝系數，減低血清ALT濃度，顯著減輕酒精對小鼠肝細胞的損害，對急性酒中毒小鼠肝功能有明顯保護作用，佐證了其臨床用藥的可行性和有效性。

葛根素是從葛根中提取出的主要活性物質，其藥理作用廣泛，早在唐代就已經有“解酒毒”作用的記載，食藥兼用歷史悠久，其作用機制可能為通過延緩胃排空，減慢酒精吸收速率，降低腸壁通透性，從而降低酒精對中樞神經系統和肝臟的損害[7]。同時，酒精大部分在肝臟中進行代謝排出體外，其中主要的途徑為乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將酒精氧化為乙醛，乙醛再通過乙醛脫氫酶氧化為乙酸。張偉等人的一項研究表明，葛根素預處理可以使酒精中毒小鼠肝臟的乙醇脫氫酶活性升高[8]，還可以滅活細胞色素CYP2E1，從而減少乙醇在分解代謝中產生的自由基，減輕酒精對肝細胞的損傷[9]。此外，葛根素還可以刺激腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，進而阻斷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）S6核糖體蛋白和4E結合蛋白-1表達，使乙醇培養的肝細胞恢復自噬，減輕急性酒精中毒對肝臟的損害[10]。

此外，葛根素還可以抑制內毒素腸漏、庫普弗細胞活化和內毒素受體表達減輕急性酒精中毒對肝臟的損害。彭靖華等人[11]發現口服葛根素可逆轉大鼠酒精攝入引起的谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、γ-谷氨酰轉移酶和甘油三酯水平升高，抑制酒精誘導的肝小葉和脂肪肝中性粒細胞浸潤，并阻斷酒精刺激下TNF-α、內毒素、內毒素受體活性、肝臟CD68、CD14、LPS結合蛋白和Toll樣受體2/4表達水平的上調，調整腸微絨毛的分布，下調腸閉鎖小帶-1蛋白（Intestinal zonula occludens-1）表達水平。

但是，由于葛根素具多苯環和多羥基的結構，在水中微溶，且口服后難以被胃腸道等生物膜吸收，生物利用度較低，限制了其口服給藥的應用[12]。因其水溶性差，所以廠家在生產葛根素注射劑時需要加入高濃度的丙二醇作助溶劑，通過增大藥物的黏稠度來提高利用度。這樣不僅在生產過程中增加成本，而且乙二醇有引起發熱、過敏性休克等過敏反應的風險[13]。不少學者對葛根素的口服制劑方面進行了廣泛研究，主要是改善葛根素溶解度和生物利用度，尚未取得較好的進展[14]。近年來，隨著納米技術在多領域的廣泛應用，開發出葛根素磷脂復合物、葛根素緩釋復合骨架片、葛根素納米粒等制劑，使得葛根素均勻分散，更容易透過生物膜，增加了溶解度和生物利用度[15]。有學者研究發現，納米化葛根素能顯著增加葛根素在水中的溶解度，提高口服葛根素的生物利用度，且納米化的葛根素平均滯留時間、消除半衰期比口服葛根素溶液和葛根素混懸液有明顯延長，藥時曲線下面積（Area Under Curve，AUC）、峰濃度也有較大提高，達峰時間明顯提前，顯示了納米化葛根素能使葛根素的吸收增加，作用增強或延長[16]。目前，納米化葛根素進入藥效、毒理的全面評價研究階段。因此，這可成為葛根素口服給藥劑型開發的一個研究方向[17]。