基于GC-MS研究OPFRs對PC12細胞代謝的影響

孫夢瑤 趙亞菲 王少敏 劉宏民

摘 要：基于氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）研究了4種有機磷阻燃劑（organophosphate flame retardants，OPFRs）對神經細胞PC12代謝的影響.首先將PC12細胞分別暴露于4種不同濃度的阻燃劑中，利用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法選出對細胞存活率影響較小的濃度.然后在該濃度下培養細胞并提取代謝物，利用GC-MS對細胞內的代謝物進行非靶向代謝組學分析.接著采用SIMCA軟件對定量后的代謝數據進行OPLS-DA分析，找出細胞中受到OPFRs影響的關鍵代謝物，并利用生物信息學方法分析這些關鍵代謝物所涉及的重要代謝通路.該研究共鑒定出PC12細胞中的38種小分子代謝物.經過多元統計分析發現4種OPFRs均影響PC12細胞的代謝表型.OPFRs在100 μmol/L和1 000 μmol/L濃度下，對PC12細胞表現出顯著的細胞毒性.其中糖代謝和氨基酸代謝是受影響的主要代謝通路.

關鍵詞：有機磷阻燃劑；代謝組學；氣相色譜質譜；PC12細胞

中圖分類號：R114 文獻標志碼：A文章編號：1000-2367（2024）02-0096-08

有機磷阻燃劑（organophosphate flame retardants，OPFRs）是一類含有有機磷元素的新型添加劑，具有熱穩定性，能夠阻止聚合物材料引燃或者抑制火焰傳播，其已被作為禁用溴化阻燃劑的替代品而廣泛使用^［1-2］.與傳統阻燃劑一樣，OPFRs并非通過化學骨架與外源材料結合，主要是通過物理手段加入外源材料，此外大多數OPFRs具有半揮發性，因此很容易進入環境介質中^［3］.環境中的這些污染物可以通過室內灰塵吸入、皮膚吸收、手口接觸的方式進入人體，對機體產生不同程度的損傷，威脅人類健康^［4-5］.因此對這些環境污染物毒性的研究具有重要意義.本文研究目的是探究4種OPFRs（磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPHP）、甲苯磷酸二苯酯（cresyl diphenyl phosphate，CDP）、間苯二酚雙（二苯基）磷酸酯（resorcinol bis（diphenyl phosphate），RDP）和磷酸三烯丙酯（triallyl phosphate，TAP））對神經細胞PC12代謝的影響.

芳基OPFRs具有發育、生殖和內分泌毒性，以及潛在的神經毒性^［6］.TPHP、CDP和RDP均為芳基OPFRs.有研究表明TPHP有內分泌擾亂作用和發育毒性^［7］，對呼吸道細胞也有明顯的損傷作用^［8］；CDP會破壞DNA和線粒體，導致細胞周期停滯^［9］；RDP的分子結構是以TPHP為基礎的，分子量和含磷量比TPHP高，導致其揮發性比TPHP低，熱穩定性比TPHP高，因此RDP極有可能會產生生物積累效應^［6］.TAP可以作為反應型阻燃劑，添加到不飽和聚酯樹脂和高壓鋰離子電池的電解液中，起到阻燃和改善相關性能的雙重作用^［10-11］.目前，對于TPHP和CDP神經毒性的研究比較少，而RDP和TAP對PC12細胞毒性的研究則未見報道.

代謝組學目前已經成為對不同類型生物組織中的代謝物進行定性和定量分析的前沿方法，通過生成來自生物代謝物的小分子輪廓，直觀反映出復雜生化反應網絡的結果^［12］.近年來，科學界積極探索代謝組學的功能表征，并將該方法用于解決環境毒理學方面的問題^［13］.同時，由于氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術的穩健性和重現性，以及成熟的代謝物數據庫，其被認為是代謝組學研究最高效的平臺之一^［14］.

本研究以PC12細胞作為OPFRs神經毒性探究的體外模型，對暴露于OPFRs的細胞提取物進行了基于GC-MS技術的代謝組學分析.研究結果可為新污染物對人類的健康風險提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TPHP（CAS：115-86-6，純度98%）購自阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰?；CDP（CAS：26444-49-5，純度93%）購自北京百靈威科技有限公司；代謝物對照品（分析純）和RDP（CAS：57583-54-7，純度98%）均購自上海麥克林生化科技有限公司；TAP（CAS：1623-19-4，純度98%）購自上海畢得醫藥科技股份有限公司.溶解上述化學品所需的二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司.高糖培養基（hyClone）、胎牛血清（cell-Box）、青霉素-鏈霉素溶液購自碧云天生物技術有限公司.甲醇、甲基叔丁基醚、吡啶和甲氧胺鹽酸鹽均購自美國默克公司，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，純度98%）和硅烷化試劑三甲基氰硅烷均購自天津希恩思生化科技有限公司.實驗用水均為Milli-Q超純水機制備的超純水.Trace ISQTM氣質聯用儀（EI離子源）和LabServ K3 Touch酶標儀均為美國Thermo Scientific公司生產.

1.2 細胞培養

PC12細胞由鄭州大學藥學院提供，在本實驗室進行傳代培養.細胞培養在由胎牛血清（體積分數為10%），青霉素/鏈霉素雙抗混合液（體積分數為1%）和高糖培養基（體積分數為89%）配制而成的完全培養基中進行.細胞接種時用直徑6 cm的培養皿，并將培養皿置于環境適宜的培養箱（37 ℃、體積分數5%的CO₂）中培養.觀察細胞生長至密度90%左右可進行傳代，胰酶消化50 s左右.

1.3 MTT分析

使用MTT比色法，評估4種有機磷阻燃劑對PC12細胞活力的影響.將從培養皿中收集的細胞以5 000個/孔的密度接種在96孔板中，每孔有100 μL細胞懸液，在培養箱中培養24 h.待細胞貼壁后，去除舊培養液，對細胞進行48 h的OPFRs暴毒處理.隨后向每個孔中加入20 μL的MTT溶液（終質量濃度0.5 g/L）.待孵育4 h后，加入100 μL的三聯液（SDS-HCl-異丁醇溶液）溶解與活細胞數成正比的甲臜晶體.6 h后，使用酶標儀在570 nm處測量吸光度.

1.4 細胞樣品前處理

細胞接種：將對數生長期狀態良好的PC12細胞以10⁵個/孔的密度接種于消毒后的培養皿中，培養過夜.

暴毒處理：細胞貼壁后，棄去舊培養液.在1.3節分析基礎上，用10 μmol/L的OPFRs對細胞進行48 h的暴毒處理.隨后，取出細胞培養皿置于冰上，除去培養液，用4 ℃預冷的生理鹽水洗滌細胞3次，立即移入超低溫冰箱（-80 ℃）抑制細胞代謝.

代謝物的萃?。簭某蜏乇淙〕黾毎?，用細胞刮刀分3次獲取約300 μL的細胞懸液于1.5 mL的EP管中，隨后進行3次凍融循環（-80 ℃ 存放60 min，37 ℃融化30 min）.細胞破碎后，加入90 μL的內標溶液，600 μL的萃取溶液（甲醇和甲基叔丁基醚體積比9∶1混合），渦旋混勻后，4 ℃靜置1 h沉淀蛋白及萃取代謝物.接著4 ℃，12 000 r/min，低溫離心10 min.離心后，取上層代謝物溶液于衍生瓶中，37 ℃下氮氣吹干.

代謝物的衍生：采用本實驗室開發的肟化和硅烷化兩步衍生法^［15］.衍生后的樣品轉入色譜瓶中供GC-MS分析使用.

1.5 數據處理

將GC-MS獲得的譜圖和原始數據導入AMDIS數據處理軟件進行解卷積，使用NIST數據庫和標準物質鑒定代謝物.對代謝物的特征離子峰進行面積積分，并根據每個樣本的內標面積對所得數據歸一化處理，得到代謝物的相對濃度.使用SIMCA-P14.1軟件對處理后的數據進行分析，采用OPLS-DA模型對數據降維處理，獲得樣品的分類和聚集信息以及VIP值，然后選擇SPSS 22.0軟件中的獨立樣本t檢驗對數據進行差異分析.

2 結 果

2.1 MTT法測定OPFRs的細胞毒性

利用MTT法測定了4種OPFRs分別在0.1～1 000 μmol/L濃度下對PC12細胞的毒性效應，如圖1所示.結果表明4種OPFRs在1 000 μmol/L和100 μmol/L濃度下，表現出顯著的細胞毒性，而在10 μmol/L、1 μmol/L和0.1 μmol/L濃度下細胞毒性差異均不顯著.因此選定10 μmol/L作為進一步細胞代謝組學實驗的暴露濃度.

2.2 PC12細胞中代謝物的鑒定

經過GC-MS分析后，得到細胞內代謝物的總離子流圖，見附錄圖S1.經鑒定得到38種胞內代謝物.

2.3 GC-MS數據的多元統計分析

為了分析4種OPFRs對PC12細胞的影響，使用GC-MS對分別暴露于4種OPFRs的細胞進行了非靶向代謝組學分析.得到的數據通過SIMCA軟件進行OPLS-DA處理.OPLS-DA模型可以縮小組內差異并最大化區分組間差異^［16］.該模型的預測參數R²X和R²Y表示對X和Y的解釋率，數值越趨近于1表示分析模型越穩定可靠，Q²表示模型的預測能力，在代謝組學的數據分析中，認為Q²＞0.5時模型效果較好^［17］.由圖2中OPLS-DA得分圖可見，4種OPFRs處理組和對照組的細胞代謝數據集之間均存在顯著差異，其中TPHP和CDP處理組和對照組的組間差異顯著，RDP和TAP處理組和對照組的組間差異相對較小.由與其對應的S-plot圖可見，OPFRs處理組中的VIP值大于等于1（VIP≥1）的代謝物的含量表現出廣泛的下調，其中TPHP、CDP和RDP使得PC12細胞中的肌醇、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸和蘇氨酸等關鍵代謝物（重要代謝途徑的主要代謝物）的含量降低；TAP在使肌醇、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等關鍵代謝物的含量降低的同時，也使檸檬酸、脯氨酸和谷氨酸等關鍵代謝物的含量升高.

2.4 差異表達代謝物的篩選與分析

根據OPLS-DA模型的結果篩選組間差異表達的代謝物，通過VIP值和獨立樣本t檢驗的P值相結合進行篩選，將VIP＞1且P＞0.05的代謝物作為潛在的生物標志物進行進一步的分析.4種OPFRs的差異表達代謝物信息見表1至表4.

2.5 代謝通路分析

將篩選出的差異表達代謝物通過MetaboAnalyst5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）在線進行分析，根據路徑富集分析中的P值和路徑拓撲分析中的路徑影響值顯示出所有匹配的代謝通路.本文采用了KEGG數據庫，如圖3所示，選取主要代謝途徑，分析其潛在的作用機制.

3 討論與結論

由表1至表4可見，4種阻燃劑均使PC12細胞中的肌醇含量下降，從而對磷酸肌醇代謝途徑產生了影響.肌醇具有抗氧化功能，可以修復線粒體突變，對神經細胞有一定的保護作用^［16］.其中結構相近的TPHP、CDP和RDP均對三羧酸（TCA）循環產生了影響，表現為檸檬酸、富馬酸和蘋果酸的濃度下降.TCA循環在線粒體中發生，是連接細胞合成代謝和分解代謝間的重要橋梁^［18］.同時乙醛酸和二羧酸代謝途徑有助于能量代謝過程中的TCA循環^［19］，在本研究中這2條代謝通路間存在共同被影響的代謝物檸檬酸.SHARMA等^［20］指出TCA循環通過整合中樞代謝物的信號以調節與衰老相關的代謝功能障礙，所以推測有機磷阻燃劑可能促使細胞衰老從而影響細胞的活性和功能，然而其具體機理仍需進一步探究.

TPHP、RDP和TAP處理組與對照組相比，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路受到顯著干擾.每組中的甘氨酸和蘇氨酸的含量都有不同程度的下降.蘇氨酸是人體必需的氨基酸，通過膜轉運蛋白與甘氨酸和絲氨酸連接，同時，蘇氨酸具有促進細胞免疫防御的功能^［21］.這3種氨基酸還是合成蛋白質、核酸和脂質的必須前體^［22］.TPHP處理組影響最大的代謝途徑為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成.苯丙氨酸和色氨酸都是必需氨基酸，苯丙氨酸可以通過苯丙氨酸羥化酶轉化為酪氨酸^［23］.酪氨酸與能量代謝和免疫有關，色氨酸與多種保護功能相關，包括調節氧化應激、免疫反應和炎癥^［19］.在TAP處理組中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；谷氨酰胺、谷氨酸和谷胱甘肽代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝均受到影響.與對照組相比，TAP處理組的谷氨酸、脯氨酸和檸檬酸濃度升高.其中，谷氨酸不僅是人體內重要的氨基酸，也是哺乳動物神經系統中含量最多的神經遞質，還具有促氧化作用，過高濃度的谷氨酸通過胱氨酸-谷氨酸逆向轉運體抑制細胞對胱氨酸的攝取，導致谷胱甘肽水平降低和活性氧積累^［24］.谷胱甘肽是一種由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽，作為自由基清除劑，在細胞防御氧化攻擊中起關鍵作用^［25］.本研究中，用于合成谷胱甘肽的甘氨酸濃度降低，表明PC12細胞的氧化還原狀態不平衡.此外有研究表明精氨酸和脯氨酸代謝與多種人類疾病的炎癥密切相關，如痛風^［26］和肌萎縮側索硬化癥^［27］，所以該代謝通路的改變也應當被重視.

總之，本工作利用GC-MS代謝組學技術，分析了PC12細胞在4種OPFRs暴露下的代謝表型變化.研究共鑒定出38種小分子代謝物，通過OPLS-DA分析，分別找出了相關的差異表達代謝物，通過對這些差異表達代謝物進行生物信息學分析，發現OPFRs可以影響PC12細胞的TCA循環、磷酸肌醇代謝以及各種氨基酸代謝途徑.實驗獲得的結果有助于揭示磷系阻燃劑的神經毒性.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.07.18.0004）.

參 考 文 獻

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Research on the effects of OPFRs on the metabolism of

PC12 cells based on GC-MS

Sun Mengyao^a， Zhao Yafei^b， Wang Shaomin^b， Liu Hongmin^c

（a. School of Ecology and Environment; b. College of Chemistry; c. Collaborative Innovation Center of New Drug Research

and Safety Evaluation of Henan Province， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： This research explored the effects of four organophosphorus flame retardants（OPFRs） on the metabolism of nerve cells（PC12） bases on gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. Firstly， PC12 cells were exposed to various concentrations of four flame retardants， and the concentration that had minimal effect on cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） colorimetry. Then， the cells were cultured at this concentration， and metabolites were extracted and analyzed by using GC-MS for non-targeted metabolomics. Subsequently， SIMCA software was utilized to perform OPLS-DA analysis on the quantitative metabolic data to discover the significant metabolites impacted by OPFRs in cells. Finally， bioinformatics methods were employed to dissect the pertinent metabolic pathways linked to these key metabolites. A total of 38 small-molecule metabolites were identified in PC12 cells. Multivariate statistical analysis showed that all the four OPFRs affected the metabolic phenotype in PC12 cells. OPFRs showed significant cytotoxicity against PC12 cells at 100 μmol/L and 1 000 μmol/L concentrations. Carbohydrate metabolism and amino acid metabolism were mainly affected in cells.

Keywords： organophosphate flame retardants; metabolomics; GC-MS; PC12 cells

［責任編校 趙曉華 陳留院］