蛋白質組學在類風濕關節炎中發病機制及診療研究中的最新研究進展*

劉晨旭，郜娜

（鄭州大學 臨床藥理研究所，河南 鄭州 450001）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是最常見的免疫介導性疾病之一。其主要病理表現為滑膜炎，特征是對稱的多關節疼痛和腫脹，通常累及手和腳的小關節，存在多種并發癥和關節外表現[1-3]。流行病學調查，我國的RA患病率為0.42%，患者總數為500萬[4]。RA不僅造成患者身體機能、生活質量的下降，也給患者家庭和社會帶來巨大的經濟負擔[5-6]。由于RA的病因不明，發病機制復雜，對RA的深入研究有助于進一步理解RA的病理生理學特點，促進RA診斷和治療的發展。

蛋白質是組成人體一切細胞和組織的重要成分，是機體發揮功能的主要物質之一，在幾乎所有的病理、生理過程中都是不可或缺的。蛋白質組學是在特定時間點對生物系統（細胞、組織、器官、生物流體或生物體）中存在的整套蛋白質（蛋白質組）進行系統和定量鑒定[7]。在過去的10余年里，蛋白質組學技術分析了從RA患者中采集的不同類型的生物樣本（滑液、血漿和尿液），并取得了許多進展。本文旨在總結蛋白質組學在RA研究中的進展，并介紹RA研究中涉及的蛋白質組學方法，為進一步研究RA的發病機制、尋找新的治療靶點提供參考。

1 蛋白質組學技術的應用

1.1 傳統蛋白質組學技術

蛋白質組學主要研究蛋白質的表達、結構、功能、修飾和相互作用以及這些方面在不同環境條件下的變化。在基于質譜（mass spectrometry, MS）的蛋白質組學分析出現之前，傳統的蛋白質分離技術以離子交換層析、尺寸排阻層析和親和層析為主。對于選擇性蛋白質的分析，一般使用酶聯免疫吸附試驗和Western blotting。但是這些技術僅限于對少數蛋白質的分析，而且不能確定蛋白質表達水平[8]。

1.2 MS技術

20世紀80年代末基質輔助激光解吸電離法、電噴霧電離法的出現，使MS在蛋白質測序領域開始流行[9]，使得通過MS對蛋白質進行高通量分析成為可能。MS是目前所有蛋白質組研究的核心

目前，基于MS的蛋白質組學主要依靠自下而上的MS法進行分析，由多個不同的階段組成。首先，各種樣品制備措施確保生物樣品最適合MS分析，典型的步驟包括蛋白質的變性、還原和烷基化。接下來，通過液相色譜（liquid chromatography, LC）處理該肽的混合物并進行分離。從柱洗脫后，通過電噴霧電離處理肽以獲得電荷，并在MS儀中生成衍生光譜。最后，通過各種生物信息學手段解釋生成的光譜數據。自下而上的MS法實際上并不是對蛋白質本身進行測序，而是推斷蛋白質的一級結構或對蛋白質進行分類，因此該方法有時并不是非常敏感[9-10]。

1.3 生物信息學技術

生物信息學是運用計算機科學技術和信息技術開發新算法和數據庫信息系統，對生物學過程進行數據分析和歸納甄別，確定數據所蘊含的生物學意義并建模，開發新的數據分析工具的學科。生物信息學是一門生物學與信息學相結合的交叉學科。該領域正在不斷提出新的算法來管理大量的、不同種類的蛋白質組學數據，并在運用過程中不斷進步。各種生物信息學工具被逐步開發并用于蛋白質三維結構預測、蛋白質結構域和模體的分析、蛋白質-蛋白質相互作用的快速分析和MS的數據分析。

此外，將蛋白質組數據與其他組學數據結合，正成為生物信息學新的趨勢。例如，可以建立蛋白質組學和轉錄組學之間的逐點比較，趨勢不一致的蛋白質/基因可能表明參與了重要的轉錄和翻譯后調節機制[11-12]。蛋白質信號網絡的溯源也可以受益于其他組學數據。鑒于不同類型的組學數據通常是互補的，當從多組學角度分析時，基于MS的蛋白質組學將變得更加強大。

2 蛋白質組學在RA研究中的應用

2.1 闡明RA的發病機制

研究不同條件下蛋白質組的差異可以識別與疾病、應激反應或治療效果相關的蛋白質。目前，多位學者已經對不同類型的RA樣本進行了大量的蛋白質組學研究。BIRKELUND等[13]利用LC-MS的方法對RA患者和脊柱關節炎（Spondyloarthritis,SpA）患者的滑液進行蛋白質組分析。結果顯示，SpA和RA患者來自先天免疫系統的蛋白存在顯著差異，而這些差異主要來源于中性粒細胞，提示中性粒細胞在RA病理過程中起著獨特的重要作用。REN等[14]使用串聯MS標簽（tandem mass tag, TMT）偶聯液相色譜的方法比較RA和骨關節炎患者滑膜組織中的蛋白質組，結果顯示成纖維樣滑膜細胞中的嗅覺素4在RA關節炎癥中發揮重要作用。SHARMA等[15]應用基于MS的蛋白質組學方法，研究4名RA患者滑液纖維蛋白原中的瓜氨酸化位點。在所鑒定的23個位點中，其中位于α84、α123、α 129、α547、α573、α591、β334和γ134位的瓜氨酸化位點尚未見報道，研究這些新的瓜氨酸位點能增加對RA 免疫發病機制的理解。HU等[16]使用隨機森林模型和蛋白質互作網絡的分析方法，對蛋白質組學數據進行分析。發現在正常人和RA患者血清中ORM1存在顯著差異表達，且ORM1表達水平與疾病活動性呈正相關。ORM1在病理機制上與CD56dim自然殺傷細胞、效應型記憶CD8+T細胞和自然殺傷細胞密切相關。為理解RA的病理機制提供了新的視角。HUANG等[17]使用基于TMT的蛋白質組學對炎癥性關節炎滑液來源的外泌體進行分析，發現與中軸型脊柱關節炎、痛風和骨關節炎相比，RA中發現了28種高表達蛋白。其中包括玻連蛋白、肝素輔因子Ⅱ、纖維蛋白原β鏈、α-1抗胰蛋白酶和激肽原-1等，其與補體和凝血級聯反應密切相關，這提示補體和凝血功能與類風濕關節炎有著重要的關系。

2.2 新生物標志物

RA早期生物標志物是從血液或其他體液、組織液中發現的某種成分。其作為RA的一種發生信號，能用于健康人群的篩檢及RA患者的早期診斷和治療反應預測[18-19]。利用蛋白質組學的研究方法，尋找具有特征性的RA生物標志物，是蛋白質組學在RA研究中重要的目的。

2.2.1 診斷生物標志物 RA的發病機制復雜且受多種因素影響?，F有的診斷標準更傾向于是一種將RA其他疾病區分的分類標準，這導致現有診斷更多發生在癥狀出現后，這對于RA的治療和關節破壞的預防是非常不利的。而且現有的診斷標志物鑒別能力有限，因此有必要尋找新的診斷標志物，以盡早診斷RA[20-21]。

類風濕因子（rheumatoid factor, RF）是最早在RA患者體內發現的生物標志物，是診斷RA的標準之一[22]。但RF在正常人體內也可出現，因此診斷的特異性較差。LEE等[23]對不同RF水平的RA患者血清，進行蛋白質組學分析發掘潛在的生物標志物，并運用多反應監測（multiple reaction monitoring,MRM）驗證分析結果。在鑒定出的45個差異蛋白中，轉甲狀腺素、凝膠蛋白、血管緊張素原、脂多糖結合蛋白和蛋白S100-A9被證明在診斷類風濕關節炎中具有潛在的應用價值。通過在單個樣品中同時檢測5種蛋白，MRM可以很容易診斷出RA。MUN等[24]也同樣使用MRM技術對蛋白質組學確定的RA診斷生物標志物進行驗證，確定血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A, SAA）和維生素D結合蛋白在區分類風濕關節炎患者和健康對照中表現出較高性能。HUANG等[25]通過TMT結合LC-MS/MS對RA患者CD4+T細胞來源的外泌體進行蛋白質組學分析。結果表明，二氫嘧啶酶相關蛋白3（dihydropyrimidinase-related protein 3, DPYSL3）在RA組中顯著上調，而蛋白酶體激活劑復合物亞基1（proteasome activator complex subunit 1, PSME1）在RA組中顯著下調。這些差異表達的蛋白可能與RA的發病機制有關，DPYSL3和PSME1可能成為RA新的生物標志物。

2.2.2 預測治療效果和區分疾病活動度的生物標志物 RA患者常接受甲氨蝶呤等改善病情抗風濕藥物和生物制劑的三聯療法，但近三分之一的患者對三聯療法反應不佳[26]，這造成了巨大的浪費和治療的不確定性。因此，CHEN等[27]試圖通過蛋白質組學研究尋找可以預測三聯療法療效的生物標志物，通過對三聯療法不同響應者的血清蛋白質組進行分析，確定了附睪分泌蛋白Li282和睪丸組織蛋白Li70可作為預測三聯療法療效的生物標志物。CHEN等[28]采用同位素標記相對與絕對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）的蛋白質組學研究，對接受三聯療法14周后的有反應者和無反應者血清蛋白質組進行分析，經平行反應監測驗證后，確認應答者和無應答者體內血清轉鐵蛋白含量差異顯著，認為血清轉鐵蛋白相關分子機制可能是三聯療法是否起作用的關鍵，也可以作為研究難治性RA的關鍵靶點。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）和艾拉莫德（Iguratimod, IGU）是廣泛用于治療RA的抗風濕藥物。雖然兩者聯合可以顯著抑制RA的進展，但一些患者對治療沒有反應[29]。ZHANG等[30]利用蛋白質組學的方法對聯合治療反應良好和較差的RA患者血清蛋白進行差異分析，得到的差異蛋白通過MRM進一步驗證，其中RELN、LDHA和MRC1被證實與甲氨蝶呤和艾拉莫德聯合治療反應相關，Logistic回歸和ROC曲線分析結果表明，RELN、LDHA和MRC1有潛力成為客觀評價MTX和IGU療效的新指標。董新文等[31]采用蛋白質組學方法研究了大鼠口服甲氨蝶呤后尿蛋白的變化。鑒定出的部分差異蛋白可以體現出甲氨蝶呤對機體谷胱甘肽代謝以及對JAK/STAT信號通路的影響。

目前臨床上對RA活動期的判斷均基于患者的臨床表現，并沒有可靠有效的實驗室指標，因此有學者希望通過蛋白質組學研究發掘可以區分RA活動度的標志物。GONZáLEZ-RODRíGUEZ等[32]應用蛋白質組學策略，通過MS分析了不同活動度RA患者樣品。對篩選出的差異蛋白進行驗證后發現，載脂蛋白B、富含組氨酸的糖蛋白、血漿蛋白酶C1抑制劑、結合珠蛋白和SAA1含量在不同類型樣品中有明顯的區別，可作為區分RA活動度的候選標志物。NYS等[33]也同樣認為SAA可作為區分RA活動度的標志物。其利用靶向蛋白質組學的方法對SAA的蛋白質亞型進行分析，發現SAA1亞型（主要是SAA1α和SAA1β亞型）在不同活動度RA患者血漿中存在明顯差異。

2.3 闡明藥物的作用機制

近年來隨著MS技術的發展，蛋白質組學方法已成為檢測特定生物樣品中分子變化和相互作用的工具。因此，蛋白質組學常被用來研究和評估新型藥物和功能性食品作用。尤其是蛋白質組學結合iTRAQ的方法，現已廣泛應用于研究藥物的治療機制和治療靶點的發現[34]。

JIANG等[35]采用蛋白質組學技術對中藥黃花的乙醇提取物治療RA的機制進行了蛋白質組學研究。結果表明，PI3K-Akt信號通路是黃花治療類風濕關節炎的關鍵通路。近年來，基于間充質干細胞（Mesenchymal stem cell, MSC）療法被廣泛認為是治療RA有前途的療法[36-37]。JUNG等[38]使用LC-MS/MS對人臍帶血MSCs治療前后的RA小鼠模型進行蛋白質組分析，結果顯示MSCs在RA治療中的關鍵作用是抑制血小板激動劑的產生，使得在RA病理中起主要作用的血小板的活化可能會從初始狀態被抑制。JIA等[39]使用基于iTRAQ的定量蛋白質組學技術研究香菜緩解RA惡病質的機制，發現香菜對RA惡病質的緩解主要是因為香菜可以部分恢復RA誘導的分子紊亂，包括碳代謝受損、線粒體功能惡化（三羧酸循環和氧化磷酸化）和肌纖維類型改變。白芍是一種中草藥，目前已經被批準用于RA的治療。芍藥苷（paeoniflorin, PA）是白芍中的關鍵活性成分。YANG等[40]使用基于iTRAQ的定量蛋白質組學分析大鼠的滑膜組織，并通過Western blotting驗證了通過IPA軟件分析得到的蛋白質。結果顯示白血病抑制因子受體和Asporin蛋白對PA治療RA的貢獻最大，提示上述兩個蛋白可能是其治療RA的關鍵靶點。蔡義思等[41]提取大鼠滑膜組織蛋白質，使用4D非標記定量蛋白質組學研究當歸拈痛湯組與風濕熱痹證模型組之間的差異蛋白情況，發現當歸拈痛湯對風濕熱痹證類風濕關節炎的治療涉及多靶點，可能通過調節Akt/Bax/Bcl-2通路發揮對風濕熱痹證類風濕關節炎的防治作用。張睿等[42]為了研究甘草養陰湯聯合甲氨蝶呤對老年類風濕關節炎小鼠的干預作用和整體效應機制，采用非依賴采集蛋白組學技術分析各組小鼠的分泌表型特點。發現甲氨蝶呤聯合甘草養陰湯除了對多種炎癥因子的抑制作用，還傾向于對脂質代謝等通路靶點的調節，尤其是上調葉酸合成通路相關靶點，對甲氨蝶呤治療ERA具有減毒增效作用。

3 結論和展望

在過去的10多年間，蛋白質組學幫助從蛋白質組變化的角度研究RA，加深了對RA的了解、幫助尋找新的治療靶點、尋找新的生物標志物、預測藥物治療的反應、提供個性化的治療方案，并最終將會對RA治療產生深遠影響。此外，將蛋白質組學與其他組學（例如基因組學、轉錄組學和代謝組學）相結合的新興技術為了解表型疾病特征與風險因素之間的聯系提供了新的見解。

對單個細胞中DNA和RNA的高通量測序表明，單細胞水平的分子異質性比之前意識到的要大。為了充分捕獲功能異質性，還必須以單細胞分辨率對蛋白質組進行測序。畢竟，蛋白質是細胞的主要功能分子，RNA豐度并不直接轉化為細胞內的蛋白質豐度，而且蛋白質含有轉錄組學無法捕獲的翻譯后修飾。單細胞蛋白質組學具有幫助進一步了解細胞結構和功能的巨大潛力，是未來蛋白質組學新的發展方向