自體富血小板血漿聯合自體骨移植術治療兔橈骨骨不連實驗研究

陳植 徐芳露 陳兵乾

[摘 ? 要] ? 目的：觀察自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）聯合自體骨移植術治療兔橈骨骨不連的效果。方法：成年新西蘭兔96只，隨機分為PRP-植骨組、單純植骨組和對照組各32只。將所有實驗兔左前臂橈骨中段截除1 cm骨段，骨蠟封閉斷端髓腔，制成骨不連動物模型。PRP-植骨組采用自體髂骨植入骨折端+骨折端注射自體PRP治療，單純植骨組僅在骨折端植入自體髂骨，對照組不作處理。術后2、4、8、12周時采用大體形態觀察、X線攝片、Micro-CT檢查、組織學觀察及生物力學檢測等手段對骨不連愈合情況進行評估。結果：大體觀察、X線攝片、Micro-CT、組織學及生物力學檢測結果顯示，與單純植骨組比較，PRP-植骨組術后2、4周時軟骨細胞增生明顯增多，術后8周時已有明顯骨痂形成。PRP-植骨組術后2、4、8、12周被破壞時的最大載荷（payload-maximum，Pm）及破壞彎矩（moment，M）均高于同期單純植骨組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：自體富血小板血漿聯合骨移植術治療兔橈骨骨不連效果良好，骨愈合速度更快，骨愈合強度更高。

[關鍵詞] ? 實驗兔；骨不連；富血小板血漿；骨移植術；生物力學

[中圖分類號] ? R683.41 [文獻標志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.002

Experimental study of autologous platelet-rich plasma combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion

CHEN Zhi1， XU Fanglu2， CHEN Bingqian1

（1Department of Orthopedics， Changshu No.1 People′s Hospital， Jiangsu 215500;

2Department of Nephrology， Changshu No.2 People′s Hospital）

[Abstract] ? Objective：To observe the effect of autologous platelet-rich plasma （PRP） combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion. Methods：Ninety-six adult New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 32 rabbits in each group， which were named as PRP-bone grafting group， the simple bone grafting group and the control group. A 1 cm bone segment was excised from the middle radium of the left forearm of all the rabbits in the three groups. The medullary cavity of the broken end was closed with bone wax. The rabbits in PRP-bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting and injection of autologous PRP at the fracture end， the rabbits in the simple bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting at the fracture end and the rabbits in the control group were not treated. At 2， 4， 8 and 12 weeks after operation， gross morphological observation， X-ray， Micro-CT， histological analysis， and biomechanical test were used to evaluate the healing of bone nonunion. Results：The results of gross observation， X-ray film， Micro-CT， histology and mechanical examination showed that the proliferation of chondrocytes in PRP-bone grafting group was significantly higher than that in the simple bone grafting group at 2 and 4 weeks after operation， and callus formation was obvious at 8 weeks after operation. The payload-maximum （Pm） and failure moment （M） in PRP-bone grafting group were higher than those in the simple bone grafting group at 2， 4， 8 and 12 weeks after operation（P<0.05）. Conclusion： The effect of autologous PRP combined with bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion is good， and the bone heals faster and stronger.

[Key words] ? experimental rabbits; nonunion of bone;platelet-rich plasma; bone grafting; biomechanics

骨不連又稱骨折不愈合，是骨折后常見的并發癥，5%以上骨折患者術后出現骨不連[1]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）治療是近年來興起的新型組織修復技術，PRP中富含大量生長因子，可促進人體各種組織的再生，目前廣泛用于慢性肌肉骨骼損傷、創面及軟組織修復、關節疼痛、運動醫學等領域。血小板可釋放多種生長因子，激活間充質細胞，觸發血管生成，促進成骨細胞和軟骨細胞的增殖和趨化，在骨缺損治療中具有促進骨愈合作用[2-3]。本研究構建兔橈骨骨不連動物模型，評估PRP聯合自體骨移植術治療骨不連的效果。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 實驗動物 ? 清潔級成年新西蘭雄性大白兔96只［蘇州湖橋生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（蘇）2020-0002］，兔齡6～7月，體質量2.5～3.0 kg，按數字隨機法分為PRP-植骨組、單純植骨組和對照組各32只。單籠飼養，室溫20 ℃、濕度65%，飲水量每日100 mL/kg，飼料主要為高質量植物蛋白和優質脫水苜宿草（江蘇美迪森生物醫藥有限公司），每日50 g/kg，每日分2次投喂。投喂7日后，在蘇州藥明康德新藥開發有限公司［實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0046］進行實驗，在無菌條件下制備兔橈骨骨不連模型。

1.2 ? 實驗方法

1.2.1 ? 制備骨不連動物模型：采用10%水合氯醛經兔耳緣靜脈麻醉，劑量2 mL/kg，兔左前臂備皮，安爾碘消毒術區，鋪無菌巾單。取左前臂中段縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織，暴露左橈骨中段，用小型骨刀截除1 cm骨段，骨蠟封閉斷端髓腔，縫合切口。實驗兔蘇醒后按前述飼養方式繼續飼養，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，連續1周。術后12周對所有實驗兔左前臂攝X線片，確認骨不連模型制備成功。

1.2.2 ? 自體PRP制備：采用Landesberg法，從實驗兔耳緣靜脈抽取靜脈血10 mL，注入含抗凝劑試管內，200 g離心10 min，得到3層液體，頂層為血小板血漿層，中間層為血小板濃縮物層，底層為紅細胞層。吸取全部頂層及交界面下3 mm液體，注入另1支不含抗凝劑試管中，200 g離心10 min，再次得到分為3層的液體，吸除3/4上清液，將剩余液體打勻，即得到約0.8 mL PRP。

1.2.3 ? 手術方法：PRP-植骨組：實驗兔麻醉后，常規備皮、消毒鋪巾。在兔髂骨處作一小切口，鑿取少量松質骨備用。于左前臂沿原切口切開皮膚，暴露橈骨骨不連處，去除斷端硬化組織，打通髓腔。將自體松質骨植于骨不連處，并將自體PRP填充于植骨處，逐層縫合切口。單純植骨組：手術步驟同PRP-植骨組，僅將自體松質骨植于骨不連處。對照組：不作處理。麻醉蘇醒后按照前述飼養方式繼續飼養，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，連續1周。

1.3 ? 觀察指標 ? 在術后2周、4周、8周、12周時每組分別處死8只實驗兔，切取左側橈骨完整骨段，作以下指標觀察。（1）大體形態觀察。（2）X線攝片檢查：觀察骨不連修復情況。（3）Micro-CT檢查：觀察骨不連修復情況。（4）組織學觀察：橈骨骨段經脫鈣、脫水、固定、透明后，用石蠟包埋，切片后行HE染色，在光學顯微鏡下觀察新骨生成情況。（5）生物力學檢測：采用拉扭雙軸動靜態萬能材料力學試驗機對骨段進行4點彎曲測試，測定被破壞時的最大載荷（payload-maximum，Pm）和破壞彎矩（moment，M）。

1.4 ? 統計學處理 ? 應用SPSS 24.0統計學軟件進行數據處理分析。計量資料以■±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 ? 結 ? ? ?果

2.1 ? 大體形態觀察 ? 術后2周：PRP-植骨組、單純植骨組植入骨與自體骨交界面出現肉芽組織橋接。術后4周：PRP-植骨組、單純植骨組缺損位置可見淡紅色硬纖維，植入骨和自體骨之間可見模糊接線，連接不牢固，植入骨表面出現纖維骨痂，PRP-植骨組植入骨表面纖維骨痂多于單純植骨組。術后8周：PRP-植骨組骨痂呈膨脹性生長，植入骨表面腔隙充填，植入骨和自體骨結合牢固。單純植骨組骨痂連續，植入骨和自體骨界限模糊，結合不夠牢固，刀片可分離。術后12周：PPR-植骨組缺損處骨組織覆蓋完全，愈合良好，呈現骨性愈合。單純植骨組植入骨表面出現連續堅硬的骨痂，植入骨和自體骨結合較為牢固。對照組骨缺損位置出現疤痕纖維結締組織充填，截骨端骨折硬化。

2.2 ? X線攝片檢查 ? 術后2周：PPR-植骨組出現少量類骨痂樣物質，單純植骨組與對照組中骨缺損間隙明顯。見圖1。術后4周：PPR-植骨組正常骨質與植骨處間隙變小，間隙內可見骨痂。單純植骨組中間隙仍明顯可見。對照組間隙清晰。見圖2。術后8周：PPR-植骨組中正常骨質與植骨處附著緊密，間隙位置出現新生類骨組織。單純植骨組正常骨質與植骨處出現細小間隙，骨痂充填間隙。見圖3。術后12周：PPR-植骨組缺損位置成熟板層狀骨組織充填，可見正常骨質，骨缺損位置基本修復。單純植骨組中正常骨質與植骨處附著緊密，新生類骨組織充填間隙。對照組僅少量骨痂形成，骨折斷端清晰可見，邊緣硬化。見圖4。

2.3 ? Micro-CT檢查 ? 術后2周：PRP-植骨組和單純植骨組植入骨與自體骨交接位置清晰，斷端整齊，斷端及缺損處骨密度均較對照組高。術后4周：PRP-植骨組缺損位置形成骨痂，植入骨出現少量吸收。單純植骨組缺損位置出現少量骨痂。術后8周：PRP-植骨組缺損位置骨痂大量形成，覆蓋植入骨，兩斷端被骨痂橋接，植入骨密度增加，缺損位置分區模糊，植入骨吸收明顯，骨髓腔部分出現再通。單純植骨組缺損位置骨痂形成增多，覆蓋大部分植入骨，兩端間隙略微模糊，植入骨兩端密度增加，部分植入骨吸收。術后12周：PRP-植骨組缺損處皮質骨新生改造基本完成，新生骨密度接近正常骨，植入骨基本吸收，植入骨與自體骨連接自然，骨髓腔基本再通。單純植骨組缺損處骨痂大量形成，覆蓋植入骨，植入骨大部分吸收，皮質骨基本連續，骨髓腔部分再通。對照組未形成連續型骨痂，缺損處呈現骨折硬化，骨折清晰，呈萎縮型骨不連表現。

2.4 ? 組織學觀察 ? 術后2周：PRP-植骨組植入骨孔隙出現少量軟骨細胞和成骨細胞，單純植骨組變化不明顯。術后4周：PRP-植骨組植入骨孔隙出現大量軟骨細胞和成骨細胞，并在植入骨邊緣見軟骨細胞和成骨細胞，新生骨痂呈條索狀，覆蓋在植入骨，缺損兩端成骨細胞更多，形成原始骨髓腔，載體骨內發現毛細血管新生。單純植骨組植入骨孔隙出現少量軟骨細胞和成骨細胞。術后8周：PRP-植骨組植入骨孔隙新生骨組織增加，可見破骨細胞，新生骨取代部分植入骨，見骨髓組織，新生骨痂（外周）成片狀，植入骨表面骨痂覆蓋面積大。單純植骨組植入骨孔隙出現大量軟骨細胞和成骨細胞，在植入骨邊緣也可見成骨細胞等。術后12周：PPR-植骨組植入骨成熟骨組織量大，植入骨大部分被吸收，骨髓組織增加，新骨、自體骨間可見骨小梁成熟。單純植骨組植入骨孔隙新生骨組織增加，破骨細胞可見，出現新生骨，新生骨痂（外周）成片狀，覆蓋面積擴大。對照組缺損位置被大量纖維結締組織填充，骨斷端髓腔封閉，未見新骨生成。

2.5 ? 生物力學檢測 ? 術后2、4、8、12周Pm及M，PRP-植骨組＞單純植骨組＞對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 ? 討 ? ? ?論

長骨骨折術后骨不連發生率非常高，5%～10%[4]。自上世紀60年代AO組織提出解剖復位、堅強內固定及早期功能鍛煉的骨折治療原則以來，許多復雜骨折收到良好的治療效果，但時有骨不連的發生。骨折復位固定不牢靠、術后活動和負重不當可造成骨不連。骨不連的病理改變包括骨端的吸收硬化、骨質疏松、骨與軟組織萎縮，并伴有關節僵硬。臨床上可以通過X線片、CT檢查等觀察骨缺損病灶具體情況，骨不連表現為骨折端互相分離，骨端硬化，間隙較大，萎縮疏松，髓腔封閉等征象。骨不連不僅延長患者患病時間、延遲功能恢復，同時也會對患者心理產生不良影響。因此，一旦確診骨不連，應立即采取相應方法治療。

手術治療是目前公認的治療骨不連最有效方法，包括內固定、外固定、骨移植以及各種方法的聯合應用。自體松質骨移植術是治療骨不連的“金標準”，但單純采用植骨治療術后恢復時間長，因此有學者提出可將骨移植術與PRP技術聯合運用。自體PRP含有豐富的生長因子和高濃度血小板[5]，血小板活化后釋放轉化生長因子β、胰島素樣生長因子、血管內皮生長因子以及表皮生長因子等多種生長因子，促進軟骨組織和骨組織修復，加速骨不連患者骨組織修復。PRP制備方法較多，根據全血中各組分沉降系數不同，不同離心次數、離心力和離心時間所制備的PRP中血小板體積分數以及各種生長因子的量和活性各不相同。目前國際上尚無統一的標準化PRP提取方法。在諸多制備方法中Landesberg法具有血小板體積分數高、活化率低的優點，故本研究采用Landesberg法。本研究大體觀察、X線攝片及Micro-CT檢查發現，PRP-植骨組術后各時期骨痂形成速度、形成量均優于單純植骨組，骨不連愈合速度明顯較單純植骨組更快，術后2、4、8、12周被破壞時的最大載荷及破壞彎矩均高于同時間單純植骨組和對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。分析原因：PRP血小板經活化后釋放的各種生長因子可以加速基質干細胞分化，促進成骨細胞和成纖維細胞的增殖，加快纖維蛋白與細胞外基質的合成[6-7]。PRP中含有高濃度白細胞，在控制感染方面具有積極意義。由于PRP源于自體，無免疫排斥，治療安全性較高。

綜上所述，在兔橈骨骨不連的治療中，在常規植骨基礎上配合自體PRP治療，可達到加速骨缺損修復，促進骨愈合的效果，為臨床上PRP聯合骨移植術治療四肢長骨骨不連提供一定的證據支持。

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[收稿日期] 2023-08-04

（本文編輯 ? 王曉蘊）