基于高通量測序的北柴胡根轉錄組SSR位點信息分析

王彬彬 高妍夏 郭欣慰 紀宏亮 王敬 王暉

摘 要 以北柴胡根為試材，采用高通量轉錄組測序方法，獲得uingene序列信息，研究分析SSR分布、基元特征，設計、驗證EST-SSR引物的有效性，為開發、豐富EST-SSR分子標記奠定基礎。結果表明：從北柴胡根轉錄組中共篩選到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes，出現的頻率為20.08%，分布密度為3.20個/10 kb，主要重復基元類型以二核苷酸最為豐富，共21 056個，占SSR位點總數的67.54%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的19.05%和12.07%；四核苷酸～六核苷酸重復基元數量均較少。不同核苷酸基序類型共有131種基元，重復基元次數在5～11次的數量最多，占SSR總數的91.7%，且長度基本小于15 bp，其中AT/AT和AC/GT這兩種基元在二核苷酸中出現頻率最高。2 064條和1 004條含有SSR位點的unigenes分別注釋到GO和KEGG通路，獲得注釋的基因功能主要與基礎代謝相關。從 22 090對具有潛在多態性的EST-SSR引物中，隨機挑選20對引物對3個北柴胡種質DNA進行PCR擴增，擴增成功率最高達85%。北柴胡根轉錄組SSR位點豐富、可用性較強，將促進柴胡的種質資源評價及分子標記輔助育種等? 工作。

關鍵詞 北柴胡；根；轉錄組；SSR；位點信息

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）屬于傘形科柴胡屬多年生草本植物。目前全世界分布的柴胡屬植物有200余種，中國有42種、17變種、7變型，占全世界種類的1/5以上［1］。柴胡以根部入藥，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效，用于治療感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等癥狀［2］。近幾年，由于無序性采挖及生態環境破壞，野生柴胡已不能滿足市場需求，栽培柴胡已成為最主要的市場供應來源。由于栽培柴胡種質混雜、異地調種、種植地域廣，造成其種源混亂、藥材質量參差不齊［3-5］，迫切需要對柴胡不同種質進行區分和鑒別，建立統一質量標準，消除柴胡臨床用藥帶來的安全隱患。目前關于柴胡藥材化學成分［6-7］、藥理藥效［8-9］等方面的研究較多，柴胡種質資源遺傳多樣性評價、分子標記輔助育種的研究則較少。

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）? 標記是一類長度一般不超過200 bp、由? 1～6個核苷酸為重復單位組成的一類短串聯重復序列，因其具有多態性高、共顯性和重復性好以及屬間和屬內種間保守性的特點，使其成為目前常用的分子標記之一［10］。目前，SSR標記已應用在多種藥用植物如黃地老虎 ［11］、多花黃精［12］、半夏［13］、黃連［14］、杜仲［15］等的遺傳多樣性研究。雖然在柴胡屬植物中已開發出一些SSR標記［16-20］，但目前可利用的SSR標記仍較少，不能滿足當前在柴胡屬植物間進行親緣關系及遺傳多樣性分析等方面的需要。

本研究以北柴胡根為材料進行高通量轉錄組測序，基于測序數據，挖掘SSR位點并分析其分布及組成特征，同時將含有SSR位點的基因在GO、KEGG數據庫進行功能注釋，為柴胡遺傳多樣性分析、優良種質篩選以及品種選育等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

試驗于2021年8月至12月進行，供試材料為北柴胡品種‘ZC2，將種子用清水反復淘洗，除去雜質及未成熟種子，蒸餾水浸泡12 h后撈出備用。將營養土撒在32孔穴盤中，壓實澆透水，每孔放入10粒種子，覆土約1 mm，蓋上透明蓋，置于人工氣候箱（溫度：25 ℃，光照度為5 000 lx，晝16 h/夜8? h），每3 d噴水1次，種子出苗后，每孔只留1株幼苗，待其進入5葉期時，進行低溫? （4 ℃）處理，在處理0 d、1 d、3 d后分別收集根部，每5株隨機混合為一個生物學重復，每個時間點收集3個生物學重復，蒸餾水清洗根部后用錫箔紙包裹，迅速投入液氮速凍并保存于-80 ℃，備用。

從北柴胡‘ZC2植株采集健康、無病蟲害葉片1～2片；從中國醫學院科學院藥用植物研究所試驗地采集陜西種質（簡稱S′X，下同）、山西種質（簡稱SX，下同）北柴胡植株的健康、無病蟲害葉片1～2片，上述材料均保存于-20 ℃。

1.2 轉錄組測序

將‘ZC2根部樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000測序儀（illumina，USA）進行轉錄組測序等工作。

1.3 SSR位點篩選

將組裝得到的unigene作為參考序列，使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）軟件搜索SSR位點，軟件參數設置：單、二、三、四、五、六核苷酸SSR最少重復次數依次為10、6、5、5、5、5；獲得SSR類型、出現頻率、分布平均距離等信息。

1.4 含SSR位點的unigene 功能分析

將unigene進行功能注釋和富集分類分析；注釋數據庫選擇KEGG （https：//www.genome.jp/kegg）和GO （http：//geneontology.org），對比參數為 e＜1×10-10。

1.5 SSR引物設計與PCR擴增

使用Primer 3.0軟件設計引物，隨機挑選20對，由北京文達通科科技有限公司合成。使用通用基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2100）提取3種北柴胡種質（ZC2、S′X、SX）葉片DNA。PCR擴增體系：1 μL 50 ng·μL-1 DNA模板，10 μL 2×Taq Master Mix，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 延伸30 s，35個循環；最后72 ℃延伸? 5 min。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.6 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計、分析并制表，使用Origin 2022b軟件的對應作圖模塊繪制三維柱狀圖、二維餅狀圖、雙Y軸圖等。

2 結果與分析

2.1 北柴胡根轉錄組SSR位點數量和分布

北柴胡根部轉錄組測序組裝得到108 247條unigenes，序列總長為97 514 625? bp。共檢測到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes，平均每3 128 bp出現1個SSR，分布密度為3.20個/10 kb，SSR位點出現的頻率為20.08%，其中有6 500條unigenes含有1個以上的SSR位點，含復合型 SSR 序列數為3 804個（表1）。SSR位點的分布特征表明，根轉錄組SSR位點較為豐富，其主要重復基元類型以二核苷酸為主，占SSR位點總數的67.54%，出現頻率為19.45%；其次是單核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR數的19.05%和12.07%，出現頻率依次為5.49%和3.48%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基元類型數量較少，分別占總SSR數的0.89%、? 0.14%和 0.31%。不同類型SSR的平均距離則與出現頻率相反，二核苷酸類型平均距離最小，相距4.63 kb；五核苷酸類型平均距離最大，相距? 2 267.78 kb（表2）。

2.2 北柴胡根轉錄組SSR基序重復類型和頻率特征

北柴胡根轉錄組不同類型SSR重復次數出現的頻率差異較大，隨著各基元重復次數的增加SSR 位點數量逐漸降低（表3；圖1）。SSR位點重復基元次數在5～11次的數量最多，占SSR總數的91.7%，其中，重復次數6次的SSR位點數（6 171個）最多，占總數的19.79%；其次是重復次數為10次（5 314個），占SSR總數的17.05%。單核苷酸重復次數均大于10次，所占比例為? 19.05%，其中重復次數10～14次的頻率較高；二核苷酸重復次數的變化范圍均大于6次，所占比例為67.54%，其中重復次數6～12次的頻率較高；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數的變化范圍均大于4次，占SSR總數的比例分別為12.07%、0.89%、0.14%和0.31%，其中三核苷酸重復次數5～10次的頻率最高，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數較少，重復次數5～7次的頻率均最高。

2.3 北柴胡根轉錄組SSR位點基序類型分析

北柴胡根轉錄組SSR位點中共有131種基元，每種核苷酸含有多種基序類型（表4，圖2）。單核苷酸基序類型以A/T為主，有5 799個，占SSR總數的18.60%，基序C/G出現頻率很低；二核苷酸基序類型有4種，以AT/AT為主，有? 12 517個，占SSR總數的40.15%，占二核苷酸基序類型的59.40%，其次為AC/GT（6 339個）、AG/CT（2 141個）和CG/CG（59個），分別占SSR總數的20.33%、6.87%和0.19%。三核苷酸基序類型有10種，以ATC/ATG（686個）為主，占SSR總數的2.20%。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸基序的重復類型比較多，依次有26、30和59種，但其重復基元的個數在總數中所占比例較小，以ACAT/ATGT、AAAAT/ATTTT、ACTGGC/AGTGCC為主，分別占SSR總數的0.36%、0.01%和0.02%。

2.4 北柴胡根轉錄組SSR的可用性評價

研究表明，SSR位點的基序長度≥20 bp 時，其多態性較高；長度為12～19 bp時，SSR多態性明顯下降；長度<12 bp時，其多態性極低［20］。北柴胡根轉錄組SSR基序長度分布范圍在10～360 bp，其中，基序長度在10～11 bp的低多態性SSR位點有3 223個，占11.77%；長度在12～19 bp之間的中度多態性SSR位點有14 632個，占? 53.45%；長度≥20 bp的高度多態性SSR位點有? 9 518個，占34.77%，說明可以從該轉錄組中開發出具有高度多態性的SSR引物；當基序長度≥12 bp時，SSR分布頻率隨著基序長度的增加呈現下降趨勢（圖3）。

2.5 北柴胡根轉錄組含有SSR位點的unigene的功能注釋

將含有SSR位點的21 732條序列在GO、KEGG數據庫進行比對和功能預測，分別有2 064和1 004條unigenes注釋到GO、KEGG數據庫。

GO功能注釋結果表明，含SSR的unigenes被注釋到44個功能組，分布于分子功能、細胞組分和生化過程3個類別（圖4）。在分子功能類別中，789條unigenes得到注釋，注釋結果主要包括序列特異性DNA結合，泛素-蛋白轉移酶活性，蛋白質二聚化活性。在細胞成分類別中，558條unigenes得到注釋，注釋結果主要包括核仁和后期促成熟復合物。在生化過程類別中，717條unigenes得到注釋，注釋結果主要包括蛋白質泛素化和DNA復制啟動。

KEGG代謝通路分析中，含SSR的unigenes被注釋到17個代謝通路，其中168條unigenes注釋到了植物激素信號轉導通路，此通路注釋到的基因最多，占16.73%；其次是mRNA監控通路、植物MAPK信號通路和NOD樣受體信號通路，分別有103條（10.26%）、97條（9.66%）和93條（9.26%）。

2.6 EST-SSR引物的設計及驗證

22 090條unigenes設計得到66 270對EST-SSR特異性引物，從中隨機篩選出20對不同SSR重復類型的引物用于引物的通用性和多態性評價（表5）。隨機挑選的20對引物在S′X、ZC2和SX中依次有14、15和17對擴增成功，擴增成功率分別為70%、75%和85%，其中13對引物在3個樣品中均擴增成功，3對引物均沒有擴增成功，其余4對引物呈現一定的多態性（圖6），初步表明上述SSR引物可靠性較好，且在3種北柴胡種質之間通用。

3 結論與討論

通過北柴胡根部轉錄組測序獲得108 247條unigenes，MISA軟件共檢測到31 176個SSR位點，分布于21 732條unigenes上，平均每3.13 kb出現1個SSR，即平均分布距離為3.13 kb，SSR位點出現的頻率為20.08%，表明北柴胡轉錄組中SSR數量較為豐富。柴胡種間相比，SSR的出現頻率會有所差異，柴胡種子轉錄組測序獲得的244 194條unigenes中共鑒定出29 898個SSR位點，SSR的出現頻率為12.24%，平均分布距離為6.46 kb［19］，這種差異可能與取材器官部位、建庫軟件等因素不同有關。與其他藥用植物相比，北柴胡轉錄組SSR出現頻率高于黃精? （9.73%）［12］、野三七（6.99%）［21］、金釵石斛? （12.90%）［22］，低于蒙古黃芪（31.26%）［23］、黃秦艽（30.73%）［24］、萬壽菊（28.29）［25］等。SSR 出現的平均距離低于杜仲（1.75 kb）［15］、苦蕎（3.04 kb）［26］、萬壽菊（2.51 kb）［25］，高于膜莢黃芪（7.97 kb）［27］、太子參（14.7 kb）［28］、云黃連（9.48 kb）［14］。由此可見，不同物種轉錄組SSR位點存在明顯差異，這可能與物種自身有關，還可能與轉錄組中unigene數量和長度、SSR篩選條件等有關［29］。

SSR重復基元類型是轉錄組的重要特征之一。研究表明，多數植物SSR位點的重復類型主要以二核苷酸和三核苷酸為主，但不同物種中重復基元類型及所占的比例會有所差異［10］。本研究中，北柴胡根部轉錄組SSR以二核苷酸重復為主，占SSR總數的67.54%，其次是單核苷酸? （19.05%）和三核苷酸（12.07%）類型，其中二核苷酸重復基元以AT/AT（12 517個）為主，占SSR總數的40.15%；三核苷酸以ATC/ATG（686個）為主，占SSR總數的2.20%，這與三島柴胡全基因組、北柴胡種子轉錄組數據分析得到的結果相一致［17，19］，即SSR位點均以二核苷酸重復為主。在不同物種中，多花黃精（53.14%）［12］、野三七? （52.52%）［21］以二核苷酸重復為主，與本研究結果相一致；而人參果（58.78%）［30］、蒙古黃芪（31.26%）［23］以單核苷酸為主；裸花紫珠［31］以單核苷酸和二核苷酸為主；蘇丹草［32］、黃地老虎［11］以單核苷酸和三核苷酸為主，藍玉簪龍膽（54.7%）［33］、亞麻（60.1%）［34］以三核苷酸為主；半夏［13］、蒙藥冷蒿［35］以二核苷酸和三核苷酸為主，上述研究結果表明，SSR位點的重復基元類型在不同物種間的分布有較大差異。此外，北柴胡轉錄組SSR位點中，長度在20 bp 以上的有9518個，占 SSR總數的34.77%，這部分多態性能比較高的 SSR 可能具有較高的應用價值。本研究隨機挑選的20對引物，在3種北柴胡種質中擴增成功率為70% ～85%，有13對引物在3個樣品中擴增產物長度與預期相符，4對引物呈現一定的多態性，說明開發的北柴胡基因組SSR引物具有較強的可用性。

本研究從北柴胡根轉錄組數據中挖掘到大量的SSR位點，并對其基元特征、分布、出現頻率等進行分析，并進行了初步的可用性驗證；不僅豐富了柴胡種質鑒定的SSR位點，同時可以為柴胡遺傳多樣性分析、分子標記開發及分子輔助育種提供一定理論參考。

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SSR Loci Analysis Using High-throughput Transcriptome Sequencing in Roots of? Bupleurum chinense

Abstract This study aimed to investigate the distribution and motif characteristic of SSR loci of unigenes in Bupleurum chinense DC by using high-throughput RNA-seq technology.Furthermore，EST-SSR primers were designed and the validity of these primers was evaluated to provide a foundation for enriching and developing? valuable molecular markers.The results indicated that a total of 31 176 SSR loci were? identified from 21 732? unigenes，with an SSR? occurrence frequency of 20.08% and an SSR density of 3.20 SSRs per 10 kb.As the predominant repeat type，di-nucleotide repeats accounted for?? 67.54% （21 056） of the? SSR loci，followed by the mono-nucleotide? and tri-nucleotide types，accounting for 19.05% and 12.07%，respectively.Tetra-nucleotide，penta-nucleotide and hexa-nucleotide repeat types had a lower proportion.One hundred and thirty-one repeat motifs were detected in? the transcriptome data.Most of the SSR repeat number （91.7%）ranged from 5 to 11，and the length was less than 15 bp.Among the di-nucleotide motif types，the AT/AT and AC/GT motifs were the most abundant-type.Moreover，2 064 and 1 004 SSR-containing unigenes were functionally annotated by using Gene Ontology and KEGG pathways，respectively.Furthermore，those unigenes were involved inbasal metabolism.Furthermore，20 pairs of primers were designed and evaluated for PCR amplification ofthree B.chinense DC.Germplasms，with an amplification success rate of 85%.Overall，these results suggest that SSR loci are abundant and versatile in B.chinense DC，and can be utilized to accelerate the process of germplasm evaluation and molecular marker-assisted breeding.

Key words Bupleurum chinense; Root; Transcriptome; SSR; Loci information