鏈格孢菌DT-XRKA菌株的除草活性及對作物的安全性

程海洋 程亮 朱海霞 李娟 魏有海 郭青云

摘 要 從青海省大通縣達隆村農田采集自然感病的植物葉片并分離出真菌菌株，以密花香薷為靶標草，通過離體葉片和溫室盆栽試驗以及作物安全性評價，篩選獲得1株具有較好除草活性的生防菌DT-XRKA。結果表明，離體葉片接種DT-XRKA 7 d后，密花香薷葉片上出現產3～4倍于菌餅大小的灰褐色病斑，病斑面積達到了整個葉片的50%以上，在接種處可見大量灰褐色的菌絲，中心黑色，邊緣褐色，且葉片開始逐漸失綠變黃，病級達到5級。不同濃度（1.47×101～1.47×104個/mL）的DT-XRKA孢子懸浮液對密花香薷的發病率達到67.84%～96.42%，病情指數為51.11～97.97，鮮質量防效達到52.44%～82.67%。作物安全性評價結果表明，DT-XRKA菌株孢子懸浮液對油菜、白菜、番茄、黃瓜和辣椒安全。經形態學特征和rDNA-ITS序列分析將DT-XRKA鑒定為鏈格孢Alternaria alternata。

關鍵詞 雜草；除草活性；作物安全性；生物防治

密花香薷（Elsholtzia densa Benth.）為唇形科香薷屬1 a生草本植物，別名咳嗽草、野紫蘇、萼果香薷等，是中國重要的蜜源植物和藥用植物，也是提取香精的主要材料之一[1-2]。主要分布于甘肅、青海、西藏及新疆等地，同時也是麥類作物田和油菜田的主要惡性雜草之一[3]。密花香薷的防除多依靠化學除草劑，但長期、大量使用化學除草劑，致使農田雜草的抗藥性水平迅速提高，已對國內農田雜草防控和糧食安全造成嚴重威脅[4]?；谌颦h境意識和人類健康要求，開發高效，低毒，無污染的新型除草劑，已成為目前的主要任務和重中之重。近年來，微生物除草劑因具有對環境污染小，資源豐富等優點[5]，被人們廣泛關注，且已經取得了一定成果。

鏈格孢（Alternaria alternata）可防除的雜草范圍較廣，Siddiqui等[6]將含有107個/mL的? A.alternata分別噴施于2～3葉期和4～5葉期的藜（Chenopodium album），可使藜的生物量顯著降低90%。王禹博[7]將孢子濃度為2.0×106? 個/mL的A. alternata SC-018噴施于1～2葉期的野慈姑（Sagittaria trifolia），能造成90%以上的野慈姑死亡。Bohra等[8]將107和108? 個/mL的A. alternata噴施在10～30 d葉齡的假海馬齒（Trianthema portulacastrum）其植株的死亡率達到100%。Abbasi等[9]將含有104～105? 個/mL的A. alternata接種于苜蓿（Medicago sativa）幼苗 5 d后，葉片和莖部出現壞死斑，最終導致植株死亡。Kaspary等[10] 將含有106個/mL的A. alternata接種于皺葉酸模（Rumex crispus），葉片出現嚴重淺棕色斑點，最終變成不規則的深棕色病變。Mira等[11]將1×106個/mL的A. thunbergiae接種于4～6葉期的翼葉山牽牛（Thunbergia alata）幼苗8 d后，葉片表現出深褐色病斑，并形成大面積壞死區。Mohammad[12] 將105個/mL的A. alternata孢子懸浮液接種于? 2～3葉期的稗草（Echinochloa crusgalli）幼苗，48 h后葉片出現長條形褐色病斑，并對稗草種子萌發具有較強的抑制作用。Bozoglu等[13]將? 1×104個/mL的A. crassa分離株EUCC-22081的孢子懸浮液接種于曼陀羅（Datura stramonium）幼苗，15 d后40%的植株死亡。另外，鏈格孢產生的次生代謝產物利用方面，A. alternata產生的毒素細交鏈孢菌酮酸在對惡性雜草馬纓丹（Lantana camara）具有較強的生物殺草活性[14]。Meena等[15]報道將鏈格孢菌株次生代謝產物用于防除銀膠菊（Parthenium hysterophorus），在全濃度培養濾液處理下，對其種子萌發、幼苗根長和莖長的抑制率達到27%、51%和45%。Tang等[16]報道將來自Alternaria sp.的毒素Alternariol和Altenuisol在對反枝莧（Amaranthus retroflexus）研究中，當濃度達到1 000 μg/mL時，使其根長減少68.1%和51.0%。

目前，利用鏈格孢菌對密花香薷的除草研究報道較少。僅有朱海霞等[17]初步研制Alternaria tenuissima HZ-1可濕性粉劑，對密花香薷等其他闊葉雜草的除草作用進行了研究。然而，本研究以密花香薷為研究對象，評價Alternaria alternata DT-XRKA菌株的除草活性及對作物的安全性，旨在為微生物除草劑開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

病樣采集：2021年7月從青海省大通縣達隆村采集自然感病的瓜葉葵（Helianthus cucumerifo）植株葉片，將不同病部組織葉片分類裝于? 無菌自封袋中，編號后置于冰箱以4 ℃保存，? 備用。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

雜草和作物種子：密花香薷種子采集于試驗地成熟密花香薷植株上。作物種子購買于西寧佳農種子有限責任公司。

試劑：3%次氯酸鈉、75%乙醇和吐溫-80。

1.2 病原菌的分離純化

參照方中達[18]的方法。從植物葉片的病健交界處切取5 mm×5 mm的小塊組織，依次在75%乙醇中和2%次氯酸鈉水溶液中浸30 s，滅菌水沖洗3次，于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養3～5 d，從菌落邊緣挑取少量菌絲再次純化后保存于PDA試管斜面中，備用。

1.3 孢子懸浮液的制備

取PDA上培養7 d的菌株，用移液槍吸取? 5 mL的無菌水轉移至培養基平板上，然后用滅菌接種鏟刮取平板菌落于無菌離心管中，并向離心管中補加無菌水至10 mL，擰緊管蓋，搖晃混勻，在振蕩器中充分振蕩，確認孢子均勻無明顯分層。然后用紗布過濾，制成孢子懸浮液，并用血球計數板計數。

1.4 離體葉片致病性測試

采集新鮮無病蟲密花香薷雜草葉片，用于離體葉片致病性測試。葉片經75%乙醇消毒處理并晾干后正面向上置于墊有2層無菌濾紙的培養皿中（d＝9 cm），加無菌水1.5 mL濕潤濾紙，將d=8 mm的菌餅菌絲生長旺盛的一側緊貼葉片正面，以接無菌的PDA培養基塊為對照，每處理重復3次。置于25 ℃光照培養箱中保濕培養，接種7 d后調查葉片發病情況。參照文獻[19]按如下標準記載發病情況：1級，無病或者幾乎無??；? 2級，葉片上出現少量的病斑（病斑面積少于總葉面積的1/3）；3級，病斑面積占總葉面積的1/3～? 1/2；4級，病斑面積占總葉面積的1/2～2/3；? 5級，葉片幾乎全部發病。

1.5 溫室盆栽試驗測試

密花香薷種子用1%的 NaClO消毒3 min，無菌水沖洗3次，25 ℃催芽至露白，播種于營養缽中，每盆30株，出苗后保留20株。待密花香薷幼苗長出 4～6片真葉后，噴霧接種各真菌菌株孢子懸浮液（濃度為104個/mL，含0.5 mL吐溫-80），接種量為30 mL/盆。以清水加0.5 mL吐? 溫-80作為對照。每處理重復3次。接種后幼苗置于溫度（25±1） ℃，RH（60±10）%，光周期L/D=16 h/8 h環境下，常規方式管理。于接種后7 d觀察發病情況，計算發病率、病情指數和鮮質量防效。參照文獻[19]進行病情分級。1級，無病或者幾乎沒有??；2級，葉片上有零星的斑點；3級，1/4以上的葉片出現病斑，植株生長受到抑制；4級，2/3以上的葉片出現病斑，植株生長受到嚴重抑制；5級，3/4以上的葉片出現病斑，植株將近死亡或死亡。

發病率=發病植株數/調查植株總數×100%

病情指數=Σ（病級株數×對應級數）/（調查總株數×最高級值）×100

鮮質量防效=（對照組鮮質量-處理組鮮質量）/對照組鮮質量×100%

1.6 不同濃度的菌株DT-XRKA孢子懸浮液對密花香薷的致病性測定

利用“1.3”中的方法配備菌株DT-XRKA孢子懸浮液，然后梯度稀釋至濃度為1.47×101、? 1.47×102、1.47×103個/mL以及1.47×104個/mL的孢子懸浮液。參照“1.5”的方法對密花香薷進行致病性測定。

1.7 作物安全性評價

將作物種子用1%的NaClO消毒后，25 ℃催芽至露白，播種于培養缽中，每缽點播20粒種子，覆土厚度約為1 cm。待長至3～4葉期時，用濃度為1.47×104個/mL的DT-XRKA孢子懸浮液接種，接種量為30 mL/盆。每個處理重復? 3次，對照組以清水加0.5 mL吐溫-80進行噴施。接種后將幼苗置于溫度（25±1） ℃，RH? （60±10）%，光周期L/D＝16 h/8 h環境下，常規方式管理。接種7 d后觀察作物發病情況，計算發病率和病情指數。病情分級標準參照文獻[20]并稍加修改。1級：無癥狀，植株葉片無任何病斑；? 2級：輕微反應，植株葉片上有零星病斑分布；? 3級：中等感病，植株1/4～1/2的葉片死亡，生長受抑制；4級：嚴重感病，植株1/2～3/4葉片死亡，生長較嚴重受抑制。當0≤病情指數＜5時，安全性等級為安全無癥狀（no symptom，NS）；當5≤病情指數＜10時，安全性等級為輕微反應（lightly susceptible，LS）；當10≤病情指? 數＜50時，安全性等級為中等感?。╩oderately susceptible，MS）；當病情指數＞50時，安全性等級為嚴重感?。╯everely susceptible，SS）。

1.8 病原菌的鑒定

1.8.1 形態學鑒定 將菌株DT-XRKA在PDA平板培養基上進行培養，培養過程中觀察菌落形態，在光學顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子以及是否在PDA培養基上產生色素沉著，同時參考《真菌鑒定手冊》對其進行鑒定[21]。

1.8.2 分子生物學鑒定 DT-XRKA采用真菌DNA提取試劑盒提取其菌株DT-XRKA基因組DNA，分別采用引物ITS1/ITS4和Alt a 1-F/Alt a 1-R（表1）對該菌株基因組的核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS）和鏈格孢菌過敏原基因（Alt a1）基因序列進行擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反應體系：2×PCR? Master Mix12.5 μL、10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、50 ng/μL DNA模板1.0 μL、ddH2O補足25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序所得序列提交GenBank并進行BLAST序列同源性比對，采用MEGA 7.0軟件以鄰接法構建系統發育樹，進行1 000次bootstraps檢驗，比較生防菌株與其他近緣菌株的親緣關系。

1.9 數據分析

利用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行統計分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 離體葉片致病性測定結果

采用組織分離法，從自然感病的植物葉片中分離獲得真菌7株，編號分別為DT-04A2、DT-YSB1、DT-XRKA、DT-DYLC、DT-14A2、DT-08C和DT-QKBD004A。以密花香薷為靶標雜草，采用離體葉片法對7株真菌進行致病性測定。菌餅致病性測定結果表明：接種7 d后，7株菌株對密花香薷離體葉片均表現不同的致病性。菌株DT-DYLC接種后，接種部位出現褐色病斑并向外逐步擴展，中心腐爛，有明顯的褐色輪紋病斑，病斑覆蓋面積占整個葉面積的40%左右，病級為4級。菌株DT-XRKA接種后，接種部位中心黑色，邊緣褐色，并逐步向菌餅四周呈放射狀擴散，病斑面積達到菌餅的3～4倍，發病面積占葉面積50%以上，病級為5級。菌株DT-YSB1、DT-QKBD004A、DT-08C和DT-14A2接種后，接種部位逐步變黃失綠，菌絲開始逐步侵染，接種部位出現褐色病斑，并逐漸向外擴展，病斑面積為菌餅大小，病級為2級。菌株DT-04A2接種后，葉片出現少量的不規則病斑，病級為1級。

2.2 溫室盆栽防效結果

如圖1所示，噴施DT-DYLC菌株孢子懸浮液后7 d，密花香薷上部植株葉片出現病斑，生長受到抑制。發病率為69.38%。噴施DT-XRKA菌株孢子懸浮液后，密花香薷葉片由葉緣向中心，逐步出現深淺不一的褐色病斑，植株下部葉片布滿病斑部分植株發病枯死，生長受到嚴重抑制。接種7 d后，3/4以上的葉片出現深褐色病斑，發病率為88.97%。噴施DT-QKBD004A和DT-08C菌株孢子懸浮液后，葉尖部分發病枯萎植株出現萎蔫現象，生長受到抑制。發病率為? 55.82%和58.33%。噴施DT-YSB1和DT-04A2菌株孢子懸浮液后，植株葉片出現零星的斑點，對密花香薷的致病作用不明顯。發病率僅為19.89%和33.51%。噴施DT-14A2菌株孢子懸浮液后，密花香薷葉片出現零星病斑，病斑面積逐步擴展，7 d后，2/3以上的葉片出現病斑，植株生長受到嚴重抑制。發病率為80.54%。

結合發病率、病情指數和鮮質量防效綜合分析（表2），接種7株菌株孢子懸浮液對密花香薷致病力不同。菌株DT-XRKA、DT-14A2與DT-DYLC、DT-08C、DT-QKBD004A、DT-04A2、和DT-YSB1發病率和病情指數相比，差異顯著? （P＜0.05），鮮質量防效菌株DT-XRKA與其他5株菌株相比差異顯著（P＜0.05）。綜上，由離體葉片致病性和盆栽致病性測試結果發現，7株菌株對密花香薷的致病性高低排序為：DT-XRKA＞DT-14A2＞DT-DYLC＞DT-08C＞DT-QKBD004A＞DT-04A2＞DT-YSB1，篩選出對密花香薷致病性最好的菌株為DT-XRKA。在接下來的試驗中，將以菌株DT-XRKA作為防除密花香薷的優勢菌株，進行后續試驗研究。

2.3 菌株DT-XRKA不同孢子懸浮液濃度對密花香薷的盆栽防效

由圖2可見，噴施菌株DT-XRKA孢子懸浮液7 d后，?? 1.47×104個/mL濃度處理的密花香薷植株將近全部死亡。孢子懸浮液濃度為? 1.47×103個/mL處理的植株葉片發黃，莖稈倒伏，發病部位主要集中于根部和中部葉片，3/4以上植株發病枯死，植株生長受到嚴重抑制。? 1.47×102個/mL濃度處理的植株有部分葉片出現褐色病斑并有逐步擴大跡象，部分葉片出現卷曲死亡現象并伴隨倒伏，生長受到抑制。而? 1.47×101個/mL孢子懸浮液濃度處理的幼苗部分葉片失綠，發病枯萎，1/4上的葉片出現斑點，有倒伏現象，生長受到抑制。

由表3可見，1.47×104個/mL濃度孢子懸浮液對密花香薷發病率、病情指數和鮮質量防效分別達96.42%、97.97和? 82.67%，1.47×101個/mL孢子懸浮液對密花香薷的發病率、病情指數和鮮質量防效分別為? 67.84%、51.11和? 52.44%。1.47×104個/mL處理的發病率與其他3個濃度處理相比，達到顯著差異（P＜0.05）。在病情指數和鮮質量防效比較，1.47×104? 個/mL與1.47×102個/mL和? 1.47×101個/mL處理相比，達到顯著差異（P＜? 0.05）。

2.4 作物安全性測試

將濃度為1.47×104個/mL的菌株DT-XRKA孢子懸浮液噴在測試作物上，接種7 d后，調查作物的發病情況，結果如圖3和表4所示。油菜與對照相比，在長勢和葉色上均無癥狀，植株葉片無任何病斑發病率和病情指數為0，安全等級為NS；豌豆和蠶豆有輕微卷葉現象，植株葉片上有零星病斑分布，發病率為10.73%和10.16%，安全等級為MS；對小麥和青稞有輕微的致病性，在接種的葉片頂端有少量梭形黃斑，葉片有輕微發黃現象，后期病斑不擴展，發病率為19.45%和30.55%，安全等級為MS；玉米與對照相比，葉尖部位有少量梭形黃斑，葉片有輕微卷葉現象，后期病斑不擴展，發病率和病情指數為5.76%和? 9.77，安全等級為LS；白菜、番茄、黃瓜和辣椒與對照相比，在長勢和葉色上均無癥狀，植株葉片無任何病斑發病率和病情指數為0，安全等級為NS；菠菜植株1/2以上的葉片出現病斑，葉片失綠變黃，植株生長受到抑制，發病率和病情指數為53.18%和51.46，安全等級為SS；蘿卜植株3/4以上的葉片出現病斑，植株生長受到嚴重抑制，發病率和病情指數為72.63%和74.18，安全等級為SS。

2.5 病原菌鑒定

2.5.1 形態學鑒定 菌株在 PDA培養基上，菌落白色，中間褐色，背面中間灰褐色，邊緣不規則，呈放射狀，稀松，菌落表面凹凸不平，菌絲毛絨狀，質地較?。▓D4-a）。菌絲灰白色，具橫隔膜，有分支（圖4-b）。分生孢子褐色，倒棍棒狀，具3～6個橫隔膜，1～3個豎隔膜，長10～30 μm，寬2～6 μm（圖4-c）。根據形態學特征，將分離的病原菌初步鑒定為鏈格孢屬Alternaria sp.。

2.5.2 分子生物學鑒定 擴增獲得DT-XRKA菌株的ITS和Alt a1序列長度分別為545 bp和422 bp，GenBank登錄號為OP404082和OP413739?；贗TS基因序列的系統發育分析結果表明，DT-XRKA菌株與多株Alternaria alternata相似性達到99%，并與登錄號為OP161643.1和ON827299.1的Alternaria alternata系統發育樹的最小分支（圖5-A）?；贏lt a1基因序列的系統發育分析結果表明，DT-XRKA菌株與登錄號為MW308146.1的處于系統發育樹的同一最小分支（圖5-B）。結合其形態學特征及基于ITS基因序列的系統發育分析結果，將DT-XRKA鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata），命名為A. alternata DT-XRKA。

3 結論與討論

開發和利用微生物資源作為生物除草劑，是微生物研究的重要目的之一[22]。植物病原菌產生的代謝產物在雜草防治中發揮著巨大的作用，從植物病原菌中生產生物除草劑是已被證實控制雜草最有效的方法之一[23]。TeA是從Alternaria屬和其他致病菌分離研制而出的微乳液，主要用來防除紫荊澤蘭、馬唐草、反枝莧和旱蓮等多種植物，具有較高的除草活性[24]。CASST是從Alternaria cassiae J.和A. Khan配置的制劑，對于控制大豆和花生作物田中的決明子效果顯著[25]。另外將狹卵鏈格孢菌AAEC05和莧鏈格孢菌-3等比例混合成孢子粉，對大豆田中四葉齡以下的稗草和反枝莧的防除效果可達到70%[26]。本研究以密花香薷作為靶標雜草通過離體葉片測定進行初篩，從7株真菌中篩選到具有生防潛力的1株真菌，然后通過盆栽試驗進行復篩，篩選到1株對密花香薷防除效果較好的菌株DT-XRKA，該菌株對密花香薷的鮮質量防效達到? 85.99%。

確定使用范圍是高效開發生物除草劑的重要步驟[27]。除草劑候選菌株的主要標準是對廣泛的雜草具有致病性，同時對作物具有安全性[28]。本研究對測試作物進行安全性評價發現菌株DT-XRKA孢子懸浮液對油菜、白菜、番茄、黃瓜和辣椒安全，可以在以密花香薷為優勢雜草的黃瓜、十字花科和茄科田中安全使用。然而本研究僅對12種作物進行了安全性評價，下一步有必要對其他作物的安全性進行研究，以確定其安全性水平和寄主范圍。

Alternaria物種由于其世界性的性質和對大量植物引起疾病的能力，在農業生產中變得越來越具有重要的意義[29]。已報道用于農田雜草防除的鏈格孢菌種類主要有A. sonchi、A. alternata、A. pellucida、A. macrospora以及? A.cassiae等[30-33]。本研究通過形態學特征和分子生物學鑒定，最終確定菌株DT-XRKA為Alternaria alternata。

微生物對寄主雜草的生物防治能力受生理、形態、生態相互作用和環境因素的影響[34]。本研究在控制環境下對菌株DT-XRKA的生物防治效果進行了評價，但是還需要進一步研究菌株DT-XRKA作為生物除草劑的潛力，包括田間藥效評價和環境因素對病原菌鏈格孢菌防治雜草作用的影響。

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Herbicidal? Activity and Crop Safety of Alternaria alternata DT-XRKA

Abstract Fungal strains were isolated from the leaves? of naturally diseased plants collected from the farmland of Dalong village，Datong county，Qinghai? province. Among these strains，the antagonistic strain DT-XRKA exhibited effective herbicidal activities against Elsholtzia densa through detached leaves，greenhouse pot experiments，and crop safety evaluation. The results showed that grayish-black patches covering more than 50% of leaf area appeared on the detached leaves after 7 days inoculation，resulting in 3-4 times more than fungus plugs. Massive grayish-black hyphae with concentric blackish and brown margins were observed at the inoculation sites. As the disease progressed，chlorosis and the yellowish area increased，reaching a disease grade of 5. The spore suspension of strain DT-XRKA，with different concentrations ranging from 1.47×101? to? 1.47×104 spores/mL，exhibied an incidence rate of 67.84% to 96.42%，a disease index ranging from 51.11 to 97.97，and a fresh? mass? control effect between 52.44% and 82.67%. Crop safety evaluation of strain DT-XRKA showed that its spore suspension was safe to rape，cabbage，tomato，cucumber and pepper. DT-XRKA was identified as Alternaria alternata by? morphology and rDNA-ITS sequence analysis.

Key words Weeds; Herbicidal activity; Crop safety; Biological control