金納米顆粒的特性及其應用于生物傳感體系的研究進展*

嚴艷琴 綜述,許永杰,張 華,△,莫 非,3 審校

1.貴州醫科大學,貴州貴陽 550004;2.貴州省人民醫院檢驗科,貴州貴陽 550002;3.貴州醫科大學附屬醫院醫務處,貴州貴陽 550004

金納米顆粒(AuNPs)具有獨特的理化性質,在生物檢測和診斷方面具有巨大的應用價值[1]。AuNPs的特性適于多樣化的傳感應用,可通過調整其大小、形狀和表面修飾配體等,進而調節AuNPs與生物靶標的相互作用,檢測生物樣本中不同類型分析物[2]。本文主要對AuNPs的性質、合成方法、表面功能化,以及AuNPs在生物傳感領域的研究進展進行綜述。

1 AuNPs的特性、合成及表面功能化

1.1AuNPs的特性

1.1.1局域表面等離子體共振(LSPR)特性 LSPR是指AuNPs表面自由電子的震蕩頻率與入射光的頻率一致時產生共振,從而引起光被吸收的現象,導致了AuNPs的不同顏色變化[3]。幾十納米大小的球形AuNPs,其典型的LSPR吸收峰為515～560 nm,而且LSPR可以在很寬的波長范圍內進行調諧,從可見光到近紅外區域[4]。AuNPs尺寸、形狀和表面功能化、粒子間距離的變化很容易將LSPR吸收峰轉移到光譜的其他區域,引起顏色的明顯改變[5],使人們夠通過比色檢測分析物。

1.1.2表面增強拉曼散射(SERS)特性 SERS即利用特定波長的光源照射局域表面等離激元所產生的局部增強的電磁場,放大拉曼散射信號[6]。AuNPs在可見光和近紅外區域存在LSPR帶,被廣泛用作SERS基底。SERS強度呈現距離依賴性,離表面較遠的電磁場呈指數衰減,使得信號增強限制在離基底表面較近的地方。因此,位于AuNPs表面熱點的分析物,其拉曼信號將受到明顯增強[7]。

1.1.3熒光淬滅和熒光增強特性 AuNPs在特定波長入射光激發下產生LSPR現象。其LSPR吸收帶通常與熒光基團發射光譜重疊,在近距離(<5 nm)時,AuNPs通過熒光共振能量轉移作用淬滅靠近的熒光基團[8]。隨著熒光基團與AuNPs之間距離的增加,能量轉移呈指數衰減。金屬增強熒光是由于金屬納米結構表面等離激元被入射光激發導致局部電磁場的增強,進而提高熒光基團的激發速率和發射速率,使熒光增強[9]。在閾值距離(10～30 nm)內,熒光增強程度達到最大。當距離大于此閾值時,增強電場隨距離的增加呈指數衰減,熒光增強程度會下降,直到在非常遠的距離達到其原始熒光強度[10]。

1.1.4導電特性 AuNPs具有優異的電子轉移能力。氧化還原反應消耗或產生離子或電子,AuNPs被用于增強電極與氧化還原物質之間的電子轉移速率,電子快速轉移到電極表面,使傳感器具有較快的響應速度[11]。AuNPs具有較大的比表面積和良好的導電性能,能促進反應物的氧化還原反應,有效提高響應信號的信噪比和檢測靈敏度,被廣泛應用于電化學傳感技術[12]。

1.1.5生物相容性 金屬在生物體中的毒性主要是由于金屬陽離子的形成而損傷細胞膜。金具有高還原電位而相對穩定,與其他金屬相比,它電離的可能性較小[13]。生物相容性是促進其在體內成像、示蹤及治療應用的前提。AuNPs的表面功能化為改善生物相容性和與細胞的反應性提供了良好策略。

1.2AuNPs的合成 AuNPs合成最常用的方法是檸檬酸還原法。檸檬酸鹽還原法是TURKEVICH等[14]在1951年提出的,即通過檸檬酸三鈉還原氯金酸HAuCl4合成AuNPs,其中檸檬酸鹽的作用是將Au3+還原為Au,同時通過靜電排斥穩定納米顆粒并防止團聚。FRENS[15]在此基礎上進一步優化,通過改變檸檬酸鹽的濃度來控制納米顆粒的大小。為了合成更穩定分散的AuNPs,其他合成方法逐漸發展起來。不同的方法具有各自的優勢和局限性。比如Brust-Schiffrin法[16]利用硼氫化鈉還原金離子,可在兩相溶液中產生穩定的AuNPs。電化學法[17]操作簡單、易合成形狀大小可控的AuNPs。激光燒蝕[18]可以產生粒徑低于10 nm的AuNPs,而且AuNPs的尺寸可以通過激光強度來控制。離子濺射法[19]可以在不使用液相的情況下合成AuNPs,這減少了來自溶劑的有毒殘留物。通過化學方法合成AuNPs會產生危害生物和環境的有毒副產物。物理方法涉及使用高外力,條件要求比較高。綠色生物合成方法[20],即細菌、真菌、酵母菌等微生物通過生物還原金離子合成AuNPs,改變培養條件可以控制納米顆粒的大小和形狀,具有簡單、無毒、環境友好、經濟的優點。

1.3表面功能化 在生物檢測平臺中,AuNPs需要將其表面功能化,從而為特定的生物靶標提供識別元件。常見的表面功能化策略有共價和非共價方法。共價方法中,金硫鍵(Au-S)介導生物偶聯最常見。含巰基(-SH)配體,如谷胱甘肽、二硫化物,可與AuNPs共價形成金硫鍵(Au-S)[21]。含氨基或羧基生物分子,如賴氨酸和精氨酸,也能與AuNPs共價結合[22]。非共價方法,包括靜電相互作用和物理吸附。帶正電荷聚合物聚乙烯亞胺功能化AuNPs,通過帶電分子提供額外的靜電排斥,阻止納米顆粒聚集[23]。含有多個連續腺嘌呤的聚腺嘌呤(polyA)序列以高親和力吸附AuNPs,能有效地阻斷非特異性DNA-Au的結合,可以制備具有良好雜交能力的納米偶聯物[24]。其他分子也可用于提高穩定性,如聚乙二醇、硫辛酸、牛血清清蛋白[25]。表面易功能化使得AuNPs成為與多種分子官能化的良好支架,這在實現生物醫學應用方面起著重要的作用。

2 AuNPs在生物傳感體系中的應用

AuNPs在生物傳感領域有著廣泛的應用。其特性可用于構建多種類型的傳感器,檢測不同的靶標,如蛋白質、核酸、小分子、金屬離子、細菌、外泌體等。

2.1基于AuNPs的比色傳感體系 AuNPs比色傳感是指基于調控AuNPs聚集引起膠體溶液的可見顏色變化。分散的球形AuNPs(直徑1～50 nm)在溶液中呈酒紅色,而聚集的AuNPs呈紫色。MOITRA等[26]利用反義寡核苷酸鏈修飾的AuNPs與靶標直接進行雜交引發AuNPs聚集,引起顏色改變,通過視覺檢出新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)RNA陽性病例,而不需要復雜的儀器。ZHU等[27]通過靶識別后的級聯反應調控AuNPs聚散,靶標ATP識別適體后引起脫氧核酶(DNAzyme)序列同步組裝,裂解底物DNA,使互補單鏈DNA(ssDNA)修飾的AuNPs無法交聯而分散?；谖?解吸過程誘導AuNPs聚集是另一類常見的策略。GAN等[28]提出了一種基于適配體鏈捕獲Cd2+誘導裸AuNPs聚集的比色分析方法,通過顏色快速識別Cd2+。SUN等[29]利用靶蛋白競爭性結合DNA,導致AuNPs表面DNA的解吸,裸AuNPs不耐鹽聚集,使溶液呈現紅到藍的變化。通過不同的分子識別機制調控AuNPs組裝,可形成簡單的視覺檢出策略。AuNPs在比色傳感的應用也存在一些局限性,如非特異性吸附和靈敏度低的問題。為避免非特異性吸附,可考慮用配體封閉AuNPs的表面。針對低靈敏度,可在體系中偶聯等溫擴增或級聯放大技術[30]。

2.2基于AuNPs的側向流動檢測(LFA) LFA是最常用的基于AuNPs的傳感類型,由于試紙條LFA對分析物的簡單和快速檢測,在床旁檢測(POCT)領域得到廣泛的應用。傳統的LFA通常利用抗體作捕獲分子,抗體與靶抗原形成三明治結構,在檢測線上形成紅線。FREW等[31]用抗核衣殼蛋白抗體偶聯150 nm AuNPs建立試紙條測試,檢測SARS-CoV-2抗原,能在15 min內檢出陽性樣本。近年來,核酸探針代替抗體被用于設計LFA,用于靶核酸的定性和定量分析。XU等[32]將穩定的DNA四面體捕獲探針放置在檢測線上,其與靶催化組裝的H1-H2雙鏈、鏈酶親和素修飾的AuNPs結合形成夾心復合物,檢測外泌體微小RNA(miRNA)。此外,核酸適配體技術的快速發展擴展了LFA的檢測范圍,基于適體的LFA在小分子檢測方面也顯示了良好的應用前景。MAO等[33]設計了一個與適體序列互補的cDNA偶聯的AuNPs探針,與目標啶蟲脒競爭結合檢測線上適體,最小檢出濃度為0.33 ng/mL。GUO等[34]巧妙運用了T-Hg2+-T堿基對共軛,提出了基于胸腺嘧啶錯配捕獲AuNPs的LFA方法,用于檢測Hg2+。AuNPs LFA通過簡單的比色信號或裸眼視覺檢出,具備快速簡便的優勢,靈敏度低是其主要缺陷。通過引入信號放大技術,改變AuNPs的大小或形狀,開發熒光-LFA、SERS-LFA等新型方法,有助于提高靈敏度[35]。

2.3基于AuNPs的熒光傳感體系 AuNPs可引起距離依賴性熒光淬滅或增強(近距離熒光淬滅,閾值距離外熒光增強),可通過靶識別精確組裝AuNPs與熒光基團。CHOI等[36]將金半殼/聚苯乙烯納米球表面修飾捕獲ssDNA,其與靶DNA、熒光基團偶聯的ssDNA形成夾心式雜交,通過等離子體激元增強熒光。隨后較小的AuNPs被引入,淬滅吸附在其表面的未雜交ssDNA的背景熒光,使靈敏度提高約103倍。然而,精確控制AuNPs與熒光基團從淬滅到增強仍然是一個挑戰。常見的策略是熒光基團置于AuNPs表面時被淬滅,遠離AuNPs表面熒光即恢復。該策略結合DNA walker高效的信號放大功能,可顯著提高檢測靈敏度。TAN等[37]利用DNAzyme序列組成的walker,循環切割AuNPs表面探針產生熒光信號,檢測尿嘧啶-DNA糖基化酶。ZHOU等[38]用walker鏈與AuNPs表面熒光探針雜交,觸發Nb.BbvCⅠ蛋白酶切割釋放熒光信號并驅動walker位移,檢測外泌體。

相較于常見的熒光基團,碳量子點(CQD)等新興的納米材料,在光穩定性、低細胞毒性和生物相容性方面具有明顯優勢[39]?；贑QD和AuNPs的熒光共振能量轉移系統適合用于復雜樣品分析。SHI等[40]通過脫落酸ABA-適體識別結合觸發AuNPs的聚集,阻礙了AuNP與CQDs之間的能量轉移過程,導致熒光淬滅。

2.4基于AuNPs的電化學傳感體系 在電化學傳感器中,AuNPs可以通過促進電子轉移、固定生物分子、標記生物分子等方式發揮作用。常見的策略可分為兩類,一類是將AuNPs沉積在基底表面,另一類是通過靶分子結合事件將AuNPs固定在傳感器表面[41]。AuNPs沉積在電極表面,為核酸、抗體等識別元件固定提供了位點,通過促進電子轉移放大電化學信號。ALAFEEF等[42]將AuNPs沉積在石墨烯表面,修飾ssDNA的AuNPs與SARS-CoV-2 RNA特異性結合,可在5 min內輸出電化學信號。ROBERTS等[43]將AuNPs滴注到氧化錫電極上用作信號放大器,并固定特異性抗體以檢測SARS-CoV-2 S1抗原。AuNPs通過靶標結合事件固定到傳感器表面是另一種方式。AuNPs表面通常標記電活性物質和酶,標記的酶可催化底物水解成可溶性電活性產物,實現電化學反應信號檢測[44]。HU等[45]將黏蛋白適體和辣根過氧化物酶HRP固定在AuNPs上,靶分子與適體結合后,導致AuNPs被捕獲到傳感器表面。HRP酶催化底物轉化,檢測電活性產物的信號。AuNPs標記電活性物質,是通過該物質直接轉化為可測量的電化學信號。ZHANG等[46]針對外泌體設計3種特異性適體,外泌體結合電極表面適體,同時結合適體修飾的AuNPs,以AuNPs表面亞甲藍和二茂鐵為信號單元,檢測乳腺癌外泌體。研究AuNPs在電極表面發生反應的機制以及如何增強其電催化性能,將有助于設計更有效的電化學傳感器。

2.5基于AuNPs的SERS傳感體系 AuNPs作為高靈敏度和更可控的SERS基底,被廣泛應用于SERS傳感領域。SERS可分為非標記分析和標記分析。非標記分析即SERS基底上不需要標記分析物,檢測AuNPs表面天然分析物的SERS信息[47]。FRAIRE等[48]在外泌體囊泡表面官能化AuNPs,通過SERS信號鑒定單個外泌體類別,并在原位生長銀層形成Au@AgNPs,消除AuNPs表面配體產生的干擾信號,從而得到清晰的生物結構的SERS光譜指紋。標記分析是指AuNPs表面可標記或吸附拉曼信號分子。CAMACHO等[49]設計了一種增強拉曼散射的殼核納米結構,該結構由AuNPs和涂覆有尼羅藍(拉曼報告子)的二氧化硅殼組成,殼層有效減少了背景信號的干擾,通過在其表面修飾抗體,可檢測低至10 ng/mL的寨卡病毒NSl抗原。由于生物樣品的復雜性,強背景干擾成為SERS技術應用于核酸檢測的主要限制。PAN等[50]依據Au@Ag核殼納米粒子與Fe(CN)64-的獨特拉曼峰檢測靶DNA,最終顯示為未受背景干擾的SERS信號。

SERS基底上的熱點分布極不均勻,局部增強的電磁場主要集中在納米間隙和尖端等區域?？赏ㄟ^合理設計納米間隙,在納米組件之間產生增強的熱點,如利用DNAzyme裂解底物使AuNPs接近金薄膜產生熱點檢測Pb2+[51]。如何構建高密度、分布均勻的熱點,實現熱點中拉曼分子的有效富集,是SERS面臨的重要挑戰[52]。

2.6基于AuNPs的電化學發光傳感體系 電化學發光(ECL)是由電化學反應引發化學發光的現象。ECL效應取決于AuNPs與ECL發光載體之間的距離。近距離時,發光載體的ECL與AuNPs發生共振能量轉移導致ECL淬滅效應;在遠點的距離(<10 nm),AuNPs獨特的LSPR誘導的增強電磁場可以增強ECL載體的發射,從而增強信號[53]。BROWN等[54]在電極表面沉積AuNPs,AuNPs可明顯增加電活性面積,促進目標吉西他濱的電催化氧化,使ECL信號強度增加了60倍。VILLA等[55]利用鉑涂層的金核納米顆粒與[Ru(bpy)3]2+發生ECL共振能量轉移,檢測SARS-CoV-2病毒N蛋白,顯示出低檢測限和寬線性響應范圍。為更好地實現ECL增強效應,需考慮如何精確控制AuNPs與發光載體的距離、改善識別元件在電極表面的分布等問題。

2.7基于AuNPs的其他傳感體系

2.7.1光纖LSPR傳感 光纖LSPR傳感器是將AuNPs放置在光纖截面上,利用光纖產生的倏逝場激發AuNPs形成LSPR,AuNPs表面結合事件會導致周圍介質折射率的增加,引起LSPR吸收峰強度變化[56]。KIM等[57]將抗體偶聯的球形AuNPs附著在光纖表面,靶抗原與抗體反應引起光纖上AuNPs與游離AuNPs之間的耦合,導致LSPR信號改變。NING等[58]基于靶DNA催化的雜交鏈式反應組裝大量AuNPs,與“Ω”形光纖表面的AuNPs探針雜交,LSPR信號明顯增強。光纖LSPR傳感僅依賴于紫外吸收光譜儀讀數,具備無標記、小型化、快速的優點。

2.7.2光熱傳感 光熱傳感檢測是基于AuNPs產生的光熱效應。LSPR現象使AuNPs產生較高的光吸收,聚集態AuNPs表現出較強的光熱轉換效應[59],使生物標記物的信息轉換為光熱信號,結合溫度計即可進行定量檢測。靶標引入誘導AuNPs聚集是常見的策略,結合AuNPs表面不同的偶聯物,可以檢測不同靶標,如結核分枝桿菌DNA[60]、胰蛋白酶[61]。光熱傳感平臺,選擇溫度作為信號讀數,具有成本低、操作方便、背景低等優點,有應用于POCT的潛力。

2.7.3光電化學(PEC)傳感 PEC傳感的原理是光敏材料在吸收光后被激發產生電子空穴對,導致電荷分離和電荷轉移形成光電流[62]。在PEC過程中,AuNPs因LSPR效應會明顯增加光吸收,增強電荷分離,從而提高PEC性能[63]。例如在金屬蛋白酶的檢測中,AuNPs被沉積到光敏電極表面,為識別元件提供固定位點的同時提高光電轉換效率[64]。因光激發源與電化學響應信號分離,PEC傳感具有良好的信噪比和靈敏度。

3 展 望

快速、靈敏、準確、低成本的檢測方法一直是人們關注的問題。新型傳感模式和納米材料(特別是AuNPs)為解決這些問題提供了策略?；贏uNPs在光、電及生物相容性方面的優勢,其應用不僅限于生物傳感,可以為疾病的診斷和治療開辟更多新的途徑,包括藥物靶向輸送及腫瘤的成像與治療等。AuNPs可與其他材料結合制成雜化材料,如金屬氧化物、聚合物、脂質、無機材料、金屬有機骨架等[65],該雜化物具有物理或化學的協同效應或具有新的功能,因而應用范圍更廣泛,已用于藥物遞送、體外診斷、生物成像等各種領域。盡管基于AuNPs的體外診斷應用的研究已取得了很大的進展,但仍有一些關鍵問題有待解決,例如如何保證AuNPs分析平臺的可重復性、可靠性、AuNPs的均一性等?？傊?AuNPs技術具有廣闊的應用前景,通過不斷優化應用條件,可使其在生物醫學領域發揮更大的應用價值。