煙草碳代謝產物及關鍵酶基因對移栽期的響應

錢雪松 黃人杰 周俊成 彭三喜 郜軍藝 熊晶 高煥曄

摘要：探究威寧黑石地區移栽期對云煙87大田期碳代謝產物含量、碳代謝酶活性及其關鍵基因表達量的影響，為明確威寧黑石地區最適宜的移栽時期，提高煙葉品質提供理論依據。以云煙87為試驗材料，采用隨機區組試驗設計，移栽期設4個水平：T1（4月10日）、T2（4月20日）、T3（4月30日）、T4（5月10日），2022年于畢節市威寧地區開展田間試驗，在大田不同生育時期測定云煙87碳代謝產物及關鍵酶基因對移栽期的響應。結果表明，云煙87旺長期、現蕾期煙葉中還原糖含量呈先升后降的趨勢，且隨生育進程推進，各移栽期處理的還原糖含量也呈先升后降的趨勢，T2處理煙葉還原糖含量在多數生育期處于較高水平；各移栽期處理的總糖含量的變化規律在各生育期都不盡相同，T2處理煙葉總糖含量在多數生育期處于較高水平；淀粉含量則隨移栽期推遲，在生育前期呈先降后升的趨勢，在生育后期呈先降后升再下降的趨勢。碳代謝酶活性方面，移栽后30～70 d，α-淀粉酶（α-Amylase）活性最低的處理均為T3或T4處理，T2處理活性均為最高或第二高；在同一生育時期內，蔗糖合成酶（SS）、蔗糖轉化酶（INV）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性最高的多數為T3、T4處理。碳代謝關鍵酶基因表達量方面，α-淀粉酶基因（Ntα-Amylase）、蔗糖酶合成酶基因（NtSS）表達量總體以較早移栽處理（4月10日、4月20日）較高。相關性結果分析表明，碳代謝產物含量、碳代謝酶活性及其關鍵酶基因表達量之間在不同生育時期均有不同程度的聯系。綜上，威寧黑石地區4月20日移栽，有利于碳代謝活動的進行。

關鍵詞：煙草；移栽期；碳代謝產物；關鍵酶；基因；表達量

中圖分類號：S572.01；S572.04? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0117-08

收稿日期：2023-07-22

基金項目：貴州省煙草公司畢節市公司項目（編號：2022520500240190）。

作者簡介：錢雪松（1997—），男，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：2503844123@qq.com。

通信作者：高煥曄，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：294248298@qq.com。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是茄科煙草屬一年生草本植物，作為我國重要的經濟作物，對促進我國經濟發展具有重要意義。煙葉的品質和產量直接影響煙草行業發展和煙草種植戶收益，煙葉品質是多因素（遺傳因素、生態環境和栽培技術）協同作用的結果，其中栽培技術是影響煙葉優質高產的關鍵因素之一^[1-3]。栽培技術能保證且調控烤煙碳代謝過程，從而影響烤煙碳代謝產物的積累及風味的形成^[4]。移栽期是通過調整煙株的大田生長期所處的氣候條件，進而影響烤煙生長發育、產量和品質^[5-8]。因此，選擇適宜的移栽期，可充分利用氣候資源，最大限度地促進優質煙葉形成，對烤煙品質改良具有重要意義^[9]。

陳義強等的研究表明，移栽期過于提前，煙株在大田前期將遭遇低溫，易導致提早開花，碳代謝活動受到抑制，最終導致產量和品質降低^[10]。若移栽期過于推遲，煙株苗期環境溫度較高，煙苗生長加快，不利于碳代謝產物積累，煙葉不能正常成熟，烤煙品質顯著降低^[11]。相關研究表明，烤煙碳氮代謝強度、協調性及其動態變化均影響著煙葉化學成分含量和協調性、香吃味（感官評價中的香氣特性、口感特性）等^[12]。碳代謝過程中，各種酶活性的變化對碳代謝產物含量起重要調節作用^[13]。潘飛龍等研究發現，蔗糖合成酶、蔗糖轉化酶、蔗糖磷酸合成酶活性對蔗糖積累均有不同程度的影響，相關酶活性及基因表達量的差異可能是造成碳代謝產物差異的重要原因^[14-15]。隨著移栽期的后移，煙株的大田生育期相對推遲，整個生育期相應縮短，碳代謝強度受到影響，從而對烤煙總糖、還原糖、淀粉等碳代謝產物有不同程度的影響^[16-23]。目前，相關研究對象大多是以低海拔為生態背景的煙區，對威寧黑石這種地處烏蒙山脈中部，屬亞熱帶季風濕潤氣候的高海拔煙區研究較少，同時還缺乏大田期碳代謝產物與碳代謝關鍵酶活性及其基因表達量的相關性研究。

本研究以云煙87為材料，通過測定威寧黑石地區不同移栽期處理下云煙87大田碳代謝產物含量、關鍵酶活性及關鍵基因表達量，明確該地區最適宜的移栽時期，為威寧黑石優質煙葉生產提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗地概況

試驗于2022年在貴州省威寧縣黑石頭鎮河壩村煙草科技園（26.754 725°N，103.995 142°E）進行，海拔2 218 m，年均氣溫10.9 ℃，年總積溫 3 996 ℃，年降水量981 mm，年無霜期182 d；試驗地塊地勢平坦，肥力均勻，排水優良，上一個種煙季節未發生青枯病、黑脛病等病害，距離公路300 m以上。試驗地土壤為黃壤土，土壤pH值為5.88，耕層土壤有機質含量11.32 g/kg，堿解氮、速效磷、速效鉀的含量分別為89.43、11.08、241.37 mg/kg。以綠肥為前作。

1.2 ?試驗材料

供試品種為云煙87。

1.3? 方法

1.3.1? 試驗設計

不同移栽期處理設置4個水平：T1（4月10日移栽）、T2（4月20日移栽）、T3（4月30日移栽）、T4（5月10日移栽）。田間試驗采取隨機區組試驗設計，3次重復，每個小區種植4行（行距1.1 m，株距0.5 m），每行25株，試驗地四周設置保護行。煙苗采用分期播種，以保證不同移栽期所用煙苗苗齡一致。其他栽培管理技術按所在基地單元生產技術方案執行（基肥45 kg/hm₂，N∶P∶K=9∶13∶24；提苗肥3 kg/hm²，N∶P∶K=15∶8∶7；追肥23 kg/hm²，N∶P∶K=13∶0∶26）。

1.3.2? 測定項目

1.3.2.1? 鮮煙葉碳代謝主要產物大田期鮮煙葉碳代謝主要產物測定：各處理于團棵期、旺長期、現蕾期、成熟采烤期選擇代表性煙株3株，取樣后洗凈擦干，分上部葉、中部葉、下部葉（相對部位），置于烘箱中105 ℃殺青30 min，再在65 ℃下烘干至恒重。采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定煙葉總糖、還原糖、淀粉的含量。

1.3.2.2? 碳代謝關鍵酶活性各處理在煙株分別移栽后30、40、50、60、70 d進行取樣，每個處理選擇長勢一致的煙株，采集煙株中部葉片（相對位置為煙株中部），相同葉位每株僅取1次，選取9個單株為一次樣品采集，每3株混合為1個樣本，3次生物學重復，將上述煙葉分別沿主脈分為2份，迅速置于干冰中凍存，一份用于碳代謝相關酶活性的測定。采用ELISA檢測試劑盒測定碳代謝相關酶[α-淀粉酶（α-amylase）、蔗糖合成酶（SS）、蔗糖轉化酶（INV）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）]的活性。

1.3.2.3? 碳代謝關鍵酶基因表達量另一份煙葉用于碳代謝關鍵基因酶表達的測定。利用實時熒光定量PCR（qRT PCR）技術檢測碳代謝關鍵基因[α-淀粉酶基因（Ntα-amylase）、蔗糖合成酶基因（NtSS）]的相對表達量。引物如表1所示，PCR反應體系和程序按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，Q711）試劑盒進行。

1.4? 氣象條件檢測

2022年4—9月試驗地點氣象數據結果（圖1）表明，旬均氣溫在7.1～19.6 ℃之間，呈波浪線形變化；4月下旬、5月中下旬、6月上旬及7月上旬降水量比較充沛； 4月下旬日照時數最長。地下5 cm及地下15 cm土壤溫度均在22.1 ℃左右波動。不同土壤層濕度變化趨勢總體一致。7月上旬至9月中旬，地下5、15 cm土壤層濕均呈凹峰變化，且各土壤層間濕度差異不大。

1.5? 數據統計與分析

數據采用Excel 2016進行統計處理和制表，Origin 2021進行制圖，利用SPSS 26數據統計軟件進行方差分析、相關性分析；處理間差異顯著性比較采用鄧肯氏法（α＝0.05、α＝0.01），處理間相關性分析采用Pearson法，顯著性水平為α=0.05，極顯著性水平為α=0.01。

2? 結果與分析

2.1? 移栽期對云煙87大田期碳代謝產物的影響

2.1.1? 移栽期對下部葉碳代謝產物的影響

為明晰移栽期對煙苗下部葉碳代謝產物的影響，在團棵期、旺長期、現蕾期和成熟期進行下部葉取樣，測定煙葉還原糖、總糖和淀粉的含量（圖2）。隨著移栽期推遲，煙苗團棵期、現蕾期下部葉中還原糖含量下降，T1和T2處理的還原糖含量顯著高于T3和T4處理（P<0.05）；成熟期煙苗下部葉還原糖含量以T2處理最佳，顯著高于其他移栽期，含量達到（10.11±1.01）%；煙苗生育進程（現蕾期除外）中下部葉還原糖含量各移栽期均表現為先增加后減少。煙苗旺長期T1處理和團棵期T2處理下部葉總糖含量顯著高于其他3個處理。T4處理煙苗生育前期（團棵期、旺長期）下部葉淀粉含量顯著高于其他移栽期處理；盡管T1和T2處理煙苗發育前期（團棵期、旺長期、現蕾期）下部葉淀粉含量較低，但在成熟期時，T1和T2處理顯著高于T3和T4處理。

2.1.2? 移栽期對中部葉碳代謝產物的影響

為明晰移栽期對煙苗中部葉碳代謝產物的影響，在團棵期、旺長期、現蕾期和成熟期進行中部葉取樣，測定煙葉還原糖、總糖和淀粉的含量（圖3）。不同移栽期處理對煙苗生育前期（團棵期、旺長期）中部葉還原糖含量影響不大，對煙苗生育后期存在顯著影響?，F蕾期時，T1處理煙苗中部葉還原糖含量達到（9.27±0.43）%，T2處理達到（9.76±1.22）%，T3處理達到（10.15±1.01）%，均顯著高于T4處理（6.25±1.23）%，而成熟期T3、T4處理顯著高于T1、T2處理；不同移栽期處理煙苗中部葉還原糖含量存在共性，即旺長期和現蕾期快速積累，成熟期時含量降低。只有T1處理煙苗旺長期中部葉總糖含量顯著高于其他3個處理，與上部葉的T1處理結果（圖4）相似。不同移栽期煙苗中部葉淀粉主要在成熟期積累，其中T2處理的淀粉含量最高，為（27.12±0.90）%，顯著高于其他處理，T3處理最低，為（15.10±0.91）%。

2.1.3? 移栽期對上部葉碳代謝產物的影響

為明晰移栽期對煙苗上部葉碳代謝產物的影響，在團棵期、旺長期、現蕾期和成熟期進行上部葉取樣，測定煙葉還原糖、總糖和淀粉的含量（圖4）。煙草生育前期（團棵期、旺長期）上部葉還原糖含量以T2處理最高，后期各移栽期處理間無顯著差異。不同移栽期處理煙苗上部葉總糖含量在團棵期表現出較大差異，T2處理最高，為（34.62±1.62）%，T3處理次之，為（21.54±1.93）%，T1、T4處理的含量較低，分別為（17.80±0.54）%、（15.78±0.14）%；T1處理煙苗旺長期總糖含量高于其他處理。淀粉含量在不同生育時期無明顯變化規律。

2.2? 現蕾期與成熟采烤期碳代謝產物相關性分析

現蕾期碳代謝產物與成熟采烤期碳代謝產物相關性分析結果見表2，烤煙現蕾期總糖含量與成熟采烤期淀粉含量呈極顯著正相關關系（P<0.01），現蕾期淀粉含量與成熟采烤期淀粉含量呈顯著負相關關系（r=-0.359）。結果表明，烤煙現蕾期總糖含量、淀粉含量的變化對成熟期煙葉淀粉積累影響較為明顯。

2.3? 移栽期對碳代謝關鍵酶活性的影響

為明晰移栽期對煙苗碳代謝酶活性的影響，在煙苗移栽后30、40、50、60、70 d取樣，測定α-淀粉酶、蔗糖合成酶、蔗糖轉化酶、蔗糖磷酸合成酶的活性，結果見圖5。α-amylase活性以T1處理的煙株活性較高，移栽后30、60、70 d煙株的α-amylase活性顯著高于其他移栽期處理，T2處理煙株在移栽 40 d 后α-amylase活性最高。T3處理煙株在移栽后30、40、50 d的SS活性最高，分別為1052.32、818.05、1 036.12 U/g；T4處理煙株則在移栽60 d后SS活性達到888.22 U/g，移栽70 d后達到1 093.34 U/g。隨著移栽期的推遲，煙株的INV活性總體呈增加趨勢，而在移栽后40 d其活性則呈降低趨勢；在移栽后50、60、70 d，INV活性總體較高的是T4處理煙株，分別為327.24、321.84、297.68 U/g，T3處理的INV活性在移栽后50、60 d最高；且各移栽期處理中INV活性總體均在移栽后40～60 d達到最高，INV活性在進入旺長期（移栽后30 d）后總體以較晚移栽的T4處理煙株較高。SPS活性在移栽后40 d以較晚移栽煙株表現較好，在移栽后30 d是T3處理煙株表現最好，為 88.12 U/g，移栽后40 d是T4處理煙株表現最好，為86.91 U/g；移栽后50～60 d SPS活性表現最好的是T1處理煙株，分別為94.26、71.29 U/g，移栽后30～70 d總體表現較差的是T2處理煙株。

2.4? 移栽期對碳代謝關鍵酶基因表達量的影響

Ntα-amylase和NtSS這2個基因是煙草碳代謝途徑中的關鍵基因，其表達量可以在一定程度上反映植株碳代謝強度。通過檢測不同移栽期烤煙生長至30、40、50、60、70 d的碳代謝關鍵酶基因表達，進一步明晰移栽期對云煙87煙葉碳代謝的影響。qRT PCR結果如表3所示，T1處理煙苗Ntα-amylase和NtSS基因表達量均處于較高水平，T2處理移栽后30 d表達量顯著高于其他處理。

2.5? 大田期碳代謝產物與碳代謝關鍵酶活性的相關性分析

對大田期碳代謝產物與碳代謝關鍵酶活性進行相關性分析，結果見表4。在團棵期，α-amylase活性與總糖含量、INV活性與淀粉含量均呈極顯著正相關關系（P<0.01），相關性系數均在0.700以上；SS活性與還原糖含量顯著負相關，與淀粉含量呈極顯著負相關關系。在旺長期，SPS活性與總糖含量呈極顯著正相關關系，r=0.850；SPS活性與淀粉含量呈顯著正相關關系，r=0.641；INV活性與總糖含量呈極顯著負相關關系，相關系數r=-0.773?，F蕾后，α-amylase活性與淀粉含量、SS活性與還原糖含量、SPS活性與還原糖和總糖含量、INV活性與總糖含量均為顯著負相關關系。

2.6? 大田期碳代謝產物與碳代謝關鍵酶基因表達量的相關性分析

對大田期碳代謝產物與碳代謝關酶基因表達量進行相關性分析，結果見表5。在團棵期，僅有Ntα-amylase表達量與總糖含量的相關性達到顯著水平，相關系數r=0.590，而其他指標的相關性總體為低度相關。

NtSS表達量在旺長期對淀粉含量變化有較大影響，其相關性分析結果達到極顯著水平，相關系數r=0.900；在現蕾期，Ntα-amylase表達量與總糖含量呈顯著正相關。

2.7? 大田期碳代謝關鍵酶活性及其關鍵酶基因表達量的相關性分析

對大田期烤煙碳代謝關鍵酶基因表達量和碳代謝關鍵酶活性進行相關性分析，結果見表6?？緹熞圃院?0 d，Ntα-amylase表達量與α-amylase活性呈顯著正相關關系，相關系數r=0.861。移栽后50 d，Ntα-amylase表達量與SPS活性呈顯著正相關關系，相關系數r=0.936。移栽后60 d，Ntα-amylase、 NtSS表達量與α-amylase活性之間的正相關性系數均達到0.9以上，達極顯著水平，而Ntα-amylase、NtSS表達量與INV活性的負相關系數均在0.8以上，達顯著水平。

3? 討論

蔣代兵等研究發現，龍巖煙區煙株2017年1月15日移栽較常規的2017年1月25日移栽更有利于碳代謝產物積累^[24]。曾文龍等的研究表明，龍巖煙區煙株隨移栽期推遲，碳代謝產物含量逐漸下降^[25]。余永旭等的研究表明，重慶奉節煙區煙株隨移栽期推遲，碳代謝活動逐漸減弱^[26]。這與本研究結果不一致，這是因為福建龍巖煙區屬亞熱帶海洋性季風氣候，海拔較低，降雨充沛，日照時數較少，煙株后期碳代謝衰弱，致碳代謝產物減少；重慶奉節煙區屬亞熱帶濕潤季風氣候，降雨充沛，海拔受地形變化影響。說明煙株碳代謝活動受降雨條件影響較大，降雨過多可能會受抑制。

白應香研究發現，黔西南煙區云87隨移栽期推遲，總糖含量增加，還原糖含量降低^[27]。這與本研究有所差異，可能其所設置移栽處理間隔較小所致。盧鵬宇等研究發現，清鎮煙區煙株隨移栽期推遲，還原糖含量、總糖含量均呈上升趨勢^[28]。高真真等的研究表明，河南煙區煙株上6葉總糖含量、還原糖含量隨移栽期推遲呈上升趨勢^[29]。這與本研究結果一致。

研究顯示，通過對相關酶活性的調控可以改變烤煙碳代謝活動的強弱，進而影響碳代謝產物含量^[30]。白應香研究發現，在烤煙大田生長期，不同移栽期處理煙株在移栽40～50 d后α-amylase活性達到峰值，之后下降，說明煙株生長前期對淀粉的積累量較少，隨著煙株生育進程的推進，淀粉積累量逐漸增加，進入煙葉成熟期后煙葉淀粉含量又逐漸降低^[27]；本研究中，α-amylase活性總體以較早移栽的處理較高，這與較早移栽處理前期降雨和光照均充足有關。王寒等研究發現，提前移栽處理煙株淀粉酶活性峰值出現推遲，提前移栽處理煙株淀粉酶活性峰值出現的時間提前^[31]；本研究中SS、INV和SPS活性同樣總體以較晚移栽的處理較高，且SS的活性在團棵期對還原糖含量有顯著影響，SPS、INV活性對烤煙主要碳代謝產物的合成和積累的影響主要集中在旺長期至現蕾期。碳代謝相關基因對煙株碳代謝產物的合成與積累具有重要的調控作用^[32]。潘飛龍研究發現，烤煙適熟至過熟階段，煙葉NtSS表達量對煙葉糖代謝活動的調控作用較強^[33]。王紅麗等研究發現，隨著煙葉的成熟度增加，NtSS表達量升高^[34]。白應香研究發現，在黔西南州亞熱帶季風濕潤氣候條件下，云煙87移栽后50～60 d，NtSS表達量呈下降趨勢^[27]，表達量總體變化趨勢與魯黎明等的研究結論^[35]一致。本研究中，Ntα-Amylase、NtSS基因表達量總體以較早移栽處理（T1、T2處理）較高。碳代謝關鍵酶基因對碳代謝產物合成和積累的影響主要在煙株進入旺長期以后，其中旺長期NtSS表達量與淀粉含量變化極顯著正相關。

4? 結論

對于云煙87大田期煙葉的碳代謝產物方面，隨著生育進程推進，云煙87旺長期、現蕾期煙葉中還原糖含量呈先升后降的趨勢，各移栽期處理的還原糖含量也呈先升后降的趨勢，T2處理煙葉還原糖含量在多數生育期處于較高水平；各移栽期處理的總糖含量的變化規律在各生育期都不盡相同，T2處理煙葉總糖含量在多數生育期處于較高水平；淀粉含量則隨移栽期推遲，在生育前期呈先降后升的趨勢，在生育后期呈先降后升再下降的趨勢。碳代謝酶活性方面，移栽后30～70 d，α-amylase活性最低的處理均為T3或T4處理，T2處理活性均為最高或第二高；在同一生育時期內，SS、INV、SPS活性最高的多數為T3、T4處理。碳代謝關鍵酶基因表達量方面，Ntα-amylase、NtSS表達量總體以較早移栽處理（4月10日、4月20日）較高。相關性結果分析表明，碳代謝產物含量、碳代謝酶活性及其關鍵基因表達量之間在不同生育時期均有不同程度的聯系。綜上，威寧黑石地區4月20日移栽，有利于碳代謝活動的進行。

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