基于廣泛靶向代謝組的桃果實衰老軟化過程差異代謝物篩選與鑒定

郭紹雷 許建蘭 張斌斌 張妤艷 沈志軍 馬瑞娟 俞明亮

摘要：篩選與鑒定參與調控桃果實采后貯藏過程衰老軟化相關代謝物質，以深入了解桃果實采后衰老軟化相關生理生化機制。常溫貯藏條件下，萘乙酸處理可加速霞暉8號七成熟桃果實衰老軟化，采用超高液相色譜串聯質譜技術，檢測桃果實貯藏0、3、6 d代謝物質的變化，選取差異倍數值（≥2或≤0.5），采用正交偏最小二乘判別分析模型所獲得的變量重要性投影值（≥1）的代謝物為差異代謝物。結果表明，在霞暉8號桃果實5組樣品中共檢測到816種代謝物，可被分為11類，其中檢測到酚酸類物質160種，占比最高。通過比較在各分組中代謝物定量信息的差異倍數變化前10的代謝物，結合KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析，篩選并鑒定到可能參與桃果實軟化的各種代謝物29種，其中脂質與酚酸類物質鑒定到最多，各有7種。

關鍵詞：桃果實；衰老軟化；代謝組；差異代謝物

中圖分類號：S662.101? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0198-08

收稿日期：2023-10-23

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-30）；江蘇省種業振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS[2021]082）。

作者簡介：郭紹雷（1988—），男，山東郯城人，博士，助理研究員，主要從事桃種質資源與新品種選育工作。E-mail：guoshaolei0305@126.com。

通信作者：俞明亮，博士，研究員，主要從事桃種質資源與新品種選育工作。E-mail：mly@jaas.ac.cn。

桃[（Prunus persica L.） Batsch]原產于中國，在世界多地廣泛栽種，依據聯合國糧食及農業組織統計（https：//www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL），2021年我國桃栽培面積和產量占全球比重超過50%，均位列世界第一。然而，桃是典型的呼吸躍變型水果。常溫下，成熟桃果實軟化迅速，不方便采運，貨架期較短，果實易損耗^[1]，造成重大經濟損失，是制約我國桃產業進一步發展的因素之一。桃果實衰老軟化相關機理的探究，將為桃果實采后保鮮技術的進步及耐貯新品種的選育提供理論依據。

乙烯的生物合成和信號轉導，以及下游的細胞壁降解，是存在于果實衰老軟化中的復雜生理生化過程^[2-4]。研究表明，乙烯可通過調控木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶、β-半乳糖苷酶、果膠甲酯酶以及多聚半乳糖醛酸酶等細胞壁降解相關酶活性，參與調控果實衰老軟化^[5-7]。還有研究表明，包括MADS-box、NAC、ERF等在內的轉錄因子，可通過調控乙烯生物合成或信號轉導，影響果實衰老軟化進程^[8-9]。在桃果實中，多聚半乳糖醛酸酶是決定果實衰老軟化進程的主要因素之一，通過外源乙烯處理桃果實，使多個多聚半乳糖醛酸酶家族基因成員的表達量，伴隨果實衰老軟化而顯著升高^[10]。乙烯響應因子PpeERF2可與PpePG1啟動子結合，負調控PpePG1的表達，進而影響桃果實成熟軟化^[11]。β-半乳糖苷酶與果實衰老軟化密切相關^[12]，桃β-半乳糖苷酶基因家族成員中PpBGAL2和PpBGAL16在不同肉質桃常溫貯藏過程中差異表達^[13]，且PpBGAL16可能受乙烯誘導參與桃果實衰老軟化^[14]。Gu等的研究表明，桃PpHB.G7轉錄因子可調控PpACS1和PpACO1編碼酶ACS與ACO活性，影響乙烯生物合成，對桃果實的成熟軟化起作用^[15]。生長素與乙烯相互作用調控果實衰老軟化成為當前研究的熱點。噴施萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，簡稱NAA）可使硬質桃迅速變軟，并提高乙烯生物合成中ACS1、ACS7與ACO3等基因的轉錄水平，增加乙烯釋放量^[16]。最近的研究表明，桃生長素響應因子PpIAA1可調控PpACS1的表達，影響乙烯釋放量，而乙烯響應因子PpERF4還可通過與PpACO1和PpIAA1啟動子結合，影響乙烯合成^[17]。桃生長素響應因子PpARF6可結合PpACS1和PpACO1的啟動子，激活其轉錄，促進乙烯的生物合成。蛋白水平上，PpARF6抑制PpEBF1/PpEBF2和PpEIL2/PpEIL3之間的相互作用，增強PpEIL2/PpEIL3蛋白穩定性，對PpACS1和PpACO1的轉錄激活作用增強，進一步促進乙烯合成^[18]。桃果實衰老軟化機制受多種因子調控，是一個復雜的調控網絡。目前，相關生理生化機制的研究大多集中在相關酶活的變化和關鍵基因調控研究。

廣泛靶向代謝組學通過建庫、檢測、分析等流程，完成對代謝物組分的鑒定和相對含量的分析，具有通量高、覆蓋廣、靈敏度與精度高的特點^[19-20]。目前該技術已廣泛應用于桃^[21-22]、葡萄^[23]、冬棗^[24]、茶^[25]等園藝作物上。桃果實常溫貯藏過程代謝組學的研究還鮮有報道，缺乏相關系統的研究，相關代謝機理仍需探究。本研究選取七成熟桃果實常溫貯藏6 d，通過NAA處理加快果實軟化，采用基于液質聯用的廣泛靶向代謝組學技術，鑒定和比較分析常溫貯藏過程中代謝物組分和相對含量，為桃果實采后保鮮技術的發展及耐貯藏新品種的選育提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本研究以桃品種霞暉8號果實為試驗材料，霞暉8號桃果實樣品取自江蘇省農業科學院果樹研究所桃試驗園，常規栽培管理。試驗于2021年進行，選取七成熟標準（果實完成膨大，底色未轉變）桃果實進行采收，采收后立即運回江蘇省農業科學院實驗室進行貯藏試驗。選取大小均一、無病蟲傷害的完好桃果實用于常溫貯藏試驗。根據Tatsuki等的方法^[26]，對桃果實進行NAA噴施處理，NAA噴施濃度為1 mmol/L（含0.01% Tween 20），對照組噴施0.01% Tween 20水溶液，噴施頻次間隔1 d。常溫貯藏試驗，溫度設為（25±1） ℃，相對濕度為75%～85%，貯藏0、3、6 d各取樣1次，對照組（CK，0、3、6 d），NAA處理組（NT，0、3、6 d），5個桃果實為1次重復，所有試驗進行3次生物學重復。桃果實樣品先去皮，后切成大小均勻塊狀，經液氮快速冷凍處理后，置于-80 ℃冰箱。

1.2? 硬度檢測

桃果實硬度檢測使用TA-XT Plus質構儀，使用直徑為8 mm的探頭在桃果實樣品腹縫線兩側中間部位進行檢測，檢測深度是5 mm，速率是 1 mm/s。

1.3? 代謝物提取

桃果實樣品先通過凍干機真空冷凍干燥，后將桃果實樣品磨成粉末。稱量0.100 g桃果實粉末，置于1.2 mL含70%甲醇的提取液中進行溶解。對提取液進行渦旋處理6次，頻次按照每30 min渦旋 0.5 min 進行。渦旋處理后的提取液放于4 ℃冰箱過夜。離心后，吸取上清液，吸取的上清液使用0.22 μm微孔膜過濾，用于檢測。

1.4? 色譜質譜方法

使用超高效液相色譜和串聯質譜（色譜儀，SHIMADZU Nexera X2；串聯質譜，Applied Biosystems 4500 QTRAP）進行數據采集。超高液相色譜使用的色譜柱為安捷倫SB-C₁₈，色譜柱的參數（1.8 μm，2.1 mm，100 mm）。其他液相色譜采集條件：分為A和B兩相，使用超純水（加入0.1%的甲酸）作為A相，使用乙腈（加入0.1%的甲酸）作為B相。洗脫梯度設置：開始后，B相占比5%，然后設置B相于 9 min 內占比勻速增至95%，保持1 min，設置B相11.10 min內占比減少至5%，并維持至14 min。液相色譜采集條件中，進樣量4 μL，流速保持在 0.35 mL/min，柱溫保持在40 ℃。主要的質譜條件：使用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS質譜系統，配置電噴霧離子源。設定電壓5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式），源溫度設定為 550 ℃，簾氣參數設定為0.172 4 MPa，碰撞誘導電離參數條件設定為高。

1.5? 代謝物定性定量分析

代謝物定性分析，以MWDB（Metware database）為數據庫，數據分析前需刪除包括含NH⁺₄、Na⁺、K⁺，與其他碎片離子在內的各種重復信號，以及產生的同位素信號。然后依據獲得的二級譜信息，完成物質的定性解析。通過三重四級桿質譜儀中的多反應監測模式，進行代謝物定量：目標物質的前體離子（母離子）最初利用四級桿獲得篩查，后使其經碰撞室誘導電離后形成碎片離子，然后，利用三重四級桿繼續篩查，獲取1個特征碎片離子。數據分析，首先獲取桃樣品檢測到的物質質譜峰，后對其峰面積進行積分。針對試驗中不同桃果實樣品中的同一個代謝物的質譜出峰，進行積分校正^[27]。

1.6? 數據處理與分析

確定差異代謝物的標準：代謝物的差異倍數值（Fold change，FC）≥2或≤0.5，采用正交偏最小二乘判別分析模型所獲得的變量重要性投影值（variable importance in projection，簡稱VIP）≥1^[28]。使用KEGG數據庫注釋和顯示差異代謝物^[29]。

2? 結果與分析

2.1? 桃果實常溫貯藏過程中硬度變化

霞暉8號七成熟桃果實隨常溫貯藏過程延長，對照組與NAA處理組硬度均下降。NAA處理后使霞暉8號七成熟果實硬度迅速下降，下降速度快于對照組（圖1）。

2.2? 桃果實常溫貯藏過程中代謝物種類鑒定

將七成熟桃果實噴施NAA常溫貯藏0、3、6 d，對照分別命名CK 0 d、CK 3 d、CK 6 d，處理組命名為NT 3 d、NT 6 d。經與數據庫比對分析發現，在霞暉8號桃果實5組樣品中共檢測到816種代謝物，可被分為11類（表1）。其中檢測到酚酸類物質160種，占比最高。脂質、黃酮類、氨基酸及其衍生物、有機酸占比較高。

2.3? 桃果實常溫貯藏過程各分組相對含量變化趨勢

為研究桃果實差異代謝物不同分組中的相對含量變化趨勢，將分組比較中的差異代謝物的相對含量進行標準化，隨后進行K均值聚類分析。如圖2所示，桃果實常溫貯藏過程中的代謝物相對含量變化趨勢共分為7組。第3組代謝物相對含量變化趨勢包含的差異代謝物有64種，該組中差異代謝物在對照組與處理組中均有上升趨勢，第5組中差異代謝物相對含量變化在對照組與處理組中均有下降趨勢，包含的差異代謝物有44種。各組所含代謝物數量有異同，其中第6組所含的差異代謝物也有64種，與第3組相同，第4組所含差異代謝物最少，只有8種。

2.4? 桃果實常溫貯藏過程中差異代謝物鑒定

比較在各分組中代謝物定量信息的差異倍數變化，鑒定對照組中的CK 0 d vs. CK 3 d、CK 3 d vs. CK 6 d，處理組中的CK 0 d vs. NT 3 d、NT 3 d vs. NT 6 d的差異代謝物，對上調前10位差異代謝物和下調前10位差異代謝物進行分析。由圖3可見，在對照組2分組CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d上調前10位差異代謝物中共鑒定到19種代謝物，其中溶血磷脂酰膽堿18∶4在對照組2分組中均是上調前10位差異代謝物。對照組2分組中下調前10位差異代謝物中共鑒定到18種，其中松柏醇、1-甲基腺嘌呤在CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d 2分組中均是下調前10位差異

代謝物。處理組2分組中共鑒定到上調代謝物20種，2分組中上調前10位的差異代謝物均不相同。處理組2分組中下調前10位差異代謝物中共鑒定到18種，其中松柏醇、溶血磷脂酰膽堿16∶1（2n異構）在處理組CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d 中均是下調前10位的差異代謝物。

對照組2分組鑒定到的19種與處理組2分組鑒定到的20種上調前10位差異代謝物取交集，共鑒定到10種代謝物：香蘭素乙酸酯、溶血磷脂酰膽堿16∶2（2n異構）、溶血磷脂酰膽堿16∶2、溶血磷脂酰膽堿18∶4、水飛薊素、溶血磷脂酰膽堿19∶1、4-乙基苯甲醛、7-羥基-4-甲基-8-硝基香豆素、10-羥基癸酸、5-甲氧基水楊酸。對照組2分組（18種）與處理組2分組（18種）下調前10位差異代謝物取交集，共鑒定到7種代謝物：松柏醇、溶血磷脂酰膽堿16∶1（2n異構）、溶血磷脂酰膽堿 18∶1 （2n異構）、2-羥基肉桂酸、丁香酸、L-甲硫氨酸、1-甲基腺嘌呤。鑒定到的代謝物信息見表2。

2.5? KEGG信號通路的差異代謝物聚類熱圖分析

KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析是根據差異代謝物的KEGG注釋信息，選擇至少含有5個差異代謝物的KEGG代謝通路，對所選的KEGG代謝通路中的差異代謝物的相對含量進行聚類分析，挖掘重要代謝通路中的代謝物在不同分組中的特性。由KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析（圖4），發現在對照組2分組CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d中共有上調代謝物7種，其中吲哚-3-乙酸同時在對照組2分組中上調。在對照組2分組中下調的代謝物共鑒定到9種，其中松柏醇在CK 0 d vs. CK 3 d與CK 3 d vs. CK 6 d中均為下調。在處理組2分組中CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d的KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析中上調代謝物共鑒定到22種，其中迷迭香酸、腺苷在處理組2個分組中均有上調趨勢。處理組2分組中下調代謝物共鑒定到21種，其中松柏醇、2-羥基肉桂酸在處理組2分組CK 0 d vs. NT 3 d與NT 3 d vs. NT 6 d中均下調。

對照組2分組中的7種與處理組2分組中的22種有上調趨勢代謝物取交集，共鑒定到5種代謝物：脫落酸、對香豆醇、迷迭香酸、腺苷-5′-單磷酸、尿嘧啶核苷。對照組2分組（9種）與處理組2分組（21種）有下調趨勢代謝物取交集，共鑒定到8種代

謝物：腐胺、松柏醇、磷酸烯醇式丙酮酸、黃苷、2-羥基肉桂酸、阿魏酸、L-甲硫氨酸、2-（甲酰氨基）苯甲酸。在KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析中篩選得到的代謝物信息見表2。

本研究通過代謝物定量信息的差異倍數變化和KEGG信號通路的差異代謝物聚類分析共鑒定到可能參與桃果實軟化的各種代謝物29種，其中脂質類和酚酸類各有7種，核苷酸及其衍生物有5種，有機酸類3種，生物堿2種，黃酮、木脂素和香豆素、氨基酸及其衍生物各1種，其他類2種（表2）。

3? 討論與結論

桃是世界上栽培最為廣泛的落葉果樹之一，我國桃產業在世界占有重要地位，近年來在栽培面積和產量上一直占比超過全球50%。然而，桃作為典型的呼吸躍變型水果，成熟后極易軟化，貨架期較短，運輸成本較高，損耗高^[1]，給種植者和銷售者帶來較大的經濟損失。桃果實衰老軟化的調控仍是桃產業發展需要應對的問題，與種植者、生產者營收與產業發展都息息相關。開展桃果實衰老軟化相關理論的研究能為降低桃果實采后損耗提供理論基礎，對桃產業的持續健康發展有重要意義。

在所有的脂質中，磷脂的種類豐富，也是構成細胞膜最主要的脂類物質。本研究7種脂質相對含量的變化，可能與桃果實衰老軟化過程中細胞膜的分解有關。酚酸類物質是主要的多酚類物質之一。植物中的酚類物質被認為是重要的次生代謝物質之一。研究發現，酚類物質在植物抗病蟲害、抗逆等多方面發揮作用^[30]，同時在果實中也具有重要的抗氧化能力^[31-32]。本研究篩選鑒定的7種酚酸類代謝物種，迷迭香酸隨著桃果實貯藏軟化過程有上調趨勢，多數酚酸類物質[松柏醇、2-羥基肉桂酸、丁香酸、阿魏酸、2-（甲酰氨基）苯甲酸]在桃果實貯藏軟化過程中有下調趨勢，對香豆醇則無明顯規律。朱辰暉等的研究表明，酚酸類物質能激活桃果實中多種抗氧化酶，能增強桃果實的抗氧化能力；使用對羥基肉桂酸，桃果實多酚對DPPH·和羥自由基清除能力得到加強，桃果實的成熟衰老得到延緩^[33]。阿魏酸在柑橘抗氧化活性中被鑒定為主要作用物質之一^[34]。因而這些酚酸類物質含量可能隨著桃果實衰老軟化進程逐漸減少，抗氧化活性減弱。吲哚-3-乙酸是常見的生長素類物質，在植物體內發揮著重要作用。Tatsuki等研究發現，硬質桃在成熟后幾乎不釋放乙烯，且吲哚-3-乙酸含量極低，而普通桃有大量乙烯釋放，吲哚-3-乙酸含量較高，表明乙烯的生物合成可能需要生長素介導^[26]。硬質桃中PpACS1的表達量和乙烯釋放量同時受NAA誘導增加，暗示吲哚-3-乙酸可介導乙烯合成^[35]。腐胺是植物體內多胺的主要種類之一。研究表明，外源多胺處理可下調桃果實乙烯合成相關基因表達，上調多胺合成相關基因的表達，促進果實多胺合成并降低乙烯釋放量和呼吸速率，延緩桃果實成熟衰老^[36]。張海燕等使用外源腐胺處理油桃，促使油桃超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶的活性提高，同時乙烯釋放量和呼吸釋放速率下降，果實硬度下降延緩^[37]。說明生物堿類物質吲哚-3-乙酸與腐胺在桃果實衰老軟化過程中起到重要調控作用。研究表明，桃果實成熟過程中，內源脫落酸的積累構成了果實成熟的啟動信號，而脫落酸高峰的出現啟動了果實的后熟衰老進程^[38]，本研究中脫落酸的相對含量變化趨勢符合上述結果。有研究表明，在桃果實成熟軟化過程中脫落酸可能也受到乙烯的調控，如乙烯可通過PpERF3調節脫落酸生物合成基因PpNCED2/3的表達從而促進其生物合成^[39]。其他代謝物質在桃果實衰老軟化進程中如何發揮作用還需要更深入的研究。本研究使用廣泛靶向代謝組學方法分析鑒定了29種代謝物質，可能參與桃果實軟化的進程，將為桃果實衰老軟化過程中的代謝物質研究提供參考。

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