糖尿病性視網膜病變的發病機制:miRNAs研究進展△

劉 彤 吳松笛

糖尿病性視網膜病變(DR),是糖尿病的主要微血管并發癥,預計到2045年,全世界DR患者將達到1.6億,其中4 480萬患者視力將受到影響。由于DR早期癥狀不明顯,易被患者忽略造成不可逆的視力損傷[1]。因此了解DR的發生發展機制,尋找診斷生物標志物尤為重要。微小RNAs(miRNAs)是一類內源性小分子非編碼RNA,具有序列保守性、表達時序性及疾病特異性等特點[2-3]。此外,miRNAs因其在血漿、血清、腦脊液及代謝產物中的可檢測性和穩定性,已成為疾病發生發展的重要生物標志物[4]。我國已有miRNAs相關檢測試劑盒獲批上市。miRNAs作為調節因子,靶向參與了DR的炎癥反應、氧化應激、細胞死亡及血管新生等病理性過程,并在其中起重要的調控作用[5-6]?，F就miRNAs在DR中發揮的調控作用進行綜述,為DR的診斷、預后判斷及治療提供參考依據。

1 miRNAs及其作用機制

miRNA是由20～24個核苷酸組成的一類內源性小分子非編碼RNA[2,7]。miRNA經RNA聚合酶II轉錄為含有一個莖環結構的初始miRNA(pri-miRNA),后者經細胞核內的微處理復合物剪切形成前體miRNA(pre-miRNA),并被轉運至細胞質中,經識別、剪切及修飾后形成miRNA二聚體,隨后一條鏈被降解,另一條鏈形成成熟的miRNA[8-9]。成熟的miRNA形成的誘導沉默復合物與靶位點3’UTRs序列結合發揮調控基因表達的作用[7]。

2 DR簡介

《我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南(2022年)》中指出,DR是一種慢性進行性致盲性眼病,是因長期高血糖導致的視網膜微血管損害,并同時合并視網膜神經膠質網絡病變的糖尿病視網膜并發癥[10]。臨床上DR被分為2個階段,即以血管透性增強、毛細血管閉塞為主要特征的非增生型DR(NPDR)和以視網膜血管新生為特征的增生型DR(PDR)[11]。長期高血糖引發的視網膜炎癥、血管生成、氧化應激及細胞死亡等病理性過程與DR發展的潛在作用機制有關[5]。

3 miRNAs與DR相關研究

3.1 miRNAs與氧化應激

正常代謝過程中,機體通過抗氧化酶和非酶抗氧化劑調控抗氧化系統的防御機制以維持氧化還原穩態,當活性氧(ROS)的產生超出系統防御能力范圍時,穩態被打破引發氧化應激[12]。糖尿病患者視網膜處于高糖環境,多元醇途徑、己糖胺途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑及晚期糖基化終產物積累等代謝異常途徑可直接或間接產生過量的ROS,引發或加重細胞的氧化應激,進而使線粒體功能紊亂,視網膜組織功能受損,加劇DR發展[13-14]。

miRNAs可通過介導與氧化應激有關的酶、轉錄因子及相關通路等方式來調控DR中的氧化應激水平[5]。Chen等[15]通過轉染的方式在高糖誘導的視網膜色素上皮(RPE)細胞內表達miR-455-5p,檢測到細胞中ROS、丙二醛及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)含量減少,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶的含量增加,從而減輕細胞氧化損傷,該過程是通過miR-455-5p介導抗氧化酶活性調控氧化應激水平來實現的。在DR大鼠Müller細胞中,miR-365主要定位于內核層,當氧化應激加重時,miR-365含量增加,細胞膠質化程度加劇,該過程與miR-365負調控靶基因基質金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP3)有關,而TIMP3的表達可減輕氧化應激,當抑制Müller細胞中的miR-365表達時,細胞膠質化程度減輕,氧化應激減弱[16]。核因子E2相關因子2是抗氧化應激調控的關鍵轉錄因子,也是miR-489-3p的靶基因,lncRNATPTEP1的過表達可通過miR-489-3p/核因子E2相關因子2軸減輕細胞氧化應激和抑制細胞增殖,從而對DR的發展起到抑制作用[17]。Yu等[18]發現,在DR相關人視網膜微血管內皮細胞(hRMECs)模型中,circ-UBAP2高表達,其作為miR-589-5p的“分子海綿”間接促進了早期生長反應蛋白1的表達,而后者可促進細胞氧化應激及細胞功能性障礙;當敲低circ-UBAP2表達時,miR-589-5p競爭性抑制作用部分解除,早期生長反應蛋白1表達受阻,細胞的氧化應激和細胞功能性障礙得到緩解。Tu等[19]研究發現,利用褪黑素介導母系表達基因3/miR-204/沉默信息調節因子2相關酶1(SIRT1)軸可促進叉頭框蛋白O1的去乙?；饔?進而減輕DR模型中Müller細胞的氧化應激水平。在DR細胞及動物模型中,miRNAs可通過調控高糖引起的代謝異常途徑中的關鍵酶、中間產物及轉錄因子的表達來緩解氧化應激水平。

3.2 miRNAs與炎癥反應

DR屬于慢性低度炎癥。長期高血糖刺激所引發的炎癥反應造成視網膜缺血缺氧,促進DR發生發展。炎癥反應與炎癥相關因子、炎癥信號通路及炎癥細胞的調控有關[20]。

miRNAs可通過介導炎癥相關分子或炎癥細胞的形式來調控DR模型中的炎癥水平[6]。miR-455-5p在高糖誘導的RPE細胞(ARPE-19)中通過靶向調控細胞因子信號抑制因子-3來降低細胞中IL-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量,從而發揮抗炎作用[15]。高糖誘導的ARPE-19中,miR-19b高表達,可促進IL-1β、IL-6及TNF-α的表達,該過程是通過miR-19b與靶基因SIRT1結合,抑制后者表達來實現的,而過表達的lncRNAH19可競爭性結合miR-19b,從而減輕細胞的炎癥反應[21]。miR-30c-5p可調控PLCG1的表達,后者表達上調可阻斷PKC/核轉錄因子-κB(NF-κB)通路。He等[22]通過臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)-外囊泡(EVs)轉運miR-30c-5p方式減輕了DR模型中人視網膜內皮細胞(hRECs)的炎癥反應。具有抗氧化作用的褪黑素還可通過母系表達基因3/miR-204/SIRT1軸介導NF-κB p65亞基的去乙?；?從而降低DR模型中Müller細胞的炎癥反應[19]。在DR大鼠模型中,miR-124可通過下調轉錄因子PU.1及脂筏蛋白Flot1的表達來抑制小神經膠質細胞過度激活,從而減少IL-1β、TNF-α、Cd74、C-C基序趨化因子配體2、C-C基序趨化因子配體3及血管細胞黏附分子1等因子的產生,減輕炎癥反應,改善神經視網膜功能[23]。miRNAs可通過直接或間接降低炎性因子的表達或阻斷NF-κB等炎癥相關通路來減輕炎癥反應。

3.3 miRNAs與血管新生

血管生成因子和抗血管生成因子之間平衡的打破是NPDR發展成PDR的關鍵,其中主要的血管生成因子有血管內皮生長因子(VEGF),其可介導缺血誘導的視網膜新生血管形成[5]。

研究發現,與NPDR患者相比,PDR患者血清中miR-15b的含量更低、VEGF含量更高,而在DR的hRMECs模型中,miR-15b增加可抑制血管新生,其機制是通過miR-15b負調控下游靶基因VEGF表達來實現的[24]。Xiao等[11]研究發現,敲低miR-423-5p表達可抑制高糖誘導的hRECs及hRMECs中血管新生,該過程是通過miR-423-5p負調控下游靶基因同源結構域相互作用蛋白激酶2的表達實現的,而后者可介導與視網膜血管生成密切相關的缺氧誘導因子-1α/VEGF信號通路。Wang等[25]發現,PDR小鼠視網膜組織中miR-30b表達上調,而在高糖誘導的RMECs模型中,敲低miR-30b表達可通過上調SIRT1的表達來減少VEGF的表達并抑制血管新生。通過檢測DR的ARPE-19細胞模型中凋亡標志物Bcl-2、Bax及Caspase-3,Chen等[15]發現,miR-455-5p還可通過靶向細胞因子信號抑制因子-3對血管新生起抑制作用。miRNAs可通過直接或間接介導VEGF的表達來調控血管新生。

3.4 miRNAs與細胞凋亡

DR發展過程中,如不及時干預血-視網膜屏障損傷會導致患者視力喪失,而血-視網膜屏障損傷與炎癥反應引發的周細胞、內皮細胞及RPE細胞凋亡關系密切[26]。

去乙?；窼IRT1參與了細胞凋亡調控過程,在DR大鼠模型中,沉默miR-34a表達可通過介導下游靶基因SIRT1的表達起到促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[27]。DR大鼠及ARPE-19細胞模型中,miR-200a-3p表達下調,當增加miR-200a-3p表達量時,細胞的凋亡程度和炎癥反應得到緩解,其機制是過表達的miR-200a-3p可通過負調控下游靶基因轉化生長因子-β2(TGF-β2)對TGF-β2/Smad通路起到阻斷作用[28]。同樣是DR的ARPE-19細胞模型,miR-320b可通過介導Timp3的表達來調控高糖誘導的細胞凋亡及炎癥反應,添加miR-320b抑制劑或過表達Circ_NNT,TIMP3水平升高,細胞凋亡及炎癥反應減輕[29]。在DR大鼠及hRMECs中注入hUCMSCs-EVs后,炎性反應及細胞凋亡受到抑制,Xu等[30]對hUCMSCs-EVs中的miRNAs進行了差異性分析,發現69個miRNAs表達存在差異性,經驗證,miR-18b表達差異顯著,研究顯示,miR-18b可通過負調控絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶1表達抑制NF-κB p65的磷酸化,發揮抗炎及抗凋亡作用,從而緩解DR的發展。miRNAs可通過調控SIRT1、TGF-β2及TIMP3等基因的表達抑制細胞凋亡。

3.5 miRNAs與細胞焦亡

炎性細胞壞死,又稱細胞焦亡,是一種新型細胞程序性死亡,其與炎癥小體及Caspase-1的激活有關[31]。研究顯示,DR模型中內皮細胞、周細胞、Müller細胞、小膠質細胞及RPE細胞等多種視網膜細胞均可發生焦亡[6]。

Gu等[32]發現,miR-192可通過負調控下游靶基因FTO的表達來抑制高糖引起的RPE細胞焦亡,其中FTO的表達與NLRP3的甲基化修飾有關。DR的RPE細胞模型中,下調miR-590-3p表達可促進細胞焦亡,該過程中miR-590-3p可負調控下游靶基因NOX4及NLRP1,作者推斷NOX4對細胞焦亡的調控可能與ROS/硫氧還蛋白相互作用蛋白/NLRP3軸有關,具體調控機制還需進一步研究[31]。Xi等[33]在細胞焦亡相關機制研究過程中發現,DR細胞模型中ROS的產生可促進細胞焦亡,而過表達miR-130a可通過TNF-α/超氧化物歧化酶1/ROS軸來緩解細胞焦亡。在DR細胞模型中發現,lncRNA MIAT與GSDMD-N表達均增加,而GSDMD-N的表達對細胞焦亡有促進作用,當敲低lncRNA MIAT表達水平時,可部分解除對miR-342-3p的競爭性抑制作用,而后者可通過負調控Caspase-1的表達來緩解細胞焦亡[34]。miRNAs可通過介導凋亡小體及Caspase-1表達來調控細胞焦亡。

3.6 miRNAs與鐵死亡

鐵死亡是一種鐵依賴性的多不飽和脂肪酸過氧化所導致的新型細胞程序性死亡。研究顯示,鐵死亡在糖尿病及DR的發展中起重要作用[6]。

溶質載體家族1成員5主要參與L-谷氨酰胺的轉運和代謝過程,高糖誘導的RPE細胞中,miR-338-3p表達上調,其可通過負調控溶質載體家族1成員5表達來介導細胞鐵死亡,從而加劇DR發展[35]。DR的ARPE-19細胞模型中,表達上調的circ-PSEN1可通過miR-200b-3p/CFL2軸促進細胞鐵死亡[36]。分子?；o酶A合成酶長鏈家族成員4是鐵死亡調控因子之一,也是miR-7-5p的下游靶基因,lncRNA ZFAS1可通過ZFAS1/miR-7-5p/分子?；o酶A合成酶長鏈家族成員4軸激活高糖誘導的hRECs鐵死亡[37]。DR發展中,miRNAs可通過介導與細胞鐵死亡有關的調控因子發揮作用。

4 結束語

在DR的發生發展過程中,miRNAs作為調控因子,可通過調控氧化應激、炎癥反應、血管新生及細胞死亡等病理過程中的關鍵酶、轉錄因子、產物或相關通路來發揮重要作用。其中,circRNAs和lncRNAs作為miRNAs的分子海綿介導下游靶基因的表達以及外泌體轉運miRNAs的相關研究已成為研究熱點。除上述細胞死亡方式外,DR中泛凋亡的研究也引起了學者的重視,但有關miRNAs在其中的調控作用還未見報道[38]。通過對miRNAs調控作用的研究,不僅為DR相關病理過程的機制研究提供思路,還可為輔助診斷和預后判斷生物標志物的尋找提供更多可能。然而,現有研究也面臨著一些困難,如miRNAs調控靶基因的復雜性、臨床樣本量較小的局限性、提取檢測以及驗證方法的差異性及建模的不一致性等[39-40]。因此,有關miRNAs簇的調控研究、多中心臨床合作、提取檢測方法標準化及新模型的構建將被予以重視。未來,隨著表觀遺傳學和生物醫學工程的發展,miRNAs在DR領域的研究或將上升至細胞間串擾及基因靶向治療。