豬偽狂犬病疫苗研究概況

李雅雯,張 莉,丁向彬,鄢明華*

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院,天津 300384;2.天津市農業科學院畜牧獸醫研究所,天津 300381;3.國家動物疫病天津觀測實驗點,天津 300381;4.天津市畜禽健康養殖技術工程中心,天津 300381)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是一種人畜共患傳染病的重要病原,可感染豬及多種家畜和野生動物[1]。豬感染該病毒以后,臨床表現以母豬懷孕中期流產、產死胎、木乃伊胎等繁殖障礙,哺乳仔豬出現神經癥狀和高死亡率等特征。PRV的傳染性強,發病后常常給豬群造成較為嚴重的經濟損失,我國將其列為三類動物疫病[2]。1948年我國第一次報道豬偽狂犬病,隨后該病在我國大部分地區呈地方性流行。20世紀90年代我國引進Bartha-K61基因缺失疫苗并大規模推廣應用后,豬偽狂犬病得到了較好的控制。但在2011年后由于PRV流行毒株的變異使我國再次大暴發,給養豬業造成了巨大經濟損失[3]。當前我國豬偽狂犬病的主要防控方法仍是疫苗免疫接種,關于豬偽狂犬病變異株疫苗的研究受到廣泛關注,本文對PRV疫苗的種類和當前研究現狀等方面進行了綜述。

1 PRV的基因結構特征

PRV是一種由病毒核心、衣殼、被膜和囊膜組成的雙鏈線DNA病毒[4],屬于皰疹病毒科水痘病毒屬。PRV的基因組由長獨特短區(UL)、短獨特區(US)、US兩側末端反向重復序列TRS和內部重復序列IRS組成,并包含了約70多個開放閱讀框編碼的多種蛋白[4]。gE、gI、TK是PRV的主要毒力基因, gB、gC、gD是其主要保護性抗原蛋白。研究表明, PRV編碼基因中有一多半是病毒復制非必需基因,可通過缺失多個或部分非必需基因來降低病毒毒力,同時又能插入外源基因形成重組病毒,因此PRV被認為是一種理想的活病毒載體[5]。

2 PRV疫苗研究

2.1 滅活疫苗

20世紀90年代初分離篩選到PRV鄂A株,但由于該株疫苗的抗原是用 PRV全病毒,無法通過抗體檢測來辨別免疫動物和受野毒感染的動物,因此在市場應用中受到較大的限制。直到2012年田克恭團隊篩選出1株PRV變異毒株HN1201株,利用同源重組技術構建的gE基因缺失疫苗株((HN1201-ΔgE株),可有效地預防由流行株引起的PRV感染,該缺失株可誘導產生中和抗體水平較高,能有效地延緩或阻止gE抗體轉為陽性阻止排毒,有利于預防和控制當前豬群中流行的豬偽狂犬病[6]。2019年和2021年我國分別批準了HN1201-ΔgE株和HNX-12株疫苗上市。

PRV滅活疫苗是將培養的PRV進行滅活并加入佐劑乳化制備。其優點是安全性好,接種后不會出現排毒現象,但接種滅活疫苗的免疫抗體持續期較短,通常需要多次接種才能取得較好的免疫效果[7]。由于多次免疫一方面會對動物機體產生更大的應激反應,另一方面會成倍增加工人的勞動強度和生產成本,導致此類疫苗在實際生產中推廣應用受到較大的限制。

2.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是由PRV的保護性抗原基因在原核或真核細胞中的表達產物制成的疫苗。gB、gC、gD等糖蛋白可以誘導機體產生的中和抗體在沒有補體的作用下在動物機體內均能抑制PRV,因此gB、gC、gD等糖蛋白成為研制PRV亞單位的首選蛋白[8]。20世紀90年代左右分別有不同團隊研發出誘導機體表達中和抗體的亞單位疫苗[8],并可預防 PRV所致的母豬流產及仔豬死亡。通過對優化PRV gD胞外區密碼子構建pCAGGS-PRV-gD真核表達載體并純化重組蛋白,被重組蛋白3次免疫的小鼠機體中產生較高水平的抗體[9],為后續研發PRV亞單位疫苗奠下基礎。有研究用PRV SA強毒株擴增出的gB基因與pET-28a載體相連構建表達質粒,抗原與不同佐劑配比制備的亞單位疫苗,證明gB/0il疫苗免疫保護率可達60%[10]。因亞單位疫苗只表達PRV的部分免疫原蛋白,整個過程不需要接觸活病毒,不會有潛在散毒風險,有安全性更好、抗原純度更高、穩定性更好以及容易和野毒進行鑒別等特點,在豬偽狂犬病的免疫和凈化中具有良好的應用前景。但由于此類疫苗需要更高的抗原含量才能誘導機體產生足夠的免疫保護,在實際應用中生產成本較高,目前均處于研究階段,尚無商品化的疫苗獲批上市銷售。

2.3 弱毒疫苗

2.3.1 自然弱毒疫苗 在20世紀60年代國外學者就對PRV弱毒疫苗進行了研究,采取不同的方法制備PRV弱毒株疫苗,這些毒株共同點是通過gE基因的全部或部分缺失來達到使疫苗株毒力減弱的目的[7]。我國直到20世紀90年代從匈牙利引進自然弱毒株Bartha-K61疫苗株并成功研制疫苗,該疫苗株通過缺失整個gE、部分gI基因和gC部分位點突變來使PRV的毒力降低[11],同時保留了病毒株的免疫原性,并且可通過gE的抗體檢測鑒別PRV的野毒株感染和疫苗株免疫。該疫苗株在注射后第7天可產生抗體,注射后第5周抗體水平達到峰值并可持續2個月以上。但在2011年后隨著PRV變異,Bartha-K61株疫苗不能提供完全的免疫保護,因此國內多個團隊開始對PRV變異株展開研究。

2.3.2 基因工程疫苗 隨著生物技術的發展,通過基因工程手段對PRV的某些毒力基因進行定向敲除從而得到毒力較低、免疫原性好且安全的PRV基因工程疫苗成為研究熱點。目前已報道在我國上市的疫苗中有利用基因工程技術制備出的PRV弱毒疫苗,包括HB-98株、HB-2000株、SA215株等在臨床上都具有較強的免疫原性和安全性。除此之外,我國很多學者利用同源重組技術、細菌人工染色體技術(BAC)、Cre/lox P位點特異性重組技術和CRISPR/Cas9等基因編輯技術對PRV的變異株進行研究。

2.3.2.1 基因同源重組技術 基因同源重組技術是指在同源基因序列中DNA分子間或分子內進行重新組合[12]。20世紀末就有學者利用同源重組技術將PRV Fa株進行基因敲除,構建了PRV TK單基因缺失株,被免疫后小鼠可抵抗Fa株強毒的攻擊。2011年后因為PRV變異,有研究分別利用同源重組技術構建了不同PRV變異株的基因缺失株,分別接種到易感動物體內,都具有較好的免疫原性和安全性[13]。用PRV變異株(QYY2012株)擴增US3基因作為同源臂構建了含EGFP的重組轉移載體,轉移載體和 PRVΔTK/gE株基因組共轉染239T細胞,經Cre酶去除EGFP后構建的PRVΔTK/gE/US3缺失株具有良好的免疫原性,能作為優秀的PRV基因工程疫苗侯選毒株[14]。隨著同源重組技術現發展逐漸成熟也更加穩定,但是病毒重組效率低,重組病毒純化過程比較繁瑣等不足,近年來在人類和動物疫苗的研究中應用逐漸減少,呈現被基因編輯等新技術取代的趨勢。

2.3.2.2 細菌人工染色體技術 細菌人工染色技術是將PRV的基因組插入到BAC載體中,同時借助人工染色體對基因組進行保存和修飾[13]。PRV在機體內病毒復制比較慢,利用基因同源重組的方法構建重組病毒的過程比較復雜,而且純化的過程也很耗時。而在大腸埃希氏菌中PRV的克隆能以單拷貝數或極低拷貝數的質粒進行復制,這種方法不易發生變異、效率高且更加準確,可成功制備出重組病毒。有研究分別利用該技術構建了強毒分離株PRV-ZJ株和重組病毒rvPRVBAC株[13]。利用細菌人工染色技術構建了HN1201TK-/gE-/gI-株,該毒株接種易感動物體后具有良好的免疫原性和安全性。用酶切技術對PRV基因組進行線性表達轉染細胞后,發現該病毒生長特性與野毒基本一致且能穩定遺傳[15]。在構建PRVAH02LA株BAC時,用 gE和gI基因位點取代成mini-F基因,成功獲得了PRV AH02LA BAC[16]。但是BAC的構建復雜周期長,大基因組在克隆過程中會出現斷裂,有可能在病毒的基因組中出現細菌基因組的殘留,影響疫苗的生物安全。

2.3.2.3 Cre/lox P位點特異性重組系統 Cre/lox P位點特異性重組技術來自大腸埃希氏菌噬菌體P1中,其中包含了特異性Cre重組酶和loxP位點[17],該技術僅適合在特定的基因位點間進行特異性重組,該方法可有效地解決由隨機整合引起的不確定因素,為建立一個穩定、高效的基因表達體系打下基礎。利用Cre/lox P系統構建了含有單一lox P位點的TK單基因缺失株(rPRV2),結果表明插入loxP位點對病毒復制無顯著影響,缺失TK基因后毒力大幅下降[18]。有研究首次利用該技術構建了gE單基因缺失株,再用相同的方法獲得了PRV gE-/TK-株[19]。該雙基因缺失株的半數致死量顯著高于只缺失gE基因的毒株和野生毒株,且對小鼠有80%的免疫保護率。由此可見Cre/lox P系統能重復構建PRV多基因缺失株,為PRV基因缺失苗和載體疫苗快速檢測或篩選提供了有效技術手段。

2.3.2.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術 CRISPR/Cas9基因編輯技術是通過入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相應的CRISPR RNAs(crRNAs)將同源序列降解,為機體提供免疫能力。與傳統的基因同源重組技術相比,它可以高效穩定的對基因組特定位點進行靶向修飾,提高修飾效率[20]。用CRISPR/Cas9及Cre/lox技術敲除PRV HNX病毒株的gE、TK基因,免疫保護試驗表明雙基因缺失株有較高的免疫保護能力,能抵抗親本毒株的侵襲[21]。以PRV經典疫苗株Bartha-K61為骨架,通過該技術將gB基因替換為PRV變異株JS-2012的gB基因,獲得重組病毒r PRV-BJB,發現重組毒株與疫苗株具有相似生長特性和蝕斑形態[22],能作為新型疫苗的備選株。利用該技術構建不同的PRV基因缺失株均具有較好的免疫保護能力,同時也為野生動物PRV基因工程疫苗的研制建立了一種高效的技術平臺[23-24]。利用CRISPRE/Cas9基因編輯技術構建gE、gI、TK三基因缺失株,在免疫保護試驗中三基因缺失株對親本株PRV HeN1免疫保護率可達到100%,又成功構建能同時表達EGFP和Luciferase的雙報告基因的重組病毒[25],可用于篩選sgRNA和抗病毒藥物,證明了CRISPR/Cas9技術能成為治療PRV的新型治療手段[26]。利用CRISPRE/Cas9技術快速構建1株PRV單基因缺失株(PRV-1-ΔgE)[27],用CRISPRE/Cas9和Cre/lox P聯合技術分別構建HNQYY2012ΔgE株[28]與rGXΔTK-/gE-/gI-株[29],被這兩基因缺失株免疫的機體均能抵御親本株入侵。用改造的偶聯Cas9 D10A的pX335打靶載體,構建雙sgRNA和Cas9蛋白共表達的單質粒打靶系統,并通過兩質粒打靶系統構建出了PRV SX-10-2015-GM-CSF-eGFP-mCherry-ΔTK-ΔgI/gE重組病毒,該重組病毒具有較高的安全性且對小鼠具有100%免疫保護能力,能誘導小鼠機體產生更強的免疫應答能力,可作為疫苗的侯選毒株[4]。

3 總結

PRV疫苗在豬偽狂犬病的防控和凈化中發揮了重要的作用。2011年以來,由于PRV流行株的突變,一些傳統疫苗株對PRV變異株的攻擊不能提供完全保護,導致PR在我國許多地區大規模流行。迄今,國內已有多個團隊以PRV為骨架,應用基因工程方法成功構建了多種基因缺失的重組PRV毒株,為進一步研制PR疫苗奠定了基礎。當前,研究開發針對PRV變異株的高效疫苗已經成為動保行業的研究熱點,其中可用于PR免疫和凈化的基因工程標記疫苗的研究尤為受到關注。由于基因編輯技術展示出免疫原性好且安全的特點,在動物病毒疫苗的研究中得到越來越廣泛地應用,并有望在PRV標記疫苗和以PRV為骨架的多聯多價疫苗的研究中取得更多的成果。