馬鼻疽診斷技術的研究現狀

彭明媛,王 楠,李巧玲,張曉茜,李俊平,牛瑞燕,徐 磊*

(1.山西農業大學動物醫學學院,山西晉中 030801;2.中國獸醫藥品監察所,北京 102600)

馬鼻疽(Glanders)病原菌為鼻疽伯克霍爾德氏菌,我國稱為鼻疽桿菌。該病潛伏期從數天到數月不等,臨床上分為急性和慢性兩種類型,主要侵害成年馬匹的呼吸系統(鼻型、肺型)、淋巴系統及皮膚,以鼻腔、喉頭、氣管黏膜或皮膚形成鼻疽結節、潰瘍和瘢痕,在肺、淋巴結或其他實質器官發生鼻疽性結節為特征[2]。該病無季節性,一年四季都可發生,使役過度、廄舍擁擠、營養不良、感冒和創傷均可誘發本病[3]。 鼻疽桿菌可通過食物、氣溶膠或皮膚傳播給易感宿主,并能在動物間、動物和人之間傳染,但人與人之間的傳播較為罕見[4]。因其具有較高的氣溶膠感染風險,曾被濫用于生物戰爭[5]。有報道美國、日本曾有實驗室人員感染馬鼻疽的病例[6],2021年也發生了一起人類感染病例[7]。目前沒有針對馬鼻疽的商業化疫苗,患病動物若不接受抗生素治療,其病死率很高[8]。

通過血液檢測、全面撲殺陽性動物和貿易限制,西歐、北美洲、日本等大多數地區已宣布消滅了馬鼻疽,亞洲、中東、非洲和南美洲部分地區依然存在[9-10]。我國已基本消滅了馬鼻疽,但在2018年8月,重慶市沙坪壩區發生馬鼻疽疫情[11]。該病流行的原因主要與邊境貿易檢疫不當有關,應加大邊境口岸對馬鼻疽的檢疫力度。本文就馬鼻疽的診斷方法進行歸納總結,為該病的診斷提供參考。

1 病原分離鑒定

該菌是一種不運動的革蘭氏陰性菌,顯微鏡下呈兩端鈍圓、無芽孢、無莢膜的桿狀[12],在4%甘油瓊脂中形成乳白色黏性、小圓形的光滑菌落。鼻疽桿菌可從患病動物未破損或未受污染的淋巴結、皮膚結節和血液中分離,含3%甘油的腦心浸潤瓊脂可用來大量培養鼻疽桿菌[13]。該菌在大多數培養基上生長緩慢。BM選擇性瓊脂培養基可以鑒別伯克霍爾德氏菌屬與其他屬細菌[14],鼻疽桿菌大多能在48 h內生長良好,形成圓形、紫色、光滑、大于1 mm的菌落,可用于臨床復雜環境中分離病原。

2 分子診斷技術

2.1 聚合酶鏈反應

鼻疽假單胞菌屬具有較近親緣關系,鼻疽桿菌和類鼻疽伯克菌臨床交叉反應較高,普通檢測方法無法區分,通過分子檢測技術進行鑒別,聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是目前運用較多的方法之一。用鼻疽桿菌趨化性motB蛋白的移碼突變設計一種用熒光標記引物的傳統雙鏈PCR方法[15],具有100%的特異性,能明確區分鼻疽桿菌和類鼻疽伯克菌。一種基于2種β內酰胺酶基因設計混合引物,能鑒別類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼻疽桿菌和泰國芽孢桿菌的多重PCR[16],可檢測6023～9561個基因組當量,具有較高特異性和敏感性。

馬鼻疽的分子診斷研究結合生物信息學,不僅具有高特異性,還有利于馬鼻疽流行病學的調查。將補體結合試驗檢測為陽性的馬,分離培養得到菌株,基于aroA基因進行實時熒光定量PCR(qPCR)擴增,結果顯示陽性,并結合多位點序列分型和單核苷酸多態性方法建立系統發育樹,確定該菌株與中東地區分離的鼻疽桿菌具有較高親緣關系?；?PCR 系統進行馬鼻疽分子診斷對于該病原的遺傳進化關系具有重要意義,特別是在馬鼻疽流行但尚未確定基因型的地區[17]。比較3種qPCR方法,通過基因比對發現一段鼻疽桿菌特有序列,并以此設計引物進行檢測[18]。3種qPCR均具有良好特異性和重復性,但不同方法對結果的評判Cq值標準不一,還需臨床標準樣本對可疑結果進一步評估。

PCR方法具有很強的特異性,與基因組學相結合不僅可以作為有力的確診手段,還能分析菌株的家族關系及流行特點,有利于對馬鼻疽的進一步防控。但PCR反應系統的復雜性,試驗環境要求較高,不適合臨床快速診斷,可作為臨床樣本輔助診斷技術。

2.2 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術易操作、成本低、檢測迅速,可作為PCR的替代方法。LAMP技術具有高特異性和靈敏度,可檢測出≥250 fg的鼻疽桿菌基因組DNA和≥100個含有目標DNA序列的重組質粒[19]。該方法有望成為偏遠地區代替PCR的更便捷的檢測技術。LAMP 技術和實時熒光定量 PCR 技術相比,由于鼻疽桿菌基因組中存在豐富的G-C區域,并且在等溫條件下的二級結構,其重復性不如實時熒光定量 PCR[20]。

3 鼻疽菌素試驗

鼻疽菌素利用變態反應,通過鼻疽桿菌提純鼻疽菌素進行點眼反應,在受感染的動物中,眼瞼在1～2 d內明顯腫脹,以此診斷是否感染鼻疽桿菌。點眼試驗是我國《馬鼻疽診斷技術》檢測規程中指定的檢測技術之一,該方法不僅操作簡便,而且特異性及檢出率高,適用于偏遠地區大批次的集中檢疫。對于急性、開放性及慢性的鼻疽馬均具有很高的診斷價值,尤其是進行5～6 d的間斷反復點眼檢疫[21]。鼻疽菌素試驗對急性和慢性病例陽性準確率達92%,對年邁病例診斷為陰性結果的準確率為96%。在臨床老年病例中,假陽性反應可能與鏈球菌等感染有關[13]。對沒有臨床癥狀的慢性馬鼻疽以鼻疽菌素點眼作為主要檢查方法,血清學為輔助檢查方法[22]。近年來,世界動物衛生組織(WOAH)已經不建議進行馬匹的點眼試驗,但其在臨床上的應用并未減少,其實用性目前無可取代。

4 血清學診斷

4.1 補體結合試驗

馬鼻疽是WOAH規定的必須通報的人獸共患傳染病,早期發現和控制該病,對國際貿易和當地經濟至關重要。補體結合試驗(complement fixation test,CFT)被列為國際貿易指定的最準確和可靠的血清學試驗之一[23]。雖然在老年、妊娠或疲憊動物的血清中偶爾會出現假陰性結果,其假陽性率大約占1%(可能由于使用全細胞的粗制抗原),但補體結合試驗具有極好的敏感性,能夠檢測臨床上隱性感染、慢性感染和早期階段,減少疾病的傳播和暴發[24-25]。

4.2 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)被WOAH 推薦用于國際貿易中的馬鼻疽檢疫,不同的包被抗原表現出不同的敏感性和特異性,主要包括全菌、蛋白質和膜脂多糖等,以重組蛋白居多,表現出較強的特異性?；谥亟M截斷鼻疽桿菌胞內運動A蛋白的間接ELISA[26],其靈敏度和特異性分別可達100%和98.88%。該方法操作簡單,耗間短,結果準確,受人為因素干擾少,適用于大規模檢測。通過將BCAL2737a基因表達的3種蛋白進行o-糖基化系統合成保守三糖聚糖,并選其中一種糖蛋白作為包被抗原,結果顯示出100%的特異性和至少88%的敏感性[27]?；谶@些保守的糖基化蛋白,表現出高度的特異性,為馬鼻疽的診斷提供了新的方向。對比雙抗原夾心 ELISA 方法和CFT 發現,因其特有的雙抗原,其特異性為99.8%,高于 CFT 97.0%的特異性,并且具有很好的敏感性,可作為馬匹貿易中血清學檢測可行的替代方法[28]。

針對鼻疽桿菌脂多糖的單克隆抗體被開發用于馬鼻疽 C-ELISA 抗體檢測方法的建立[29],該方法具有高特異性和敏感性,能鑒別鼻疽桿菌屬和其他屬別的細菌,但不能區分鼻疽桿菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌,二者具有相似的臨床表現、形態學和等位基因圖譜。目前的ELISA檢測方法不能區分二者,該方面的探索還需不斷完善。

4.3 虎紅平板凝集試驗

虎紅平板凝集試驗(rose bengal test,RBT)是一種快速簡單的方法,需要從鼻疽桿菌培養物中純化抗原[30]。RBT具有和鼻疽菌素試驗同等的特異性,但敏感性高于鼻疽菌素試驗,RBT的敏感性約為90%,鼻疽菌素試驗的敏感性為75%。鑒于RBT操作簡單、快速和準確,可作為野外條件馬鼻疽病診斷的一種補充試驗[31]。由于在以往的研究中都用了粗抗原,因此需要用純化的抗原(囊狀抗原或脂多糖)進一步評估,盡量減少試驗中出現假陽性[32]。

5 小結與展望

臨床上用于檢測馬鼻疽的方法主要有分子生物學和血清學方法。對于根除馬鼻疽,臨床上以鼻疽菌素試驗和補體結合試驗為主。鼻疽菌素試驗操作簡單,成本低,雖適用于基層大規模檢疫,但檢測過程中花費時間較長并需要專業人員進行操作。補體結合試驗為世界動物衛生組織推薦的檢測方法,具有高度敏感性,雖然操作繁瑣,但具有較高的靈敏度,對于馬鼻疽的凈化具有一定意義。酶聯免疫吸附試驗操作簡單,具有高特異性和靈敏度,檢測樣本容量大,適用于臨床大規模檢測,提升靈敏度并通過大量臨床樣本進行驗證,有望成為一種更適用于臨床的血清學診斷技術。

沒有兼具高特異性、高敏感性、低成本、又操作簡單快速的適用于臨床的診斷方法,新的抗體診斷方法不斷出現,且顯示出良好的應用前景?；谖㈥嚵蟹椒êY選到10種特異蛋白抗原,用間接ELISA原理和其中3種抗原建立了一種快速診斷試紙條,可在15 min內讀取結果,具有與CFT同等的敏感性和特異性,適用于臨床快速診斷,需大量臨床樣本進行驗證和推廣[33]。全基因組測序技術的發展并結合納米孔測序技術為馬鼻疽的診斷提供了新思路,不僅有助于精細地闡明病原體的基因組結構,而且獲得的序列比PCR方法提供了更高的信息價值,對全基因組變異具有高度敏感性和準確性。為了避免與細菌分離有關的問題,采用宏基因組學方法直接從樣本材料中獲得測序數據為未來提供新的可能性[34]。該方法需在全球數據庫的建立和共享為前提下實現。在無疫苗與合適治療方案的情況下,需改良已有方法建立新的診斷技術,以分子生物學和血清學方法為主,研發成本低、適用性廣、準確性高的診斷方法,實現對馬鼻疽的精準檢疫監測,減少經濟損失,防止疫情擴散,保障人類和動物的健康。