低級別膠質瘤自噬相關基因預后分類器的構建及驗證

李國俊 劉妲 李永事 鄧仕鳳 李會兵 山常國 金鑫

【摘要】目的本研究旨在構建自噬相關基因（ARGs）的風險分類器，從而預測低級別膠質瘤（LGG）患者的生存率。方法從UCSCXena，CGGA，GlioVis和GTEx公共數據庫中獲取LGG患者和正常腦組織數據，結合人類自噬數據庫篩選出232個ARGs。通過差異分析得到差異ARGs。在訓練集中，利用單因素Cox回歸分析和LASSO回歸分析，構建ARGs的預后分類器。通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線確定最佳Cut-off值。Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線下面積（AUC）用于評估分類器性能，并在內部數據集和外部數據集中驗證。Cox回歸分析用于評估分類器的獨立預后價值。最后，結合常見臨床參數和風險分類用于構建列線圖模型，并利用ROC曲線，一致性指數和校準曲線評估該模型的預測能力。結果本研究構建了由6個ARGs（BAG1、PTK6、EEF2、PEA15、ITGA6和MAP1LC3C）的預后風險分類器，其可將LGG患者分為具有明顯生存差異的高、低風險組在多個數據集（均P＜0.05）。5年AUC值顯示該分類器在訓練集，內部驗證集和TCGA總集中分別為0.837，0.755，和0.803。同時，在外部驗證集中，1年，2年和3年ROC曲線依然提示該分類器具有較好的預測準確性。Cox回歸分析顯示該預后分類器在來自TCGA的多個數據集中都具有獨立預后價值（HR>1，P<0.05）。之后構建了包含多個常見臨床參數和預后風險分類的列線圖模型，時間依賴性ROC，一致性指數（C-index）和校準曲線分析同時證實了該模型的預后價值。結論本研究建立了一個由6個ARGs的具有高預后價值的風險分類器，并結合臨床病理特征和風險分類構建了用于臨床決策的列線圖，能更好地幫助臨床醫生判斷LGG患者的預后和進行個體化治療的臨床決策。

【關鍵詞】低級別膠質瘤；自噬相關基因；預后分類器；臨床意義

【中圖分類號】R739.41【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0023-09

Constructionandvalidationanovelsixautophagy-relatedgenessignatureinlower-gradegliomaLIGuojun，LIUDa，LIYongshi，etal.DepartmentofNeurosurgery，GuangdongSanjiuBrainHospital，Guangzhou510510，China

Correspondingauthor：JINXin

Abstract：ObjectiveToconstructariskclassifierforautophagyrelatedgenes（ARGs）topredictthesurvivalrateoflow-gradeglioma（LGG）patients.MethodsLGGpatientandnormalbraintissuedatawereobtainedfromthepublicdatabasesofUCSCXena，CGGA，GlioVis，andGTEx，andscreen232ARGsusingahumanautophagydatabase.DifferentialARGswereobtainedthroughdifferentialanalysis.Inthetrainingset，aprognosticclassifierforARGswasconstructedusingunivariateCoxregressionanalysisandLASSOregressionanalysis.TheoptimalCut-offvaluewasdeterminedbydrawingreceiveroperatingcharacteristic（ROC）curves.TheKaplanMeiersurvivalcurveandareaundertheROCcurve（AUC）wereusedtoevaluateclassifierperformanceandvalidatedonbothinternalandexternaldatasets.Coxregressionanalysiswasusedtoevaluatetheindependentprognosticvalueofclassifiers.Finally，acolumnchartmodelwasconstructedusingcommonclinicalparametersandriskclassification，andthepredictiveabilityofthemodelwasevaluatedusingROCcurves，consistencyindices，andcalibrationcurves.ResultsThisstudyconstructedaprognosticriskclassifierconsistingofsixARGs（BAG1，PTK6，EEF2，PEA15，??ITGA6， and MAP1LC3C）， which can classify LGG patients into high-risk and low-risk groups with significant survival differences across multiple datasets（all P<0.05）. The 5-year AUC value shows that the classifier has values of 0.837， 0.755， and 0.803 in the training set， internal validation set， and TCGA total set， respectively. Meanwhile， in the external validation set， the ROC curves for 1 year， 2 years， and 3 years still indicated that the classifier has good predictive accuracy. Cox regression analysis showed that the prognostic classifier had independent prognostic value in multiple datasets from TCGA（HR>1，P<0.05）. Afterwards， a column chart model containing multiple common clinical parameters and prognostic risk classification was constructed， and the prognostic value of the model was confirmed through time dependent ROC（t-ROC）， consistency index（C-index）， and calibration curve analysis. ConclusionA risk classifier with high prognostic value is established consisting of 6 ARGs， and combined clinical pathological features and risk classification to construct a column chart for clinical decision-making， which can better assist clinical doctors in judging the prognosis of LGG patients and making personalized treatment clinical decisions.

Key words： lower-grade glioma; autophagy related gene; prognostic classifier; clinical revelance

低級別膠質瘤（lower-gradeglioma，LGG）包括彌漫性低級別和中級別膠質瘤［世界衛生組織（WorldHealthOrganization，WHO）Ⅱ和Ⅲ級］，其約占原發腦腫瘤的30%，來源于神經膠質細胞，具有臨床預后差異性大的特點［1-2］。目前最大程度手術切除聯合術后放化療仍是LGG的主要治療模式［3-4］。雖然有近一半LGG患者術后生存時間較長，但還有一半以上的患者可能迅速發展成為難治性和侵襲性的高級別膠質瘤，從而極大縮短患者的生存時間［5-6］。因此，尋找新的LGG預后標志物和治療靶點已迫在眉睫。

自噬是一種高度保守的溶酶體降解過程，對于體內平衡、分化、發育和存活至關重要［7］，并被發現參與多種病理過程，包括癌癥［8］。通過自我降解受損的蛋白質和細胞內成分，自噬可以抑制腫瘤的發生，從而減輕細胞損傷和抑制染色體不穩定［9-11］。但是，在乏氧和營養缺乏的環境中，自噬也可以通過提供營養物質促進癌細胞的增殖。自噬目前被認為具有阻止癌癥的發生和促進腫瘤進展的雙面作用［12］。然而，很少有研究報道自噬對LGG預后的影響。

本研究通過差異分析，單因素Cox回歸和LASSO回歸分析，篩選出6個自噬相關基因，用于建立一個強有力的預后風險分類器，然后利用風險分類和傳統的臨床參數建立了列線圖，以期提高預測臨床預后準確性和輔助臨床決策。

1材料與方法

1.1數據收集和預處理從UCSCXena（https：//xenabrowser.net/）網站下載529例癌癥基因組圖譜（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）中LGG患者的RNA-seq表達譜及其臨床病理資料。將病理診斷為LGG，隨訪時間大于90d，且有完整臨床資料的LGG患者納入本研究，最后共有433例LGG患者納入，并將其作為TCGA總集。之后將TCG-總集中的433例LGG患者以7∶3的比例，隨機分為內部訓練集（n=305例）和內部驗證集（n=128例）。此外，從中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃（ChineseGliomaGenomeAtlas，CGGA）數據庫［13］下載了mRNAseq_693和mRNAseq_325數據集，作為本研究的CGGA1和CGGA2外部驗證數據集，并從腦腫瘤表達數據可視化和分析數據庫（GlioVis-VisualizationToolsforGliomaDatasets，GlioVis）［14］下載了Gravendeel和Rembrandt數據集作為另外2個外部驗證數據集。正常腦組織mRNA表達譜資料自基因型-組織表達（genotype-tissueexpression，GTEX）數據庫中下載。此外為了校準mRNA表達譜數據，消除批次效應，使用了“sva”R包的“combat”算法。

1.2自噬相關基因的篩選及其功能的富集使用R軟件中“limma”包對TCGA-LGG腫瘤樣本和正常腦組織進行差異分析，以FDR<0.05且|Log2FC|>1為篩選標準，篩選出差異表達基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs），并用火山圖進行可視化展示。從人類自噬數據庫（HADb，www.autophagy.lu/）中提取的232個自噬相關基因（autophagyrelatedgenes，ARGs）。將DEGs和自噬相關基因相交，得到53個差異表達的自噬相關基因（differentiallyexpressed-autophagyrelatedgenes，DE-ARGs），并以Venn圖展示。之后對DE-ARGs進行基因本體論（GeneOntology，GO）和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）功能富集分析。

1.3基于ARGs的風險分類器的構建與驗證對訓練集中53個DE-ARGs進行單因素Cox回歸分析，得到13個具有顯著預后差異的DE-ARGs（均P<0.05）。然后采用LASSO回歸模型對這13個DE-ARGs進行進一步篩選，從而建立由6個ARGs構成的能預測LGG患者預后風險的分類器模型。將LASSO回歸系數與相應基因的歸一化表達水平相結合，建立風險分類器模型，其風險評分=各基因的歸一化的mRNA表達水平×相應的LASSO回歸系數的總和。隨后，對每個患者計算風險評分，并根據由受試者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲線計算得到的最佳的風險分界值（-7.009），將所有LGG患者分為高、低風險組。其次，利用Kaplan-Meier生存分析的Log-rank檢驗評估高風險組和低風險組患者的生存差異。同時使用“survcomp”和“survivalROC”R包的一致性指數（C-index）分析和時間依賴性ROC（time-dependentROC，tROC）曲線分析來判斷該預后分類器模型在多個數據集中的預測能力。此外，采用Cox回歸分析方法評估預后風險分類器模型在多個數據集中的預測能力是否可以獨立于其他臨床因素，包括年齡、性別、WHO分級、放療、化療和異檸檬酸脫氫酶（isocitricdehydrogenase，IDH）狀態。接下來，通過使用“rms”，“foreign”和“survival”R軟件包，本研究建立了一個基于常見臨床病理因素和風險分類組成的用于臨床決策的列線圖；并利用C-index，tROC和校準曲線分析，以評估列線圖的預測效能。

1.4統計學方法數據分析和繪圖主要基于R-3.6.3（https：//www.r-project.org）完成。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線的Log-rank檢驗，并用薈萃分析方法分析自噬相關風險分類器在整合數據集中的預后價值；獨立預后因素的評估，使用單因素和多因素Cox回歸分析。預后風險分類器的預測效能通過，一致性指數分析和tROC曲線分析；臨床決策的列線圖，使用“rms”R包中的多因素Cox回歸分析函數來構建。并且列線圖的預測效能，通過一致性指數，tROC曲線和刻線圖來評估。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1差異表達ARGs的篩選及功能富集分析對從TCGA-LGG收集的529例低級別膠質瘤組織和從GTEX中收集1035例正常腦組織進行差異分析，得到7143個DEGs，并在火山圖中展示（圖1A）。將這些DEGs與來自HDAb的232個ARGs取交集，韋恩圖顯示有53個DE-ARGs，用于進一步分析（圖1B）。對53個DE-ARGs進行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集顯示，在生物學過程方面，DE-ARGs主要富集在自噬相關過程；在細胞成分方面，DE-ARGs主要富集在自噬體膜、自噬體和空泡膜，在分子功能方面，DE-ARGs主要富集在泛素和泛素樣蛋白連接酶結合，以及周期素依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性方面（圖1C）。此外KEGG通路富集顯示，DE-ARGs主要在腫瘤相關通路、自噬-動物和吞噬-動物方面富集（圖1D）。

2.2預后風險分類器的建立與評估采用“caret”R包，將433例TCGA-LGG患者隨機分成訓練集（n=305）和內部驗證集（n=128）。對兩個數據集之間的基本臨床因素進行χ2檢驗，結果顯示兩個數據集之間沒有顯著差異（表1）。之后通過對53個DE-ARGs進行單因素Cox回歸分析，在訓練集中得到13個與預后顯著相關的DE-ARGs。將這13個ARGs納入LASSOCOX回歸分析識別更穩定，與預后更相關的基因，本研究最終篩出6個ARGs，構建了LGG預后風險分類器，分別是BAG1，PTK6，EEF2，PEA15，ITGA6和MAP1LC3C。其中BAG1、PTK6、EEF2和PEA15的風險比（hazardratio，HR）<1，提示低表達與高風險相關；ITGA6和MAP1LC3C的HR>1，提示高表達與高風險相關，6個基因的生存分析和LASSO回歸系數見表2。根據6個ARGs的LASSO回歸系數和相對應的mRNA表達量計算每個LGG樣本的風險評分。隨后，本研究計算出訓練集中每個LGG樣本的風險評分，繪制ROC曲線得到風險評分的最佳截斷值（cut-offvalue，-7.009），以此將LGG患者分為低風險組和高風險組（圖2D）。Kaplan-Meier生存分析顯示，與低風險組相比，高風險組患者的總生存期（overallsurvival，OS）顯著較差（Log-rankP<0.0001，圖2A）。tROC曲線結果如圖2B所示，預后風險分類器的5年時間AUC值最高為0.837，明顯高于其他臨床病理因素。圖2C顯示了高低風險組之間的六個ARGs表達量分布情況。此外，風險評分在單因素和多因素Cox回歸分析結果中均具有顯著統計學差異（HR>1，P<0.05）。上述結果表明，風險分類器對LGG患者的預后預測較其他臨床指標具有更好的預測性能。

2.3預后風險分類器的驗證利用內部驗證數據集和TCGA總數據集對預后風險分類器的預測能力進行驗證。根據最佳Cut-off值（-7.009），將內部驗證集（圖3D）分為高風險組（n=44）和低風險組（n=84）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高風險組患者的預后OS較低風險組更差（Log-rankP<0.0001，圖3A）。5年時間的ROC曲線分析結果顯示，在各臨床參數中，風險評分對OS具有最好的預測能力（AUC=0.755，圖3B），優于其他單個臨床參數。6個ARGs的表達量在驗證隊列中的分布情況以熱圖形式展示（圖3C）。此外，將年齡、性別、WHO分級、放療、化療和IDH狀態以及風險評分納入Cox回歸分析，結果顯示風險評分仍是LGG患者的獨立預后因素（HR>1，P<0.05，表3）。然后本研究進一步證明了自噬相關的預后分析分類器在TCGA總數據集中的預測能力，并得到了相似的結果。如圖4D所示，采用最佳Cut-off值將TCGA-總數據集分為具有顯著生存差異的高風險組和低風險組（Log-rankP值<0.0001，圖4A）。5年時間ROC曲線結果也得出風險評分對LGG患者OS的預測能力最佳（AUC=0.803），優于其他傳統臨床病理因素（圖4B）。在TCGA總數據隊列中，高低風險組之間的6個ARGs自噬表達量情況以熱圖形式展示（圖4C）。Cox回歸分析結果仍提示，風險評分是OS的獨立預后因素（表3）。此外，本研究還納入了來自CGGA數據庫的CGGA1和CGGA2低級別膠質瘤轉錄組數據集和來自GlioVis數據庫的GRAVENDEEL和REMBRANDT數據集作為外部數據集來驗證該ARGs風險分類器。首先根據該分類器的計算公式對數據集中每個樣本進行打分，然后利用ROC曲線得到風險評分的最佳截斷值，用于劃分高、低風險組。圖5A，5C，5E，5G顯示，高風險組中患者的預后OS均顯著短于低風險組（Log-rankP值均＜0.05）。同時1年，2年和3年ROC曲線結果提示，該模型具有良好的預測準確性（圖5B，5D，5F，5H）。最后對來自TCGA，CGGA和GlioVis數據庫的5個數據集進行薈萃分析，結果顯示該ARGs風險分類器在整合數據集和其他四個外部驗證集中具有顯著預后價值（表4）。綜上，自噬相關的預后風險分類器在預測LGG患者的臨床預后生存中具有良好的預測性能。

2.4臨床列線圖的建立和驗證通過結合風險分類和常見的臨床病理因素，本研究構建了一個用于臨床決策的列線圖來預測TCGA總數據集中LGG患者的3年和5年的生存概率（圖6B）。一致性指數和tROC曲線分析用于評估臨床列線圖的預測效能，結果提示C-index為0.845，3年和5年的AUC值分別為0.884和0.855（圖6A）；同時，校準曲線圖結果提示3年和5年生存概率的預測值和實際值吻合度高在訓練集（圖6C、D），驗證集（圖6E、F）和總體數據集（圖6G、H）。這些結果提示，臨床列線圖能準確地預測LGG患者的生存概率。

3討論

研究報道自噬參與多種癌癥（包括膠質瘤）的發生、發展和耐藥［8，15-16］，然而ARGsLGG中的具體功能和臨床意義尚不清晰。因此，構建自噬相關預后分類器具有重要意義。本研究最終構建了一個能高效預測LGG患者預后的分類器模型，并進一步構建了用于臨床決策的列線圖，為LGG患者的個體化治療提供了一個新方向。

本研究通過單因素Cox回歸、LASSO回歸和多因素Cox回歸分析，確定了6個與預后有顯著相關的ARGs，其中BAG1、PTK6、EEF2和PEA15是低級別膠質瘤患者的保護因素，ITGA6和MAP1LC3C是LGG患者的危險因素。BAG1是一種多功能蛋白，有報道顯示抑制BAG1表達能引起細胞凋亡，細胞周期阻滯，甚至能增加細胞的化療敏感性［17］。PTK6編碼一種細胞質非受體蛋白激酶，在癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲過程起著重要作用［18］。PTK6在多種癌癥組織中高表達，并與不良臨床預后相關［19-20］。然而，另一項研究表明，PTK6在喉鱗狀細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織中低表達，并與更差的生存時間相關［21-22］。EEF2在蛋白質合成過程中參與肽基tRNA的轉運。沉默EEF2能增加癌細胞的線粒體延長，細胞自噬和順鉑敏感性［23］。PEA15是一種15-kda的磷酸化蛋白，通過結合ERK蛋白，阻止ERK蛋白的核定位，從而ERK-依賴的基因轉錄和細胞增殖過程［24-25］。此外，PEA15還可通過激活ERK1/2通路誘導細胞自噬。ITGA6是整合素α鏈家族的一員，在細胞外間質蛋白的信號傳導，和在多種癌癥的耐藥性中發揮關鍵作用［26-27］。ITGA6的高表達水平與較短的OS有關［28-29］。MAP1LC3A編碼微管組織蛋白1-lightchain3家族的一個輕鏈亞基，參與細胞自噬和細胞移動過程。Giatromanolaki等［30］指出MAP1LC3A的過度表達與自噬降解活性受損有關，這可能促進了膠質母細胞瘤的致癌過程。此外，另一項研究表明，MAP1LC3A在口腔鱗狀細胞癌手術切緣的表達可能是臨床預后不良的生物標志物［31］。綜上所述，BAG1、PTK6、EEF2、PEA15、ITGA6和MAP1LC3C可作為多種腫瘤生存的預測因子，參與包括自噬在內的多種生物學過程。這些ATGs可作為指導LGG治療的預后生物標志物和潛在治療靶點。

本研究根據上述6個ARGs構建了一個新的預測風險分類器，用于提高預測LGG患者的生存準確性。在來自TCGA的多個數據集中，利用Kaplan-Meier生存曲線證明高風險組患者相比于低風險組患者的預后都更差，在4個外部數據集和1個整合數據集中，同樣觀察到相似的結果；tROC曲線也得出，該預測風險分類器較其他臨床病理因素具有更高的AUC值，表明該預測風險分類器具有良好的可重復性和預測準確性。此外，Cox回歸分析指出，預測分類器的風險評分可能是個預測LGG患者的獨立預后因素，并在多個數據集中得到驗證。最后，為了提高風險評分的預測效能，本研究構建了一個包含風險分組、年齡、性別、WHO分級、放療、化療和IDH狀態的列線圖。通過ROC曲線分析，列線圖的預測準確性優于風險評分和單一臨床參數，并且校正曲線分析顯示列線圖預測的生存概率與實際生存率非常接近，這能更好地為臨床醫生提供個體化治療指導。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究中的LGG數據都是來自公共數據集，因此未來在自己的數據集中驗證該風險分類器會更好地促進其指導臨床決策的能力。其次，ARGs在LGG中的分子機制尚需要實驗研究的探索。

綜上所述，本研究構建了一個基于6個ARGs的風險分類器來預測LGG患者的生存風險。然后，結合風險分類和臨床病理特征構建了列線圖模型以預測LGG患者的預后生存時間，與單一臨床病理特征相比，列線圖模型具有更準確的預測性能，有助于臨床醫生進行個體化治療的臨床決策。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿2022-07-15修回2023-01-23）