基因編輯豬在異種肝臟移植中的研究進展

張家騰 李家琦 武羽 段鐘平 陳煜

終末期肝病(ESLD)泛指各種肝臟損傷導致的肝病晚期階段。每年約有200萬人因肝病死亡,肝移植是治療終末期肝病最有效的方法。隨著肝移植技術、免疫抑制劑和醫療保健等方面的發展,肝移植術后存活率逐步提高,其需求也在不斷增加[1]。然而,由于供肝的數量極大地受限于傳統觀念、倫理道德等多重社會因素的影響,器官捐獻者短缺已成為我國乃至全世界共同面臨的嚴峻挑戰,潛在的移植受者數量更是遠遠超過肝臟供體數量。肝移植為第二常見的實體器官移植,但根據記錄在案的移植器官統計,全球只有不到10%的移植需求得到滿足[1]。當前供肝數量的匱乏已成為阻礙肝移植發展的最大問題,因此開發其他來源的肝臟替代方案至關重要,而異種肝臟移植的發展為終末期肝病患者帶來了新的希望。近年來,豬在異種器官移植領域的應用不斷擴大?；蚓庉嫾夹g進步的同時,基因編輯豬的構建方案也在不斷優化,這極大地推動了異種器官移植的發展。

一、 異種器官移植的供體選擇

靈長類動物中,類人猿、黑猩猩、狒狒、猴子等,進化程度與人類更為接近,理論上,這些高級的非人類靈長類動物是用于異種器官移植的理想供體來源,但由于其數量少、價格貴,繁殖周期長、飼養困難,以及倫理等問題不適合作為異種器官移植的供體來源。小型豬是一種新型醫學實驗動物模型,廣泛應用于心血管疾病、消化系統疾病的研究及器官異種移植等領域[2]。小型豬品種資源豐富、體型小、易繁殖、存活率高、遺傳性狀穩定,且在遺傳學、解剖結構、器官大小、營養代謝及生理生化特征方面與人的相似性較大,具有廣闊的應用前景[2]。同時,由于豬與人類在進化上的親緣關系相距較遠,與使用非人類靈長類動物相比,受者患人畜共患病的風險較小,引發的倫理爭議也較少。重要的是,豬也易于進行基因修飾,因此目前被認為是異種器官移植的最佳供體選擇。

二、 異種器官移植面臨的問題

利用豬作為潛在的人類移植器官的供體選擇是解決當前器官嚴重短缺問題的重要途徑,但同時也面臨著諸多挑戰:①受體與供體之間的高免疫不相容性是異種器官移植的主要障礙。主要包括超急性排斥反應(HAR)、急性體液異種移植排斥反應(AHXR)、急性細胞排斥反應(ACR)、慢性排斥反應。②潛在的豬內源性逆轉錄病毒(PERVs)的跨物種感染風險,也是異種器官移植的必要安全考慮。③凝血功能障礙:血小板減少癥和凝血失調。

超急性排斥反應通常發生在移植后數分鐘或數小時內,由α1,3-半乳糖基抗原介導,當異種移植物移植到受者體內時,移植物細胞表面抗原與受者體內的抗體IgG和IgM結合,形成抗原抗體復合物,從而激活補體調控系統,導致血管內血栓形成、出血性壞死、內皮細胞損傷以及IgM、IgG沉積等[3]。急性體液異種移植排斥反應,又稱急性血管排斥反應,在移植后2～3 d內發生,其與激活內皮的抗體和補體的沉積以及先天免疫細胞(例如多形核白細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK cell))的浸潤作用有關。急性細胞排斥反應,又稱急性排斥反應,其發生早期是由細胞免疫導致,主要由NK細胞和主要組織相容性復合物(MHC)激活T淋巴細胞介導。ACR的形成主要取決于多肽的類型,例如,Ⅰ類MHC主要激活CD4+T細胞,Ⅱ型MHC主要激活CD8+T細胞。慢性排斥反應即移植物血管病變,一般發生在移植術后數月或數年內,也可發生在急性排斥反應后,以體液免疫為主,產生血管周圍炎癥,阻塞血管,導致移植物功能逐漸下降。

豬器官攜帶的病毒和微生物對移植受體存在的潛在危害性也是值得關注的一個問題。通過改善豬群的飼養環境,定期進行安全監測可以有效規避巨細胞病毒、EB病毒、西尼羅病毒、狂犬病毒等病毒感染的發生。然而豬體內還存在一種單鏈正鏈RNA病毒,即豬內源性逆轉錄病毒,它可以將RNA轉為DNA并整合到豬基因組中。豬體內部分細胞可以釋放PERV顆粒,在體外感染某些人源細胞,使受體有致病和感染的可能[4]。盡管目前還未有異種器官移植感染PERV的報道,但仍舊存在病毒傳播及引發疾病的風險,因此這也是需要解決的問題之一。

由于血小板丟失導致的致命性出血及凝血失調等問題尚未解決,豬異種肝臟移植的存活時間限制在1個月內[5]。目前認為,異種肝臟移植后嚴重的血小板減少是由于血小板過度活化/聚集和異常的血小板隔離/吞噬作用造成的。凝血級聯的異常激活是超急性排斥反應的標志特征。然而,在豬-非人類靈長類動物肝臟異種移植中,即使沒有發生超急性排斥反應,也會發生凝血失調。與心臟或腎臟異種移植相比,凝血失調對肝臟異種移植來說是一個更大的障礙[6]。研究顯示,肝臟異種移植中凝血失調的影響因素包括組織因子的遺傳不一致、外源性途徑的組成性激活以及凝血酶-血栓調節蛋白復合物中的物種不相容性[6]。

三、基因編輯豬的構建

由于免疫補體系統的激活、凝血系統紊亂及豬器官本身攜帶病毒等問題的存在,限制了異種器官移植的應用?；蚓庉嫾夹g的發展對解決這些問題做出了巨大貢獻。從最初的通過原核顯微注射、精子介導的基因轉移和移動遺傳元件的整合等方法隨機插入外源 DNA,再到通過體細胞中的同源重組和體細胞核移植來操縱內源基因[7],已成功構建了多種基因編輯豬,但上述技術在豬成纖維細胞中獲得基因敲除的效率仍非常低。

近年來,核酸酶介導的基因編輯技術大大提高了獲得基因敲除細胞的效率,使用鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活因子樣核酸內切酶(TALENs)和成簇的規則間隔短回文重復序列/Cas9系統(CRISPR/Cas9)等新型可編程DNA核酸酶在基因組編輯方面的應用取得了重大進展[8]。這些工具能夠通過靶向特定序列來精確切割DNA,并通過切斷特定基因組位點的雙鏈來添加、去除或替換核苷酸。特別是CRISPR/Cas9技術,與其他基因組編輯工具依賴于蛋白質-DNA相互作用不同,該技術依賴于RNA-DNA結合,這使該系統具有更高的靈活性和保真度,同時操作相對簡單且更具有成本效益,在構建基因編輯豬中發揮重要作用。

通過針對異種抗原分子、免疫反應調節因子、凝血反應調節因子等靶基因,可構建轉基因豬。研究發現,豬器官的血管內皮細胞存在大量的α-1,3-半乳糖抗原,其合成由α-1,3-半乳糖苷轉移酶(GGTA1)催化,該酶在人體中不存在,因此會被人免疫系統產生的抗α-1,3半乳糖抗體識別,從而發生免疫排斥反應。敲除該基因,獲得轉基因豬(α-1,3-galactosyltransferase gene knockout,GTKO),可有效規避此情況的發生[9]。有試驗顯示,使用GTKO豬的心臟并結合免疫抑制劑,移植到狒狒體內,受者存活時間長達179 d[10]。研究者們還利用其他基因如CD46、CD55、CD59、CD39、CD47等,對豬進行基因改造,從而延遲異種移植排斥和/或急性細胞排斥、抑制補體活性[11]。此外,在供體豬中也已通過CRISPR/Cas9技術敲除了PERV,實現了PERV敲除豬的選育[12, 13]?？傊?利用基因修飾豬作為器官供體并合用免疫抑制劑,可以有效降低異種器官移植免疫排斥反應,這也是目前異種器官移植的主要發展途徑。

四、 基因編輯豬在異種肝臟移植中的研究進展

基因編輯豬模型在推動異種肝臟移植領域發揮了極其重要的作用[14]。2000年,有研究者使用表達CD55的轉基因豬首次進行了基因編輯豬-狒狒原位異種肝移植,并與未修飾豬進行對比,結果顯示,使用未修飾豬進行肝臟移植的三只對照動物由于發生HAR,存活時間不到12 h,而使用轉基因肝臟的動物在移植術后未發生HAR,最終狒狒存活8 d[15]。此后,又有研究人員使用表達人補體調節蛋白CD55、CD59和α1,2-巖藻糖基轉移酶的多轉基因豬在狒狒中進行肝臟原位異種移植,最終結果顯示未發生HAR,但由于受體發生血栓,存活時間僅為13～24 h[16]。2010年,研究者首次進行了GGTA1基因敲除豬-狒狒異種肝臟移植的試驗,并對移植肝臟的凝血功能、解毒功能及補體活性進行檢測,結果顯示供體肝臟可以正常發揮肝臟功能,最終由于血小板減少引發了嚴重的自發性出血,存活時間為4～7 d[17]。研究表明,GTKO豬進行異種肝臟移植能有效延長移植物存活時間,而目前影響移植物存活的主要因素是血小板減少導致微血管病變及凝血功能紊亂[17]。2012年,有研究者使用GTKO豬進行肝臟異種移植,并對受者進行術后Amicar治療(適用于預防及治療血纖維蛋白溶解亢進引起的各種出血),以抑制纖維蛋白溶解,最終將受者的生存時間延長至9 d[18]。

直到2016年,有研究者利用GTKO豬,并在移植后連續輸注人凝血酶原復合物濃縮物以及添加貝拉西普進行肝臟原位異種移植,使受者存活了25 d[19]。一年后,該研究團隊保持其他實驗參數不變,僅用抗CD40單抗取代貝拉西普作為共刺激的主要藥物,用來延長異種肝臟移植的生存時間,試驗過程中未出現排斥反應、炎癥或血栓性微血管病,最終受體由于足底潰瘍和肝功能升高需要進行安樂死,但生存時間長達29 d,這也是目前豬肝異種移植的最長時間記錄[5]。然而盡管基因編輯豬的技術不斷發展,但血小板減少癥和凝血失調的存在仍極大地限制了臨床前異種肝臟移植的存活時間。

五、 展望

隨著器官移植技術的不斷進步,供體資源緊缺已成為日益嚴峻的全球性問題,嚴重阻礙了器官移植的發展。以基因編輯豬為供體的異種器官移植有望解決器官供需失衡的問題。近年來,基因編輯技術發展迅速,通過敲除異種抗原基因,轉入表達人體補體調節基因,敲除免疫激活因子,表達抗凝血/抗血栓調控因子,可以有效克服免疫排斥反應,同時 PERV感染問題也已得到解決,將多種基因修飾豬與有前景的新藥理學策略相結合,可能會延長受體的生存時間。雖然目前臨床異種移植尚未成功,但異種器官移植為解決人類器官供體資源匱乏的問題提供了新的可能,也為終末期肝病患者的治療帶來了一線曙光。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。