熒光圖像引導手術在婦科惡性腫瘤的研究進展

賈炎峰，黨云

婦科惡性腫瘤手術R0 切除（完整切除腫瘤，切緣無癌細胞）是影響患者生存的重要因素之一[1]。然而，由于婦科腫瘤常波及多個器官及組織，手術前常用的影像學檢查對微小轉移病灶敏感度較低，并且即使術中依靠手術醫生視觸覺及經驗評估，也可能遺漏亞毫米的腹膜轉移病灶，手術切除不完全是其短期復發的主要原因。熒光圖像引導手術（fluorescence image-guided surgery，FIGS）采用近紅外熒光（near-infeared fluorecence，NIR）顯像劑與專門的光學成像系統結合，可以通過熒光顯示手術區域目標組織或器官，作為實時、非侵入性和高分辨率的診斷方式，為外科醫生提供屏幕圖像，實現術中實時導航、精準切除病灶的效果。近年來，FIGS 已成為外科領域發展最快的創新技術之一，現就FIGS 在婦科惡性腫瘤中的應用進展進行綜述。

1 FIGS 簡介

FIGS 是在術中使用NIR 顯像劑，經過成像系統提高腫瘤組織與正常組織的對比度，以增強腫瘤組織顯影，實現手術醫生以實時可視化的方式、在不損傷正常組織器官的前提下盡量完整地切除病變組織。FIGS 在婦科惡性腫瘤的應用主要包括組織結構和功能成像及靶向分子成像兩方面。NIR 分為一區（NIR-Ⅰ，700～900 nm）和二區（NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm），相較于可見光光譜（400～700 nm），生物組織對該波長范圍的光吸收較低、自發熒光少，尤其是NIR-Ⅱ的熒光波長更長，具有更深的組織穿透力、更低的背景信號。目前，手術中使用的熒光成像系統已拓展到NIR-Ⅰ熒光，并整合到腹腔鏡及機器人手術系統中。NIR 染料可分為有機類和無機類，有機類染料包括菁染料類、氟硼二吡咯化合物（BODIPY）類、羅丹明類、方酸類和卟啉類，如花菁染料吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）、甲川花菁染料Cy 系列、噻嗪類染料亞甲基藍、經過修飾的ICG（如ZW-800、IRDye800）和經過修飾的羅丹明類染料Alexa Fluo；無機類染料主要包括單壁納米碳管、半導體量子點和稀土納米材料等。

由于NIR 染料自身沒有腫瘤特異性，研究大多將可與腫瘤細胞特異性受體結合的靶向分子共軛耦聯在熒光染料上，將該靶向熒光分子探針用于腫瘤靶向分子成像。靶向分子包括大小不等的抗體、多肽和小分子化合物等。目前針對婦科惡性腫瘤的主要靶向配體是各類具有腫瘤特異性和敏感性的生物標志物，如糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、葉酸受體α（folate receptor α，FRα）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和整合素ανβ3 等。

2 組織結構和功能熒光成像

外周靜脈注射ICG 后，由于ICG 的高通透性長滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR），其可迅速與血漿蛋白結合，進入有新生血管的組織，從而實現病變組織結構熒光成像的效果。另外，ICG 在皮下注射后可與脂蛋白結合進入淋巴循環，通過淋巴引流成像淋巴脈管和淋巴結，手術醫生可以進行淋巴繪圖和前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）檢測。

2.1 SLN 檢測SLN 是腫瘤細胞經淋巴管引流的第一站淋巴結，是最早發生腫瘤轉移的淋巴結。FIGS最常用于婦科惡性腫瘤SLN 檢測，手術中切除檢測陽性的SLN，若檢測陰性則行系統淋巴結清掃術。SLN檢測技術在婦科腫瘤中最早應用于外陰癌。Matsuo等[2]研究發現，ICG 在美國外陰癌手術SLN 檢測中的使用從2006 年的16.8%增加到2020 年的45.2%。Nahshon 等[3]利用SEER 數據庫識別41 411 例子宮內膜癌患者，按1∶1 配對SLN 檢測組和淋巴結清掃組各6 019 例，隨訪16 個月發現SLN 檢測組1 年生存率高于淋巴結清掃組（HR=1.61，95%CI：1.17～2.21，P=0.004）。一項前瞻性多中心研究納入31 例早期卵巢癌患者，將ICG 注入骨盆漏斗韌帶周圍的組織中，21 例檢出SLN，檢出率為67.7%，初步證明了SLN 在早期卵巢癌檢測中的可行性[4]。Agusti 等[5]的Meta 分析納入9 項研究共113 例早期卵巢癌患者，結果顯示SLN 檢出率為93.3%（95%CI：77.8%～100%），陰性預測值為100%（95%CI：97.6%～100%），99mTc 聯合ICG 注射到子宮-卵巢韌帶和骨盆漏斗韌帶時檢測率最佳（100%，95%CI：94%～100%），認為SLN 對早期卵巢癌具有較高的檢出率和陰性預測值，但該研究證據質量有限，在常規臨床實施之前需進一步研究驗證。下肢淋巴水腫和淋巴囊腫是婦科惡性腫瘤的常見并發癥之一，Terada 等[6]研究納入388 例子宮內膜癌患者，201 例患者接受SLN 檢測，187 例患者接受盆腔淋巴結清掃，SLN 組下肢淋巴水腫（2.0% vs.21.3%）和淋巴囊腫（0 vs.2.1%）的發生率低于淋巴結清掃組。Berasaluce Gómez 等[7]利用SUCCOR 隊列納入201 例接受SLN 檢測聯合淋巴結切除術和187 例僅行淋巴結切除術的宮頸癌患者，術后輔助治療比例分別為33.8%和44.7%（P=0.02），與僅行淋巴結切除術的患者相比，接受SLN 檢測聯合淋巴結切除術的患者死亡風險更高（HR=3.49，95%CI：1.04～11.7，P=0.042）。雖然SLN 檢測避免了不必要的大范圍淋巴結清掃術，減少了相關并發癥，但是SLN 檢測聯合淋巴結切除術得到陰性結果時，可能會使患者術后缺乏必要的輔助治療，進而會對疾病復發和患者生存產生不利影響。美國國家綜合癌癥網絡（NCCN）指南也將SLN 用于早期宮頸癌、子宮內膜癌檢測推薦為2A 類證據，但其臨床應用仍存有爭議，如示蹤劑的敏感度、注射劑量和部位等。SLN 檢測也可能會對患者預后及輔助治療產生影響，病理超分期的應用可能會增加微轉移的檢出率，但這還需更多的臨床試驗驗證。

2.2 結構和功能成像宮頸癌根治術中離斷陰道是腫瘤細胞腹膜擴散的危險因素。Ramirez 等[8]認為與開腹子宮切除術相比，腹腔鏡手術可能導致腫瘤細胞擴散，增加腹膜污染率，從而增加宮頸癌復發率。Klapdor 等[9]在行腹腔鏡下子宮切除術之前通過宮頸注射ICG 以評估術中宮頸分泌物在腹腔內的污染率，結果發現75%的宮頸癌患者存在腹膜污染，60%的患者發生器械污染。由此可見，熒光信號可實現宮頸分泌物腹膜污染的可視化，基于ICG 的熒光成像技術可進一步用于評估腹膜污染對患者生存預后的影響，并可作為外科醫生和手術技術的質量評估工具。Nguyen-Xuan 等[10]使用FIGS 實時檢測術中腫瘤邊緣，報道1 例第1 次手術未完整切除的外陰癌患者再次通過FIGS 切除外陰，術后病理證實切緣陰性。早期宮頸癌保留生育功能手術中，是否保留子宮動脈一直存有爭議。Escobar 等[11]在廣泛性宮頸切除術中使用ICG 進行血管造影評估子宮灌注，保留子宮動脈組（10 例）和未保留子宮動脈組（10 例）子宮底ICG 熒光強度相近，所有患者術后8 周均恢復月經；中位隨訪22 個月，保留子宮動脈組妊娠4 例（40%），未保留子宮動脈組妊娠3 例（30%），認為在宮頸癌保留生育功能手術中可以不用保留子宮動脈。宮頸癌患者行廣泛性子宮切除術時，切斷子宮動脈輸尿管支可能導致術后輸尿管缺血性壞死和輸尿管瘺等并發癥。姚瑤等[12]對2 例ⅠB1 期宮頸鱗癌患者行廣泛性子宮切除術中使用ICG 識別子宮動脈輸尿管支并保留，隨訪4 個月未出現輸尿管缺血相關并發癥。提示ICG 熒光血管造影技術有助于醫生識別血管、評估血管血流及相關組織灌注情況。H?ckel等[13]提出基于胚胎學的隔間或腔室（compartment）理念可用于婦科惡性腫瘤的治療。Kimmig 等[14]在子宮內膜癌患者進行子宮全系膜切除術（即將苗勒管隔間的所有解剖單元切除）時，通過子宮體注射ICG 發現，熒光可以顯像整個苗勒管隔間，從而支持了隔間理念。提示ICG 可輔助用于子宮內膜癌、宮頸癌等婦科惡性腫瘤的治療。外陰癌術中需切除腹股溝淋巴結，術后易出現腹股溝傷口開裂、難以愈合的并發癥，而皮瓣重建是預防腹股溝傷口開裂的重要手段。Gentileschi 等[15]報道1 例61 歲外陰癌患者術后因左側腹股溝傷口開裂而接受以股外側皮神經營養血管帶蒂皮瓣進行重建，為確認皮瓣血供，術中夾住穿支并行ICG 熒光血管造影，皮瓣顯示良好的熒光，術后創面愈合良好。通過影像學診斷轉移性腫瘤中的微小病變并進行手術通常具有挑戰性，FIGS 可為這類患者提供新的手術策略。Kreklau 等[16]使用ICG 對3例正電子發射計算機體層成像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）發現的可疑宮頸癌或癌肉瘤轉移患者進行腹腔鏡檢查，均診斷出轉移性病灶。FIGS 用于婦科惡性腫瘤結構和功能成像可以顯示血管、淋巴結和腫瘤組織等信息，然而ICG 等熒光染料自身沒有靶向性，靶向熒光分子探針可特異性靶向于腫瘤組織中的受體，不但能夠可視化腫瘤，還可提供病灶分子信息進一步指導治療。

3 靶向分子熒光成像

非靶向性熒光染料的主要局限性是假陽性率較高，ICG 檢測卵巢癌轉移病灶的假陽性率達62%[17]。在NIR 成像系統引導下，靶向熒光分子探針可以特異性標記腫瘤，減少假陽性結果。

3.1 靶向熒光分子探針臨床試驗FRα 在90%以上的上皮性卵巢癌中高表達，是當前研究最多的卵巢癌FIGS 生物標志物之一。2011 年，van Dam 等[18]首次將葉酸耦聯異硫氰酸酯熒光素（EC-17）用于卵巢癌靶向分子熒光成像中，12 例患者按0.1 mg/kg 的劑量注射EC-17，術中熒光檢測到57 處轉移病灶，44 處病灶經病理學證實為FRα 陽性。EC-17 雖然進入了Ⅱ期臨床試驗（NCT01511055），但由于技術限制該試驗終止于2020 年。在另一種葉酸耦聯花菁染料帕福拉西寧（OTL38）靶向熒光分子探針的Ⅰ期臨床試驗中，首先在30 例健康志愿者中進行了4 次OTL38 單次遞增劑量注射試驗，評估耐受性和藥代動力學后篩選出最佳劑量為0.012 5 mg/kg，隨后按此劑量對12 例卵巢癌患者注射OTL38，共檢出83 處可疑轉移病灶，62 處病灶經病理學證實為腫瘤，包括之前常規視野未發現的18 處病灶[19]。Ⅱ期臨床試驗顯示，OTL38 檢測卵巢癌病灶的敏感度為85.93%[20]。Ⅲ期臨床試驗顯示，在33%未計劃切除且常規視野未發現病灶的FRα 陽性患者中通過OTL38 發現了額外病灶，在接受間歇性腫瘤細胞減滅術的患者中該比例為39.7%，62.4%的患者實現了R0 切除；OTL38檢測卵巢癌病灶的敏感度為83.0%，假陽性率為24.8%[21]。子宮內膜漿液性癌和子宮內膜透明細胞癌也有FRα 表達，Boogerd 等[22]臨床試驗在術前對3 例子宮內膜漿液性癌和1 例子宮內膜透明細胞癌患者靜脈注射0.012 5 mg/kg 的OTL38，術中檢測到大網膜（n=3）和淋巴結（n=16）的轉移灶。OTL38 引導的FIGS 是第一個已完成臨床轉化并初步取得滿意結果的靶向熒光分子探針，已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床，未來或可成為卵巢癌患者重要的治療手段。ONM-100 是一種與ICG 共價耦聯的pH敏感的新型熒光納米探針，利用所有實體瘤的通用生物標志物——腫瘤微環境的相對酸性pH，在術中對腫瘤進行成像，ONM-100 在正常的生理pH 值下保持不活動狀態，直到暴露于酸性腫瘤微環境觸發膠束解離和熒光標記激活。在已完成的Ⅰ期臨床試驗中，ONM-100 對實體瘤術中成像的敏感度達100%，表明pH 敏感的熒光探針在實體瘤FIGS 中具有較大應用潛力[23]。靶向熒光分子探針在婦科腫瘤臨床試驗中已取得一定進展，其具有發現靶向病變組織額外轉移病灶的高敏感度和特異度，有助于FIGS 在婦科惡性腫瘤中的臨床應用。

3.2 靶向熒光分子探針臨床前試驗多項臨床前試驗探討了靶向分子探針在卵巢癌人源性組織異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型中的應用價值。有研究比較了卵巢癌PDX 模型中葉酸結合不同NIR 染料（ZW800-1、ZW800-1Forte、IRDye800CW、ICG-OSU 和合成的Cy7 衍生物）的組織清除特性和腫瘤特異性信號，提示ZW800-1Forte 的特異性熒光信號最強[24]，證實其用于熒光顯影時被檢測率更好。CD24 在腫瘤細胞中高表達，可作為分子靶向成像治療的一個新靶點，與NIR 染料共軛的CD24-AlexaFluor680 能夠在卵巢癌PDX 模型中識別腫瘤病灶[25]，并可擴展用于透明細胞癌和未分化癌模型中。Fung 等[26]在卵巢癌原位PDX 模型臨床前試驗中，證實了卵巢癌生物標志物CA125 的靶向抗體B43.13 與IRDye800CW 耦聯的靶向分子探針可用于卵巢癌組織的成像。另有研究證明卵巢癌相關抗原COC183B2 在卵巢癌中表達（61.2%～89.9%），據此研發的COC183B2-Cy7 和COC183B2-800 兩種熒光探針顯示出對卵巢癌具有腫瘤特異性，且COC183B2-Cy7 可以在離體卵巢癌組織中檢測到亞毫米級（腫瘤直徑小于1 mm）的腫瘤病灶[27-28]。促性腺激素釋放激素受體在78%的卵巢癌和其他與激素相關的腫瘤如子宮內膜癌中表達。Liu 等[29]研發的ICG 耦聯促性腺激素釋放激素拮抗劑靶向熒光分子探針A278047表現出與卵巢癌細胞的高親和力及高腫瘤背景比，在PDX 模型中可顯像腸系膜亞毫米級的腫瘤沉積物（tumor deposit，即瘤周脂肪組織中沒有淋巴結結構殘留的腫瘤結節）。貝伐珠單抗是一種靶向血管內皮生長因子A 的人源化單克隆抗體，IRDye800CW標記的貝伐珠單抗分子探針用于卵巢癌PDX 模型，可在術中實時成像檢測到亞毫米級的腫瘤病變[30]。整合素在腺上皮來源的消化道腫瘤和鱗狀上皮來源的腫瘤中過表達，Huisman 等[31]對外陰鱗癌及其癌前病變組織的石蠟切片進行免疫組織化學染色，結果發現整合素ανβ6 陽性的惡性外陰組織腫瘤背景比最高，對外陰鱗癌及其癌前病變與正常組織的區分能力最強，未來可進一步對靶向整合素ανβ6 的熒光分子探針在外陰鱗癌FIGS 中應用進行評估。Shaw等[32]研究表明，基于整合素ανβ3 受體拮抗劑的分子探針可以靶向OVCAR4 卵巢癌細胞。由此可見，整合素能夠成為卵巢癌、外陰癌等腫瘤FIGS 的靶向配體。不同靶向配體與不同NIR 染料制成的靶向熒光分子探針在婦科腫瘤FIGS 臨床前試驗表現出一定的應用潛力，仍需積極開展臨床試驗驗證其安全性和有效性。

4 FIGS 臨床應用的局限性

盡管生物標志物-熒光染料共軛的靶向熒光分子探針表現出低毒性、高穩定性和快速清除的優勢，但假陽性率高（10%～25%）仍是當前影響其在臨床普及應用的主要問題。OTL38 和EC-17 熒光成像的假陽性最常見于淋巴結，這可能與淋巴結中FRβ 過表達的巨噬細胞結合引起假陽性熒光信號有關。但淋巴結的假陽性熒光信號不妨礙OTL38 和EC-17在卵巢癌的應用，因為早期卵巢癌即應進行全面的淋巴結切除分期術，而對于晚期卵巢癌，FIGS 仍有助于檢測轉移性淋巴結。大網膜和子宮肌瘤上也可出現OTL38 和EC-17 陽性熒光信號，這是由于FRβ不僅是腫瘤組織的生物標志物，也是正常組織中組織駐留巨噬細胞的有用標志物，纖維化和炎癥等良性病變也可能出現陽性熒光信號。因此，對于婦科惡性腫瘤FIGS，仍需要特異度更高的熒光分子探針。一系列包含有機小分子、納米材料的NIR-Ⅱ熒光分子探針正在研發中。Wang 等[33]研發的稀土上轉換熒光納米探針極大地提高了光學成像的信噪比，實現了卵巢癌轉移的腹膜以及淋巴結在NIR-Ⅱ熒光成像引導下的精準切除。特定酶激活的熒光探針、正電子發射體層成像（positron emission tomography，PET）/熒光雙模態探針等也已進入臨床試驗階段。

另外，目前術中熒光信號的評估基于外科醫生的主觀視覺評價，熒光信號的量化評估也是必要的。正在開發的數字成像分析軟件算法可以識別客觀熒光閾值，能實現熒光信號的量化評估。尤其是在血流灌注熒光評估領域，使用人工智能開發專用算法，可以分析異質組織中熒光強度隨時間的變化，在視頻軟件熒光分析的幫助下可以動態地揭示腫瘤組織與正常組織的區別。目前，這些系統正在臨床前研究中，有待進入臨床試驗以進一步在臨床工作中實踐。

5 結語

婦科惡性腫瘤FIGS 作為一種新興手術策略，能夠增加腫瘤組織和正常組織的對比度，增強亞毫米級病灶的可視化，實現腫瘤切緣陰性，從而改善腫瘤分期和風險分層。隨著特異度更高的熒光染料的研發以及可以檢測和量化熒光信號標準化成像系統的進展，后續可進一步開展與現有腹腔鏡成像系統結合、實現可量化的熒光信號及標準化的臨床試驗。FIGS 實時熒光成像與光熱療法、免疫療法和抗體-藥物結合物的使用，有可能改變現有的治療方法，改善婦科惡性腫瘤患者的預后。