產香酵母的篩選及其在液態食醋釀造中的應用

杜琳琳,于鑫,劉麗萍,朱立磊,趙祥穎,*,張穎超,韓墨,劉建軍

1(齊魯工業大學(山東省科學院)山東省食品發酵工業研究設計院,山東 濟南,250013)

2(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院,山東 濟南,250013)

3(山東玉兔食品股份有限公司,山東 淄博,255300)

食醋的生產及消費在我國歷史悠久,是一種深受消費者青睞的調味品。我國傳統食醋生產以固態發酵為主[1]。固態發酵是一種粗放式發酵方式,使用的酒曲微生物菌群豐富,酒曲以及環境中諸多產風味化合物的微生物參與了醋的生產過程,所以固態醋的風味較好[2-3]。但固態工藝存在生產環境差、發酵周期長、勞動強度大、機械化程度低、產品品質不穩定、規模擴大受到限制等不足。隨著科學技術的不斷進步,目前液態食醋工藝已逐步成為主要的食醋生產方式,該工藝糖化、發酵劑分別采用淀粉酶制劑和釀酒酵母,再接種醋酸菌進行深層通風醋酸發酵,基本屬于純種發酵工藝。與傳統固態發酵工藝相比,盡管克服了固態工藝的諸多不足,但參與發酵過程的微生物只有釀酒酵母和醋酸菌,所以使得構成產品風味的有機酸和風味化合物含量偏低,產品的整體風味不足[4]。因此,強化液態食醋發酵功能微生物,改善提升液態食醋風味品質已成為當前的研究熱點。

本研究旨在分離篩選適應于食醋生產環境的產香微生物,應用于液態食醋生產,改善提升液態發酵醋的風味品質。本文從酒曲樣品中,以產酯能力為篩選指標,分離獲得一株產香酵母菌株-光滑假絲酵母HQ9,研究考察了其在液態食醋釀造中的應用情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、酒曲,山東淄博玉兔食品有限公司;有機酸標準品、2-辛醇(色譜級),上海麥克林生化科技有限公司;液化酶、糖化酶,諾維信生物技術有限公司;其他試劑來自國藥集團。除另有說明,所有試劑均為分析純。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)JM12、醋酸桿菌(Acetobacteraceti)SFC-YT19,實驗室保藏菌株。

1.2 培養基

YPD液體培養基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,118 ℃滅菌20 min。

YPD固體培養基(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,酵母提取物10.0,瓊脂20.0,118 ℃滅菌20 min。

產酯培養基(g/L):葡萄糖150.0,蛋白胨10.0,酵母提取物10,118 ℃滅菌20 min。

醋酸菌液體發酵培養基(g/L):葡萄糖10.0,酵母提取物10.0,118 ℃滅菌20 min,滅菌后加入無水乙醇60.0。

1.3 儀器與設備

湘儀L530離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;分光光度計,上海尤尼科儀器有限公司;Alphaclean1300潔凈工作臺,力康精密儀器(上海)有限公司;恒溫搖床,上海知楚儀器有限公司;GC7890B氣相色譜儀,CYCLODEX-B色譜柱,美國Agilent公司;UltiMate 3000液相色譜儀,HPX-87H色譜柱,美國Thermo Scientific公司;固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)裝置,Supleco公司;Trace130-TraceIS氣相色譜質譜聯用儀,賽默飛世爾科技有限公司;FlavourSpec風味分析儀,山東海能科學儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 產香酵母的分離和篩選

取酒曲樣品加入無菌生理鹽水充分振蕩,稀釋后涂布于YPD固體培養基,30 ℃恒溫培養24～48 h。挑取具有典型酵母形態特征的單菌落,純化后低溫保存備用[5]。將保存菌株轉接活化1次,接種于產酯培養基中,30 ℃、120 r/min搖床培養72 h,發酵液離心去菌體,上清液通過人工嗅聞、總酯測定等方法,篩選香氣濃郁和產酯高的菌株。

1.4.2 菌株形態觀察和鑒定

將篩選獲得的產香酵母菌株接種于YPD固體培養基,30 ℃培養24 h,觀察菌落和菌體形態。同時將活化的菌種接種YPD液體培養基,30 ℃、120 r/min培養24 h,離心收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,委托派森諾生物科技公司進行ITS rDNA測序,測序結果在NCBI數據庫進行序列同源性BLAST比對。

1.4.3 菌株生長環境適應性

將供試菌株的甘油管菌種在YPD液體培養基中轉接活化一次,然后按5%(體積分數)的接種量接種于不同的測試用YPD培養基中,30 ℃、120 r/min搖床培養24 h,發酵液適當稀釋后600 nm處測定OD值。通過細胞生長情況考察菌株生長最適溫度和pH以及對葡萄糖和乙醇耐受性[6]。

1.4.4 菌株HQ9在液態食醋釀造中的應用研究

種子液制備:將HQ9酵母菌接種到YPD培養基中,30 ℃振蕩培養24 h。離心收集菌體,重懸于無菌生理鹽水中,調整細胞濃度約1×108cells/mL;釀酒酵母JM12按照相同的方法制備種子液;醋酸桿菌SFC-YT19接入醋酸發酵液體培養基中,30 ℃、200 r/min搖床培養24 h,制成醋酸菌種子液。

酒精發酵[7]:將大米和水按照1∶3(g∶mL)的比例混合,室溫浸泡16～18 h,打漿?；旌厦诐{中加入適量中溫α-淀粉酶,88～90 ℃液化30 min,分裝后滅菌,冷卻至60 ℃后加入150 U/g糖化酶,自然冷卻至室溫分別接種5%(體積分數)制備的HQ9和JM12種子液,30 ℃下靜置發酵6～8 d,制得米酒。

醋酸發酵:酒精發酵結束后,取發酵醪過濾除掉大米殘渣,清液加適量的無菌水調整酒精度為6%～7%,按10%接種量接入醋酸桿菌SFC-YT19種子液,于30 ℃,200 r/min搖床培養至酸度達到4～8 g/100 mL時,加入2% NaCl終止培養,制得米醋。

1.5 分析方法

1.5.1 總酯含量測定

發酵液總酯含量測定參考CHEN等[8]的方法。取1 mL除菌體后的發酵液加入9 mL去離子水,滴加1～2滴酚酞,用0.1 mol/L NaOH標準溶液(C)滴定至粉紅色,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH標準溶液(Va)置于30 ℃下皂化過夜,再用0.1 mol/L H2SO4標準溶液(C1)反向滴定至紅色剛剛消失。記錄消耗的H2SO4溶液體積Vb,空白培養基作對照。以乙酸乙酯計,總酯含量的計算如公式(1)所示:。

(1)

式中:88.12為乙酸乙酯的摩爾質量分數,g/mol。

1.5.2 總酸含量測定

總酸參考GAO等[9]的方法進行測定。將除菌體后的醋酸發酵液適當稀釋,用0.01 mol/L的NaOH標準溶液進行滴定,總酸以乙酸計。

1.5.3 乙醇濃度測定

發酵液離心去菌體,取2 mL清液按1∶1比例加入乙酸乙酯萃取,用正丁醇作為內標。用氣相色譜分析,FID檢測器,CYCLODEX-B色譜柱;氮氣作為載氣(1.5 mL/min);進樣口和檢測器溫度均為220 ℃;柱溫為50 ℃(5 min),以30 ℃/min逐級增加升溫為240 ℃(3 min)。內標法定量。

1.5.4 葡萄糖和有機酸含量測定

發酵液離心去菌體,取上清液適當稀釋,采用HPLC分析,色譜柱HPX-87H,流動相0.05 mol/L H2SO4。色譜條件:進樣量20 μL,流速0.6 mL/min。葡萄糖糖分析采用示差檢測器(RID-10A),檢測溫度為65 ℃;有機酸分析采用UV檢測器(UltiMateTM3 000 VWD),檢測波長為210 nm,檢測溫度為35 ℃。采用外標法定量。

1.5.5 米醋中揮發物分析

參考呂想等[10]的方法,采用頂空-氣相色譜-離子遷移(headspace gas chromatography ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)測定食醋中揮發性物質。醋酸發酵液離心去菌體,取5 mL清液加入碳酸氫鈉中和,加入頂空樣品瓶中在60 ℃下500 r/min孵育15 min,在85 ℃下自動進樣500 μL。MXT-5毛細管柱(15 m,0.53 mm ID,1 μm FT);柱溫60 ℃;載氣/漂移氣N2(99.999%)。IMS溫度:45 ℃,以正離子模式;載氣體積流量為0～2 min,2 mL/min;2～20 min,2～100 mL/min;20～30 min,100 mL/min;漂移氣流量為150 mL/min。采用正構酮C4～C9校準液計算各物質的保留指數(retention index, RI),基于NIST的RI和IMS數據庫對揮發性化合物進行定性。

1.5.6 感官評價

所用米醋樣品均由10名專業評委組成得小組進行評估(5名女性和5名男性),他們被認為對區分氣味敏感。在向評委展示之前,樣品被倒入玻璃杯中,隨機編號。所有評委根據米醋的味道和香氣,使用0(非常差)～8(優秀)等級評分[11]。

1.6 統計分析

使用Origin 2023軟件(OriginLab,Northampton)對數據作圖;IMS儀器軟件Gallery Plot插件繪制指紋圖譜;SPSS 22軟件進行數據單因素方差顯著性分析。數值表示為均數±標準差[12]。

2 結果與分析

2.1 產香酵母的分離、篩選及鑒定

從幾種食醋發酵常用大曲中通過平板分離共篩選到24株酵母菌,隨后對菌株發酵產酯能力進行考察。通過感官嗅聞選擇其中6株香氣愉悅且特征鮮明的菌株,對其發酵液中總酯和乙醇含量進行分析,結果見表1。由表1看菌株HQ9總酯產量最高,達到(7.46±0.87) g/L,和文獻報道的生香酵母相比總酯產量比較高[13-14]。另外,HQ9還具有較好的酒精生產能力,乙醇產量達到(61.02±0.81) g/L。而菌株JQ6乙醇產量最高,達(68.24±0.57) g/L,但產總酯僅為(2.69±0.45) g/L,綜合分析,從改善產品風味品質角度,選擇HQ9酵母菌株為進一步研究的對象。

表1 篩選菌株產酯、產醇和香氣評價Table 1 Screening strain ester production, alcohol production and aroma evaluation

菌株HQ9在YPD固體培養基上30 ℃培養24 h后,其結果如圖1所示。菌落呈現圓形、乳白色、表面凸起、光滑,邊緣整齊,菌體細胞呈圓形或橢圓形,出芽繁殖,通過ITS rDNA序列測定和分析HQ9菌株初步鑒定為光滑假絲酵母(Candidaglabrata)。

圖1 菌株HQ9的菌落形態及顯微形態

2.2 菌株HQ9生長特性

米醋生產過程酵母的生長代謝與環境密切相關。食醋釀造酒精發酵階段屬于高糖、高乙醇含量以及偏酸性環境,用于生產過程強化的微生物菌株需要具有對生產環境條件的適應和耐受能力。菌株HQ9在不同起始葡萄糖質量濃度下的生長情況如圖2-a所示,在起始糖質量濃度150 g/L時,菌體濃度最高,且在300 g/L糖質量濃度高滲環境中仍能生長,說明菌株具有一定高滲透壓耐受性。如圖2-b所示,隨著培養基乙醇濃度增加HQ9生長雖然逐步受到抑制,但在200 g/L的高質量濃度乙醇環境中仍能生長,表明HQ9能夠很好地適應酒精發酵環境。菌株HQ9在不同溫度下生長情況如圖2-c所示,菌株HQ9生長溫度范圍較寬,最適生長溫度為30～35 ℃,但在40 ℃仍能很好的生長;同時,菌株HQ9 pH值適應性考察結果見圖2-d,pH值適應范圍較寬,最適生長pH為4.0～5.0,當pH為2.0～3.0仍然生長良好,說明菌株HQ9具備良好的耐酸能力。

a-葡萄糖質量濃度;b-乙醇質量濃度;c-溫度;d-pH值

2.3 菌株HQ9在液態米醋釀造中的應用

2.3.1 米醋的制備

以釀酒酵母JM12為對照,比較研究考察了菌株HQ9酒精發酵進程,2株菌株發酵過程葡萄糖消耗和乙醇生產速率分別見圖3-a和圖3-b。結果顯示,釀酒酵母JM12酒精發酵能力更強、速度更快,6 d內酒精發酵基本結束,產率達到(11.75±1.8)%;HQ9發酵速度略慢,但仍有較高的乙醇產率,達到(10.65±2.8)%,并且產酯類物質能力較好達到160.97 μg/kg,能夠滿足醋酸發酵需求,具有應用于液態米醋生產的良好潛力。酒精發酵完成后,過濾去除米渣,濾液加入無菌水調整酒精度為6%～7%,接入醋酸桿菌SFC-YT19搖床培養至酸度達到4～8 g/100 mL結束發酵離心去菌體,然后對醋酸發酵液進行分析。

2.3.2 米醋有機酸分析

米醋總酸和有機酸含量液相色譜分析結果如表2所示。結果表明,生香酵母可代謝產生風味有機酸類,有機酸又可被轉化生成酯類、醛類等風味物質,影響食醋整體品質。菌株HQ9酒精發酵獲得的醋酸發酵液總酸含量和醋酸含量比菌株JM12稍低,但其他有機酸含量較JM12有所增加。單純醋酸刺激性強,檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等不揮發酸的存在可以緩和醋酸刺激性,使食醋的味道更柔和豐富[15]。

表2 米醋樣品中有機酸種類和含量 單位:g/LTable 2 Types and contents of organic acids in rice vinegar samples

2.3.3 菌株HQ9對米醋揮發性物質的影響

采用HS-GC-IMS技術分析2種食醋樣品中的揮發性風味物質。將菌株HQ9應用發酵米醋,樣品中共檢測到55個共有香氣成分,其中醇類7種、酯類13種、醛類6種、酮類9種、酸類2種,呋喃類2種和其他4種,未定性12種(未定性未列出),結果見表3。菌株JM12酒精發酵米醋樣品酯類中除乳酸乙酯含量較高外,其他酯類含量大多都低于HQ9酒精發酵樣品,7種醇類物質只有異丁醇高于HQ9,而醛類和酮類物質JM12含量相對高些,6種醛類化合物有苯甲醛等3種高于HQ9,9種酮類化合物有3-羥基丁酮等6種高于HQ9發酵,所以釀酒酵母JM12酒精發酵所制得米醋樣品的醇和酯含量低于HQ9,醛酮類物質含量高于HQ9發酵。醇類和酯類是食醋中占比最大的風味物質,酯類物質可以產生強烈的水果香味和花香味[16],適量高級醇可以增加食醋香氣濃厚感[17],豐富了食醋香味層次。結果如圖4、圖5所示,從2種食醋樣品的揮發物指紋圖譜比較和主成分差異性分析也可以看出2組米醋風味差異明顯。

圖4 不同米醋樣品中揮發性化合物的指紋圖譜

圖5 不同米醋樣品的主成分分析圖

表3 米醋揮發性成分種類及含量變化Table 3 The variation of volatile components species and content in rice vinegar

2.3.4 感官品評

在儀器分析的基礎上,本文對HQ9菌株發酵酒精制得的米醋樣品進行了感官品評,結果如圖6所示,2種米醋樣品外觀色澤差異不明顯,而口感和香氣方面,菌株JM12酒精發酵米醋樣品酸味刺激性較強,香氣稍顯單薄。相比之下,以HQ9酒精發酵米醋樣品具有蘋果果香,花果香更濃郁,口感和味道都優于菌株JM12樣品組。

圖6 米醋感官品評結果

3 結論

酒精發酵是食醋釀造的關鍵工藝之一,傳統食醋多采用釀酒曲作為發酵劑,為了簡化工藝、提高效率,也可以使用釀酒酵母進行純種發酵,采用普通釀酒酵母酒精發酵速度快,但酒體香氣單薄,嚴重影響食醋的品質。篩選具有優秀產酯能力的菌株進行酒精發酵或輔助發酵是改善食醋風味品質的重要手段之一[18-20]。本文采用人工嗅聞結合儀器分析從釀酒曲中篩選到一株光滑假絲酵母菌株HQ9,以含15%葡萄糖的培養基進行搖甁培養,菌株HQ9產總酯達(7.46±0.87) g/L,研究發現該菌株同時具有乙醇發酵能力,乙醇產率達(61.02±0.81) g/L,對30%(體積分數)葡萄糖濃度的高滲透壓、20%(體積分數)乙醇濃度等環境具有良好的耐受性,能夠很好地適應液態食醋的生產環境。以釀酒酵母JM12為對照,考察了HQ9用于米醋發酵對食醋風味的影響。有機酸分析結果顯示,HQ9酒精發酵所制米醋樣品醋酸含量略低,但檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等非揮發性酸含量較高,酸味更柔和。揮發性風味物質分析發現JM12酒精發酵米醋樣品醛酮類物質含量高于HQ9發酵樣品,但醇和酯含量均低于HQ9。感官評價顯示HQ9酒精發酵所制得米醋香氣濃郁、酸味柔和、整體味道愉悅,可以明顯提升液態米醋的感官品質和風味。研究結果表明,產香酵母HQ9菌株具有良好的工業化應用潛力。