食用酵母提取物通過上調Nrf-2改善皮膚衰老模型小鼠抗氧化水平

付少委,秦修遠*,張卓然,李明亮,馮志遠,欒金玲,任瑋,程倩*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015)2(北京市蛋白功能肽技術研究中心,北京,100015)3(酵母功能湖北省重點實驗室 宜昌市營養健康食品工程技術研究中心,湖北 宜昌,443003)

衰老是生命過程中的一種自然現象[1]。隨著生物體的不斷衰老[2],機體不僅會產生各種組織器官疾病[3],皮膚也會加速、加重老化,出現皮膚膠原流失、彈性下降、膚色暗沉等現象[4],嚴重影響生產建設核心人群的生活和工作體驗。根據第一財經商業數據中心(CBN Data)與聚劃算、強生聯合發布的《健康生活消費趨勢報告》顯示,抗衰老產品已成為天貓等電商平臺食品、化妝品、保健品等快消品中最熱門的搜索詞匯之一,且對消費人群的調查顯示,全年齡段消費者對抗衰老產品均具有強烈需求。

長期人口干預研究、實驗室調查和動物研究表明,皮膚老化受到內源性因素調控和外源性因素影響。內源性老化主要受到內在因素基因組和激素等調控[2],而外源性老化與外在環境紫外線和環境污染等因素均相關。同時,組織及細胞內部的炎癥、氧化及糖化反應也會對細胞和組織造成不同程度的損傷[5]。晚期體內糖基化終末產物(advanced glycosylation end products,AGEs)累積會消耗細胞天然存在的等抗氧化成分,產生更多的活性氧(reactive oxygen species,ROS);此外,糖基化也可與細胞表面受體結合,被激活后觸發細胞NF-κB信號通路,引發炎癥反應和原有細胞因子的表達[6]。隨著各項研究的報道,人們逐漸認識到營養膳食因素與皮膚之間的關系[7],在飲食模式更健康的人群中,面部細紋和皺紋更少[8-9],或是皮膚色素變化更少[10],皮膚萎縮和干燥情況更少[11]。因此,尋找有效預防皮膚衰老發展的營養干預方式,對于延緩炎癥和氧化等途徑引起的衰老具有十分重要的現實意義。

酵母提取物是一種天然安全的活性物質,作為天然調味料或者油類食品的抗氧化劑在食品工業中有廣泛應用[12]。隨著研究的不斷深入,酵母提取物因獨特的功效[13],已作為一種新型的化妝品原料,應用于高檔化妝品中。酵母提取物中富含氨基酸、多肽及維生素等營養物質,氨基酸是人體必需的物質,可以被皮膚輕松吸收,有助于保濕和修復皮膚屏障,改善皮膚狀態;多肽可以促進角質細胞的新陳代謝,讓皮膚變得更加光滑有彈性,并能抑制黑色素的產生。此外,酵母提取物中還含有維生素A、C、E等成分,這些成分具有抗衰老、抗氧化和美白等作用。有研究表明酵母提取物可以通過抑制或競爭的形式降低多酚氧化酶的活性,減少黑色素的形成,并可以抑制B16黑素瘤細胞中黑素的形成,但對其增殖無顯著抑制作用[14]。成纖維細胞可以不斷產生膠原蛋白、透明質酸、彈性纖維等支撐皮膚年輕態的物質,令皮膚看起來光滑有彈性,而來源于米酒酵母提取物有促進成纖維HS68細胞增殖的功效[15]。研究表明酵母提取物表現出的多種活性多數都與其含有的谷胱甘肽(glutathione,GSH)相關[16]。GSH是一種重要的抗氧化劑,由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸經肽鍵縮合而成,是廣泛存在于動植物、微生物體內的同時具有谷氨酸基和巰基的小分子活性三肽,其結構中的半胱氨酸殘基含有一個活潑的巰基,具有強親核特性,可以對抗活性氧、結合親電子物質或其他氧化代謝產物,具有清除自由基、增強抗氧化物酶活性、提高機體抗氧化防御能力等重要生理功能[17-19]。GSH有利于皮膚美容和抗衰老,機體補充GSH(250 mg/d)能夠積極影響皮膚性能,在口服GSH 12周期間,受試者皮膚黑色素指數、紫外斑(皮膚色素)、局部位置皺紋數量等衰老指標均低于安慰劑組,且皮膚彈性增加的趨勢也更優[20-21]。

鮮有關于食用酵母提取物有助于改善皮膚衰老的研究報道。因此,本研究以D-半乳糖誘導建立衰老動物實驗模型,將不同劑量的酵母提取物喂養小鼠一段時間后,稱量體重監測小鼠生長營養情況,并利用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色技術,考察血清和皮膚組織中的氧化應激相關指標,利用Western Blot檢測氧化應激調控蛋白的相對含量,探究食用酵母提取物對衰老小鼠皮膚老化抗氧化水平的改善作用,為酵母提取物在皮膚抗衰老、美容等功能方向的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母提取物FHG-1(利用高谷胱甘肽酵母進行發酵、洗滌、高壓均質破壁、酶解、分離、濃縮以及干燥得到樣品),安琪紐特股份有限公司;雄性ICR小鼠[SCXK(京)2019-0010;NO.110324220100569744],斯貝福(北京)生物技術有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),默克公司;NRF-2 Polyclonal Antibody,Proteintech中國公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀,美國貝克曼;Millipore Elix 15純水儀,默克化工有限公司;ST2100實驗室pH計,奧豪斯儀器(常州)有限公司;EL104電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;80-2離心沉淀器,江蘇省金壇市醫療儀器廠;79-1磁力加熱攪拌器,國華電器有限公司;WB-10L1恒溫水浴鍋,德國Memmert公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建小鼠皮膚衰老模型和實驗分組

采用D-半乳糖頸背部皮下注射法致小鼠皮膚衰老模型。雄性ICR小鼠,體重(25±5) g,隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、陽性組(GSH)、酵母提取物低劑量組(LYE)、酵母提取物中劑量組(MYE)、酵母提取物高劑量組(HYE),除對照組和模型組每組24只外,其余各組12只。適應性培養3 d后,對照組每天灌胃生理鹽水0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射無菌生理鹽水0.2 mL/只,連續42 d。模型組每天灌胃生理鹽水0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續42 d。GSH:每天灌胃20 mg/kg還原型谷胱甘肽0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續42 d。LYE組:每天灌胃85 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續42 d。MYE組:每天灌胃170 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續42 d。HYE組:每天灌胃340 mg/kg酵母提取物0.2 mL/只,連續70 d,從灌胃第29天起,每天于頸背部皮下注射1 000 mg/kg無菌D-半乳糖0.2 mL/只,連續42 d。每周稱量1次體重。從第71天起,取小鼠糞便,以異氟烷麻醉小鼠,采用眼球摘除放血法處死小鼠,取眼眶血及皮膚組織。劑量選擇[22]設置依據為人(以60 kg計)每日攝入GSH的梯度為50、100、200 mg,將GSH折算酵母提取物為417、834、1 668 mg,即對應低劑量、中劑量、高劑量。采用動物實驗與人劑量換算公式(1),得到小鼠灌胃劑量為85、170、340 mg/kg。

HED(mg/kg)=Animal does (mg/kg)×Animal Km/Human Km

(1)

1.3.2 小鼠體重監測

每周對各組飼養的小鼠進行稱重,記錄數據進行分析。

1.3.3 皮膚組織形態學觀察

小鼠皮膚固定:將取下的新鮮小鼠皮膚組織置于體積分數4%多聚甲醛固定液中固定,注意存放的EP管中不留空氣。石蠟切片制作:流水沖洗固定的組織,分別經體積分數70%、80%、90%各級乙醇溶液各脫水30 min,再分別經95%、100%乙醇各脫水2次,20 min/次。取出脫水的組織置于V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1的混合液15 min,之后再浸入二甲苯兩次,15 min/次直至組織呈現透明狀態。取出透明的組織放入V(二甲苯)∶V(石蠟)=1∶1的混合液15 min,之后再浸入石蠟2次,60 min/次。透蠟后,將組織置于事先備好的純石蠟蠟模,進行包埋,待凝固后用切片機切片。脫蠟復水:將完整的石蠟切片浸入二甲苯中2次,每次20 min,之后用無水乙醇浸潤2次,每次5 min。再用75%乙醇溶液脫蠟5 min后,用蒸餾水浸潤。HE染色:切片置于蘇木精染色5 min,蒸餾水洗凈多余染液,10 g/L鹽水溶液分化10 s,繼續蒸餾水漂洗,以體積分數0.6%氨水浸泡至返藍,蒸餾水流動沖洗數10 s。再將切片置于體積分數85%乙醇和95%乙醇溶液中依次脫水,放入伊紅染液中染色5 min。脫水封片:經HE染色切片放入無水乙醇中脫水3次,每次5 min,再放入正丁醇中5 min,再放入二甲苯中2次,每次5 min直至透明。將切片稍晾干,以中性樹膠封片。

1.3.4 抗氧化指標檢測

利用試劑盒取小鼠血液樣本檢測血清GSH-Px、MDA、SOD情況。

1.3.5 小鼠皮膚組織調控蛋白的表達

將小鼠皮膚組織在RIPA裂解液中徹底均質,4 ℃低溫離心獲得總蛋白,測定蛋白質濃度后,加入蛋白質上樣緩沖液,高溫水浴5 min變性蛋白質。用100 g/L SDS-PAGE對20 μg蛋白質進行取樣,并轉移到PVDF上,使用50 g/L脫脂乳粉封閉2 h。洗凈PVDF膜,4 ℃下一抗孵育過夜,洗凈后,二抗孵育2 h,通過強化化學發光檢測系統最終顯示蛋白質條帶,并使用Image J圖像分析軟件進行蛋白相對定量分析。

1.4 數據分析

利用Origin 2023進行數據分析,結果均以平均值±標準差表示,組間比較采用ANOVA 單因素分析,P>0.05為無顯著性差異,P≤0.05為差異性顯著,P≤0.01為差異性極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重變化情況

如表1所示,經過4周喂養和6周造模,各組小鼠體重均有增加,模型組與空白組無顯著性差異,陽性組和酵母組與模型組無顯著性差異。但與空白組相比,模型組小鼠體重有下降,而經GSH或不同劑量的酵母提取物灌胃,小鼠體重較模型組均有增加,并且隨著酵母提取物的劑量增加而呈劑量依賴,這說明利用不同劑量的酵母提取物可以改善小鼠營養生長情況。

表1 小鼠10周體重變化統計表 單位:g

2.2 皮膚組織形態學觀察結果

如圖1所示小鼠皮膚組織切片HE染色結果與空白組相比,模型組表皮層增厚明顯,棘層肥厚,真皮組織增厚,真皮乳頭減少,與表皮的連接緊密性下降,毛囊數量下降,皮脂腺分布異常,彈力纖維斷裂明顯,膠原纖維等結締組織增生明顯;陽性組與空白組較為接近。經過不同劑量的酵母提取物灌胃后,小鼠皮膚組織表皮層增厚情況有明顯改善。低劑量的酵母提取物灌胃組真皮層較模型組有恢復,但彈力纖維仍斷裂或流失明顯,皮脂腺異常情況較嚴重,中劑量酵母提取物組與陽性組接近,高劑量組皮脂腺雖然分布較少,但彈力纖維和膠原纖維恢復情況與陽性組接近。

a-空白組;b-模型組;c-陽性組;d-酵母低;e-酵母中;f-酵母高

2.3 小鼠血液抗氧化指標檢測結果

MDA含量、SOD以及GSH-Px是反映機體抗氧化能力的重要參數。如圖2～圖4所示,經過D-半乳糖誘導的模型組小鼠,與空白組相比其血清MDA積累量顯著增加,GSH-Px活性升高,盡管SOD活性變化不顯著,但與空白組相比也有提升的作用。MDA是脂質過氧化反應中產生的過氧化物,在體內新陳代謝中起到重要作用,其含量的變化反映了機體組織細胞受自由基攻擊的嚴重程度[23],被視為細胞過氧化損傷程度的標志物[24]。圖2結果表明,D-半乳糖引起小鼠血清產生氧化應激,致使MDA釋放,而灌胃GSH的陽性組能夠將MDA含量下降到空白組水平,灌胃不同劑量的酵母提取物對產生氧化應激反應的小鼠有不同程度的影響。在低劑量條件下,小鼠血清MDA含量與模型組相比相差不大,說明灌胃低劑量的酵母提取物對小鼠的氧化應激反應未起到明顯的調節作用,而當劑量提高一倍(中劑量)時,MDA含量下降至與空白組同等水平,劑量再提高結果和中劑量相差不大,說明灌胃中劑量的酵母提取物是小鼠調節氧化應激反應時最合適的營養補給。

圖2 MDA含量變化情況Fig.2 The change of MDA content

如圖3和圖4所示,機體清除自由基的抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px等,這些酶構成了細胞內的防御系統,可以通過一系列連鎖反應來協調自由基的清除?？寡趸傅幕钚运綄τ诰S持超氧自由基和H2O2的穩定狀態具有重要作用,SOD能夠催化活性高的O2-變為超氧陰離子或者H2O2[25],GSH-Px可以分解H2O2和有機過氧化物(ROOH),這些是清除自由基的關鍵,并且能夠催化過氧化物與GSH反應,從而起到保護作用[26]。與空白組相比,模型組的SOD活性有增強的效果,但無顯著性差異;GSH-Px活性顯著升高,表明D-半乳糖的攝入激活了小鼠機體酶抗氧化防御系統,主要以GSH-Px來防御氧化應激。灌胃GSH及酵母提取物能夠有效調節小鼠機體抗氧化防御系統,特別是當灌胃劑量達到中劑量時,GSH-Px活性可恢復到空白組水平,并且當劑量再升高時,效果與中劑量無明顯差異。各實驗組的SOD活性盡管無顯著性差異,但變化趨勢與GSH-Px活性一致。

圖3 SOD活性變化情況Fig.3 The change of SOD activity

圖4 GSH-Px活性變化情況Fig.4 The change of GSH-Px activity

2.4 Western Blot蛋白定量結果

核因子紅血球相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作為細胞感受氧化還原狀態的關鍵轉錄調控因子,是細胞抗氧化系統中的關鍵調控蛋白[27],外界的損傷因素能夠激活Nrf-2并使之轉位進入細胞核,進而啟動多種抗氧化酶的轉錄、增強局部組織的抗氧化能力,有助于減輕外界損傷因素所造成的氧化應激反應程度[28-29]。當機體處于氧化應激狀態時,可以通過活化特異的轉錄調控因子Nrf-2來實現對機體的保護;當機體受到氧化應激刺激時,親電物質誘導一種肌動蛋白結合蛋白發生構象變化而釋放Nrf-2或者通過誘導信號調節通路激活Nrf-2,進而啟動編碼抗氧化應激蛋白的基因轉錄來保護機體免受氧化損傷[30]。如圖5所示,與空白組相比,模型組Nrf-2蛋白顯著降低,陽性組和灌胃不同劑量酵母提取物組的Nrf-2蛋白含量顯著提升,其中中劑量的Nrf-2蛋白的含量較高,進一步說明中劑量的酵母提取物在應對氧化應激損傷時,發揮重要的作用,同時也證實酵母提取物可以幫助機體上調Nrf-2蛋白來實現對機體的保護,免受氧化損傷,進一步發揮抗衰老的作用。李萌茹[31]利用黃岑葉提取物調節Nrf-2信號通路來調節相關蛋白的表達,Nrf-2是參與氧化還原反應的敏感轉錄因子,也是反映細胞發生氧化應激的關鍵指標之一,參與調節細胞抗氧化防御系統,處于抗氧化應激的中心地位,從Nrf-2信號通路著手進一步探究黃岑葉提取物的抗衰老作用機制。

a-Nrf-2 Western Blot蛋白印跡結果;b-Nrf-2蛋白表達量

3 結論

本研究采用D-半乳糖誘導建立皮膚衰老動物模型,以GSH作為陽性對照,利用不同劑量的酵母提取物進行干預后,檢測小鼠血液和皮膚組織。HE染色結果表明灌胃酵母提取物的小鼠皮膚組織表皮層增厚情況有明顯改善;酵母提取物實驗組小鼠抗氧化酶效果有明顯提升,血清中的GSH-Px活性和MDA含量隨著酵母提取物劑量的增加,抗氧化水平也進一步提高,逐漸趨于空白組水平,在中劑量時可達到陽性組的水平;通過Nrf-2蛋白相對定量可知酵母提取物是通過上調Nrf-2蛋白來減輕衰老所造成的氧化應激反應。綜上,食用酵母提取物主要是從減輕抗氧化應激途徑進一步實現抗衰老作用,主要是從降低MDA等過氧化物和提升機體GSH-Px酶活性等抗氧化防御系統實現,中劑量(170 mg/kg)酵母提取物具有較好的抗氧化效果。