五種產香酵母對發酵耙豌豆揮發性風味物質的影響

楊鐮,鄧靜,朱建倉,王天楊,吳寶珠,易宇文,喬明鋒,鐘世榮*,吳華昌*

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 宜賓,644000)2(四川旅游學院 烹飪科學四川省高等學校重點實驗室,四川 成都,610100)

耙豌豆是四川的特色醬料,是以豌豆為原料,經高壓蒸制或煮制而成的一種調味品,因其軟爛綿密、豆香鮮美而深受四川地區人民的喜愛。耙豌豆廣泛應用于豆湯飯、豌雜面、豆湯魚、蹄花湯等傳統家庭菜肴中。目前耙豌豆均為傳統家庭或小作坊式生產,產品品質良莠不齊,安全性有待提高,另外經簡單蒸煮工藝制作的耙豌豆風味不足,并伴有豆腥味[1-2]。安琪酵母(Saccharomycescerevisiae)發酵性能好,能快速啟動發酵反應,廣泛應用于面包、酒類等發酵制品[3]。魯氏酵母(Zygosaccharomucesrouxii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candida)和畢赤酵母(Pichia)等酵母菌作為發酵過程中重要的功能菌群,在傳統發酵豆類食品的發酵過程中起主要增香作用[4]。發酵是食品增香的有效方法,酵母菌作為傳統發酵食品的常用微生物,能夠產生豐富的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和糖分解酶[5]。這些酶通過代謝糖類、蛋白質等大分子物質,形成氨基酸、酸類和醇類等小分子呈味物質,賦予產品特殊發酵香氣,豐富產品風味[6]。李志江等[7]用Z.rouxii發酵大豆豆醬,豆醬的感官和理化品質顯著提高,豆醬的揮發性香氣成分明顯增加。龐惟俏等[8]運用Z.rouxii和耐鹽表皮葡萄球菌復合發酵的寶泉醬具有較好的發酵風味。

風味是發酵食品的重要品質特征,揮發性風味物質是風味的重要組成成分。電子鼻[9]是模擬人體的嗅覺,利用氣體傳感器陣列的響應值來識別氣味的電子系統,其具有響應時間短、檢測快速、測定范圍較廣、重復性好,能挖掘人鼻不能嗅聞的氣體等優點,在食品行業發揮著越來越重要的作用,但電子鼻無法鑒定具體揮發性風味物質[10-11]。而GC-MS是分離、鑒定物質的有效工具。電子鼻和GC-MS在豆醬整體氣味輪廓及物質的定性定量領域有廣泛應用。龐惟俏等[8]運用電子鼻結合GC-MS區別了3種優勢菌種對寶泉醬的香氣成分的影響。CHEN等[12]通過GC-MS標記了瀏陽豆豉中的關鍵風味物質。

本研究運用5種常用產香酵母菌(S.cerevisiae、Pichia、Saccharomycescerevisiae、Zygosaccharomucesrouxii和Candida)對耙豌豆進行固態發酵5 d。通過電子鼻和GC-MS對不同酵母菌發酵的耙豌豆的揮發性風味物質進行分析,并結合主成分分析和偏最小二乘-判別分析(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)模型分析5種酵母菌發酵耙豌豆的香氣組成差異,采用變量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)確定不同酵母菌發酵耙豌豆中的關鍵香氣物質,旨在為開發發酵型耙豌豆產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白豌豆,北京金禾綠源農業科技有限公司;S.cerevisiae,安琪酵母股份有限公司;S.cerevisiae、Z.rouxii,實驗室保藏菌株;季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis),唐紅梅等[13]由腌菜中篩選;麥芽汁培養基,廣東中山百微生物技術有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基,北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SQ680氣相色譜-質譜聯用儀、Elite-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國珀金埃爾默儀器有限公司;FOX4000電子鼻,法國Alpha MOS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將凍藏于-60 ℃的5株酵母菌株分別接種于已滅菌處理的麥芽汁液體培養基中,搖床培養(30 ℃,170 r/min)24 h。將活化后的酵母菌接種于PDA培養基中30 ℃培養2 d。挑取單菌落于麥芽汁液體培養基中搖床培養(30 ℃,170 r/min)36 h,調整菌種懸液濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

用蒸餾水泡發豌豆12 h,取300 g泡發后的豌豆加入1 000 mL錐形瓶中,按料液比為1∶0.9(g∶mL)加入蒸餾水270 mL。將豌豆進行121 ℃,15 min蒸煮處理,冷卻后即為耙豌豆。將5種酵母菌菌懸液以2%接種量分別接種于耙豌豆中,移入培養箱中30 ℃固態發酵5 d。S.cerevisiae、Pichia、S.cerevisiae、Z.rouxii和Candida發酵耙豌豆樣品分別命名為A、B、C、D和E,未發酵耙豌豆樣品命名為F。發酵結束后,將樣品放入-60 ℃條件下儲藏備用。

1.3.3 電子鼻檢測

每份取1.0 g發酵耙豌豆樣品,置于10 mL頂空瓶中。70 ℃加熱5 min,進樣針吸取1 mL頂空氣體進樣分析。載氣(合成干燥空氣)流速150 mL/min,數據采集時間120 s,延滯時間300 s。檢測結束后,以18個傳感器的響應值進行統計分析。每個樣品設置10組平行,選取穩定后的3組數據進行分析處理。

1.3.4 GC-MS檢測

樣品前處理:取發酵耙豌豆樣品4.0 g裝入20 mL頂空瓶,用GC-MS專用瓶蓋密封,裝入自動進樣器,備用。

萃取及進樣條件:萃取溫度70 ℃,進樣針溫度75 ℃,傳輸線溫度75 ℃,萃取時間1 800 s,干吹120 s,解析10 s,頂空瓶加壓/釋壓120 s,捕集阱保持240 s,捕集阱循環4次。

氣相條件:載氣(99.999% He),流速1.0 mL/min。由室溫升至80 ℃保持2 min,然后以4 ℃/min升至180 ℃,保持3 min,再以5 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。

質譜條件:EI離子源,電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230 ℃,電子倍增電壓1 650 V;質量掃描范圍:45～450m/z;標準調諧文件。

1.4 數據處理

利用軟件SPSS 26.0進行方差分析;用Origin 2021軟件對電子鼻數據進行分析;采用SIMCA 14.0對GC-MS定量結果進行PLS-DA、聚類分析及VIP值計算;利用R語言(R 4.2.3)繪制Upset圖和熱圖。

2 結果與分析

2.1 發酵耙豌豆電子鼻檢測分析

由圖1-a可知,6種耙豌豆樣品對18個傳感器的特征響應值均在1.2以下,且對LY 2/LG、LY 2/G、LY 2/AA、LY 2/Gh、LY 2/gCTI、LY 2/gCT傳感器不敏感,在傳感器PA/2、P 30/1、P 40/2和P 30/2上的響應值較高,結合表1可知,乙醛類、醇類、甲硫醇和α-松油醇類化合物是其主要揮發性物質。發酵耙豌豆(A、B、C、D、E)與未發酵耙豌豆(F)的傳感器響應值差異較大,表明酵母菌發酵對耙豌豆揮發性風味有影響,發酵耙豌豆與未發酵耙豌豆整體風味差異較大。A與B樣品在傳感器上的響應值差異最小,初步判定S.cescerevisiae與M.guilliermondii發酵耙豌豆的整體風味較相似。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of electronic nose sensors

為了進一步確定不同酵母菌發酵耙豌豆的香氣差異,通過主成分分析對數據進行統計分析,由圖1-b可知,PC1和PC2的貢獻率分別為84.8%和13.5%,累積貢獻率大于80%,表明兩個主成分可以呈現發酵耙豌豆的香氣特征信息。5種發酵耙豌豆(A、B、C、D和E)與未發酵耙豌豆(F)的距離較遠,表明發酵耙豌豆與未發酵耙豌豆整體香氣差異較大。A、B和D樣品在PC 1的距離較近,C與F的距離最遠,表明S.cerevisiae、Pichia和Z.rouxii發酵耙豌豆的整體風味相似,S.cerevisiae發酵耙豌豆和未發酵耙豌豆的整體風味差異最大。

2.2 發酵耙豌豆中揮發性風味物質成分分析

由電子增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036377)和圖2可知,6種發酵耙豌豆樣品中共檢測出69種揮發性物質,包括酯類、酸類、醇類、醛類、烴類、酮類及其他化合物。醇類和酸類是主要物質。與未發酵耙豌豆對比,發酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇類物質的相對含量和種類數量均增加。醇類物質是由乳酸菌及酵母菌在發酵過程中,通過氨基酸脫羧、脫氫或脂代謝產生[14]。醇類物質共27種,相對含量最高,各樣品的醇類物質相對含量為32.69%～64.77%;其次是酸類物質,共15種,各樣品的相對含量為15.14%～53.43%。醇類和酸類物質的相對含量遠高于其他類化合物。烴類、醛類、酯類、酮類和其他類化合物分別為4、6、7、2和8種,烴類、醛類和其他類化合物的相對含量較低,這也同ZHANG等[15]發酵大豆醬的研究結果一致。E樣品中揮發性風味物質的種類數量最多,多于未發酵耙豌豆14種,表明Candida發酵耙豌豆能提高耙豌豆風味的豐富度。

a-物質相對含量;b-物質種類數量

醇類物質賦予了耙豌豆醇香風味,由電子增強出版附表1可知,同未發酵耙豌豆相比,發酵耙豌豆(A、B、C、D、E)中異戊醇、異丁醇和2-甲基丁醇的相對含量均上升。異戊醇主要由S.cerevisiae通過合成代謝途徑和Ehrlich途徑合成,使發酵耙豌豆口感醇厚,增強香氣復雜度[16],其對豆豉形成特有醬香風味有顯著貢獻[17]。2-甲基丁醇的含量在A、C、D和E 4個樣品中相對含量上升較多,分別增加到2.86%、3.27%、2.60%和2.93%,賦予發酵耙豌豆甜香、麥芽香,其也是醬油、黃豆醬中的揮發性香氣物質[18]。A、D樣品中乙醇的含量均較高,分別為24.14%和8.69%,因此S.cerevisiae和Z.rouxii發酵耙豌豆醇香、花香較濃郁,乙醇來源于酵母菌對氨基酸和糖類化合物的發酵代謝[19]。還原糖和氨基酸態氮水平的升高為酵母菌提供了物質基礎,使醇類富集[20]。A中異丙醇含量較高,而D中異戊醇含量較高,因此S.cerevisiae發酵耙豌豆呈現水果香氣,Z.rouxii發酵耙豌豆呈現果香、麥芽香氣。E中異丙醇的含量最高,為53.91%,賦予Candida發酵耙豌豆濃郁水果香氣,這也是Candida發酵耙豌豆與其他耙豌豆樣品香氣差異顯著的原因,與電子鼻結果也相符合。

酸類物質賦予耙豌豆溫和的酸味和香氣。酸性化合物的產生與微生物密切相關,在發酵過程中,微生物降解蛋白質和碳水化合物產生對風味貢獻顯著的小肽、氨基酸和糖類,并進一步代謝形成揮發性有機酸[21]。與未發酵耙豌豆相比,A、B和C的酸類物質相對含量均上升。B、C中甲酸的相對含量顯著上升,分別高于未發酵耙豌豆19.86%和21.92%。D中迭氮酸含量最高且為36.31%,呈現刺激性氣味。

酯類化合物可通過有機酸和醇類酯化反應得到。未發酵耙豌豆樣品中酯類物質相對含量為1.63%,酵母發酵耙豌豆樣品中酯類物質含量均增加。A、B、C、D和E樣品中酯類物質相對含量分別為4.68%、2.21%、4.39%、10.85%和2.83%。D中的乳酸乙酯賦予發酵耙豌豆朗姆酒、奶油香氣。酯類物質中乙酸乙酯和3-甲基苯酚甲酯的相對含量較高,其中A和C中的乙酸乙酯含量較高,賦予發酵耙豌豆水果香氣,可能是由于S.cerevisiae和S.cerevisiae所產的乙醇和乙酸較高,而乙酸乙酯含量與乙酸含量直接相關[22]。

醛類物質賦予發酵豆類食品特殊風味[23]。發酵耙豌豆中醛類物質種類及相對含量都較少。發酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中己醛的相對含量均下降,己醛是豆腥味的主要物質[24-25]。表明酵母菌發酵能減弱耙豌豆的豆腥味。

為可視化6種發酵耙豌豆揮發性物質的差異,對69種揮發性物質進行熱圖分析。圖3-b是高階韋恩Upset圖,能夠更直觀的表現出多個樣品之間的交互情況。圖中左下角的柱狀圖表示不同發酵耙豌豆樣品的揮發性物質的種類數,上方柱狀圖和下方點線圖表示不同樣品之間交集數量和交集形式[26]。在下方點線圖中,集合參與一個交集,則黑色圓填充相應的矩陣單元格,反之則顯示淺灰色圓。每一列中最上面和最下面的黑色圓之間用黑線連接,表示集合之間的相交關系[27-28]。由圖3-a和圖3-b可知,6種發酵耙豌豆中揮發性物質的含量差異較大,共有揮發性物質僅為5種,包括乙酸乙酯、甘油三亞油酸酯、1-甲氧基-丁烯、鈣磷酸和甲乙醚。丙二醇、2-羥乙基甲酸酯、5-乙炔酸、乙基烯丙基醚、?；撬岷?-甲氧基-丁醇等物質在A和B中的相對含量都較高,表明S.cerevisiae和Pichia發酵耙豌豆的整體風味較相似,且與電子鼻分析結果相符合。E中相對含量較高的揮發性物質數量最多,而A、B和C樣品中數量較少,表明Candida發酵能提高耙豌豆風味的豐富度。3-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯在未發酵耙豌豆中的含量最低,在發酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中含量均增加,這些酯類和醇類物質分子量小且易揮發,對耙豌豆的香氣貢獻為濃郁的果香和甜味。

a-聚類熱圖;b-物質種類Upset圖

2.3 發酵耙豌豆中揮發性物質PLS-DA

PLS-DA是一種有監督的分析方法,能對數據進行降維處理,實現復雜數據的可視化、判別和預測。模型中R2X=0.977,R2Y=0.984,Q2=0.948接近1.0表明模型穩定可靠[29]。圖4-b是判別模型經過200次置換檢驗的結果,Q2的回歸線與Y軸的交點在負半軸,說明模型有效,沒有過擬合,可用來反映發酵耙豌豆的風味情況[30]。A樣品位于第1象限,B、C位于第2象限,E和F位于第3象限,D位于第4象限。發酵耙豌豆(A、B、C、D)和未發酵耙豌豆(F)之間分布較離散,各樣品之間有較為明顯的區分,說明S.cerevisiae、Pichia、S.cerevisiae和Z.rouxii發酵耙豌豆的整體風味具有一定的差異。6種發酵耙豌豆在PLS-DA的分散點圖上聚類良好,組內差異小。E與F樣品聚集度較高,D與F離散程度最大,表明Candida發酵和未發酵耙豌豆間的整體風味相似度較高,而Z.rouxii發酵與未發酵耙豌豆的風味差異最大。

2.4 發酵耙豌豆特征香氣物質分析

為明確不同酵母菌發酵耙豌豆風味差異的關鍵風味物質,通過計算VIP確定各物質對發酵耙豌豆風味的貢獻度。VIP>1的風味物質具有較大的貢獻,定義其為差異標志物[31]。由圖5可知,共篩選出12種VIP>1的香氣物質,分別為4種醇類(異丙醇、乙醇、2-甲基丁醇和異戊醇)、3種酸類(甲酸、L-乳酸、迭氮酸)、2種酯類(乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯)、1種醛類(甲氧基乙醛)、1種酮類(1-甲氧基-2-丙酮)和1種其他類物質(二甲醚)。其中甲酸的VIP值最高,表明甲酸對發酵耙豌豆的風味貢獻較大,LIN等[32]同樣發現傳統發酵豆類調味品在發酵過程中會產生大量甲酸、丙酸等有機酸。結合電子增強出版附表1可知,C中甲酸的相對含量最高,主要呈辛辣氣味,給S.cerevisiae發酵耙豌豆帶來不舒適的風味。乙酸乙酯在C中相對含量最高,賦予耙豌豆水果香氣和醇香,乙酸乙酯也被認為是豆豉中水果香味的重要來源[12]。乙酸乙酯與合成前體物質乙酸含量直接相關,可能是S.cerevisiae發酵產生的乙酸和乙醇酯化形成的。2-甲基丁醇主要是醬油、黃豆醬中的揮發性香氣物質,能夠賦予耙豌豆麥芽、酒香。

圖5 不同發酵耙豌豆揮發性成分VIP圖Fig.5 VIP chart of volatile components of different fermented pulpy peas

3 結論

本研究對產香酵母發酵耙豌豆的揮發性風味物質進行研究,電子鼻分析結果表明,5種酵母菌發酵耙豌豆的整體香氣與未發酵耙豌豆的差異較大,其中S.cescerevisiae與M.guilliermondii發酵耙豌豆的整體風味較相似。GC-MS共檢測出69種物質,包括27種醇類、15種酸類、7種酯類、6種醛類、4種烷烴類、2種酮類和8種其他類化合物。其中醇類、酸類和酯類為主要揮發性物質,相對含量遠高于其他類物質。5種發酵耙豌豆的揮發性香氣成分差異顯著,與未發酵耙豌豆對比,發酵耙豌豆(A、B、C、D和E)中醇類和酯類物質的相對含量顯著上升,且醇類物質的種類數量均增多。Candida發酵耙豌豆(E)樣品的揮發性風味物質種類最多,達到了38種,提高了耙豌豆風味的豐富度。結合PLS-DA模型,篩選出12種VIP>1的揮發性標志物,包括甲酸、異丙醇、乙醇、2-甲基丁醇、異戊醇、L-乳酸、迭氮酸、乙酸乙酯、3-甲基苯酚甲酯、甲氧基乙醛、1-甲氧基-2-丙酮和二甲醚,多為醇類物質。醇類物質中異丙醇的VIP值最高,對發酵耙豌豆的風味貢獻最大,賦予耙豌豆水果香氣。本研究通過酵母菌發酵提高了耙豌豆風味的豐富度,為開發耙豌豆產品和促進發酵耙豌豆品質形成奠定了良好的基礎,為發酵耙豌豆產品優化提供了理論依據。