轉錄組學分析空氣對泡菜“生花”酵母菌的影響機制

羅思洋,練銀銀,楊宇航,譚兆濤,潘玉龍,索化夷,宋佳佳,張玉,4*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400700)2(西南大學 食品科學與工程國家實驗教學示范中心,重慶,400700) 3(重慶市潼南區農業農村委員會,重慶,402660)4(國家柑橘工程中心,西南大學,重慶,400712)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料,經中低濃度食鹽水泡漬發酵、調味、包裝、滅菌等過程生產加工而成的發酵食品[1]。截至2021年年底,四川省共有泡菜生產企業450余家,市場份額占中國總市場份額的70%,年產值446億元[2]。但由于泡菜原料未經過滅菌處理和泡菜發酵過程難以控制,在發酵過程中一旦發酵條件不利,腐敗微生物就會大量滋生,造成泡菜品質劣變,大量產品廢棄,給泡菜生產企業帶來嚴重經濟損失[3]。因此,泡菜品質的保持對于泡菜生產企業而言就顯得尤為重要。

在泡菜品質劣變的眾多現象中,“生花”是泡菜最常見的品質裂變現象。泡菜“生花”是微生物在不良環境影響下,與滲出的胞外聚合物一起凝聚成的膜,可附著在固體表面或漂浮于液體表面[4]。泡菜“生花”不僅影響風味,還會加快泡菜的腐敗,導致整壇泡菜都不能食用[5-6]?，F有研究表明引起泡菜“生花”的微生物主要是酵母菌:畢赤酵母、假絲酵母、漢斯德巴氏酵母、釀酒酵母等[6-8]。作者在前期研究中證實了“生花”酵母菌(CandidaparapsilosisB7)易成膜且成膜穩定,并且“生花”受溫度和O2的影響[9]。雖然現在眾多研究證明了導致泡菜“生花”的主要菌屬是酵母菌,也分離到了具體的“生花”菌株,但是關于“生花”菌株的“生花”機制研究并不多見,使得泡菜“生花”問題未能有效解決。

泡菜“生花”受環境因素影響,泡菜壇/池的密封性是影響泡菜“生花”的關鍵因素[9]。本文選取在“生花”泡菜中分離鑒定的主要“生花”菌株C.parapsilosisB7為研究對象,模擬密封/非密封2種環境條件,利用轉錄組學和生物信息學結合分析的方法,研究C.parapsilosisB7在有/無空氣下轉錄組表達的差異情況,同時進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)驗證關鍵差異基因的變化,探究C.parapsilosisB7的“生花”分子機制,為研究泡菜“生花”精準防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

“生花”酵母菌(C.parapsilosisB7)由本實驗室菌種資源庫保藏(“生花”泡菜樣液中分離得到)。

1.1.2 試劑

YPD培養基、酵母基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;Trizol Reagent、RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒,美國Thermo Fisher科技有限公司;異丙醇、無水乙醇,重慶川東化工有限公司;三氯甲烷,重慶科試化學有限公司;無核糖核酸酶水,上海碧云天公司。

1.2 儀器與設備

H-2050R臺式高速冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;CFX Connect型PCR儀,美國BioRad公司;LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養箱,上海躍進醫療器械有限公司;SW-CJ 2FD雙人單面超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;HiSeq X Reagent Kits/NovaSeq Reagent Kits測序平臺,美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化

取甘油保藏的C.parapsilosisB7 200 μL接種到10 mL液體YPD培養基中,37 ℃培養48 h。在液體YPD培養基菌懸液中取一環接種到固體YPD培養基中,37 ℃培養48 h;在固體YPD培養基菌落中取一環接種到10 mL液體YPD培養基中,37 ℃培養48 h;最后在該液體YPD培養基菌懸液中取一環接種到固體YPD培養基中,37 ℃培養48 h后于4 ℃儲存,備用。

1.3.2 轉錄組測序

1)菌體收集

將活化的C.parapsilosisB7接種到YPD液體培養基中,實驗組(有空氣)使用透氣試管塞,對照組(無空氣)使用玻璃塞,37 ℃培養48 h。于10 000×g4 ℃離心10 min,去除上清液,使用無菌PBS洗滌菌體3次,收集菌體,經液氮速凍保存。每個組3個重復。

在進行企業的網絡營銷效果分析系統設計中，要盡可能將在系統設計中將關系消費效果的網絡營銷影響因素和消費者行為涵蓋在內，確保網路哦營銷效果分析更加精準到位，對于消費行為和影響因素做到更有效的把握，這樣才能確保網絡營銷的有效性，為企業制定和調整網絡營銷方案提供有效的支持。例如，據不完全統計，使用網絡搜尋資料的網民，90%是先通過搜索關鍵詞，查看排名靠前的相關網頁，關鍵詞的設置，可以讓目標群體最快速搜索的查看到項目情況，獲最先的機會與客戶視覺接觸。

2)RNA提取、文庫構建及測序

采用TRIzol(Invitrogen)法提取樣本中的總RNA,并使用DNase I(TaKaRa)去除基因組DNA。分別采用2100 Bioanalyser(Agilent)、ND-2000(NanoDrop Technologies)方法檢測RNA樣品的質量。采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit(Illumina,San Diego,CA)試劑盒進行RNA文庫的構建。使用Ilumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序。

1.3.2.1 差異基因(differential expression analyses,DEGs)表達

使用軟件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)分別定量分析基因和轉錄本的表達水平。使用DESeq2軟件進行差異基因篩選并對原始計數(raw counts)進行統計分析以獲得組間差異表達基因或轉錄本的比較結果,篩選條件為P<0.05且|log2FC|≥1。

1.3.2.2 GO和KEGG富集

以進行差異顯著分析并注釋到GO和KEGG數據庫的基因集為背景基因集,差異顯著分析所得到的DEGs注釋到GO和KEGG數據庫的基因集為差異基因集,利用DESeq2軟件對DEGs進行GO功能富集和KEGG通路分析。

1.3.3 qRT-PCR檢測差異基因表達

根據RNA-seq數據隨機選擇DEGs,采用Primer 3程序設計引物。PCR條件為95 ℃預變性3 min;95 ℃變性5 s,56 ℃退火30 s,共40個循環。以Actin為內參,采用2-△△CT法計算相對表達。引物及序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數據分析處理

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據統計分析及基因組比對結果

總體而言,在去除接頭污染、長度不足或質量差的序列后,獲得了兩組有效的數據,超過93.79%的reads的平均質量值≥30,6個樣品的GC含量為(40.42±0.02)%(表2)。以上結果說明,本次測序所得cDNA文庫質量高,可以進行后續生物信息學的進一步研究。對比其他文獻對于其研究內容的轉錄組數據統計分析,本研究與其相似之處在于同樣進行了Clean reads和Clean bases的統計比較,不同之處在于其根據研究內容特性對每個樣品總比對數/率、特異比對數/率及外顯子比對數/率進行了統計[10]。而本研究則是對樣品的堿基質量百分數和GC含量進行統計分析,能更好突出本次測序文庫質量。

表2 C.parapsilosis B7測序數據統計評估Table 2 Evaluation and statistics of sequencing data of C.parapsilosis B7

表3 顯著差異通路及基因分析Table 3 Significant difference pathways and gene analysis

2.2 基因表達差異分析

使用DESeq2軟件篩選出具有顯著差異表達的基因(P<0.05,上/下調差異倍數為>2.0倍)。采用散點圖和火山圖表現差異基因在兩個樣本間的表達差異程度。其他文獻采用韋恩圖和火山圖進行實驗組和對照組的基因表達差異分析,通過韋恩圖展現實驗組和對照組基因的相似性[11-13]。如圖1所示,橫坐標表示基因的表達倍數變化,縱坐標表示基因的差異顯著性;紅點表示上調基因,藍點表示下調基因,灰點表示差異不顯著基因。轉錄組數據分析表明,與對照組相比,實驗組中篩選到183個DEGs,其中42個DEGs表達顯著上調,占總DEGs的22.95%,141個DEGs表達顯著下調(圖1)(P<0.05)。結果表明C.parapsilosisB7在空氣刺激下,基因表達發生一定的差異性。從上述結果中篩選有空氣條件下C.parapsilosisB7形成生物膜相關表達差異基因進行后續分析。

a-表達量差異散點圖;b-表達量差異火山圖

2.3 DEGs GO富集分析

通過Goatools軟件將DEGs注釋到Gene Ontology(GO)數據庫,得到DEGs可能具有的功能信息,其中GO包括分子功能(molecular function, MF)、細胞組分(cellular component, CC)和生物過程(biological process, BP)3個維度。如圖2所示,顯著上調的DEGs在3個維度中富集的顯著性水平較高,在BP類主要富集到蛋白質相關過程(有機氮化合物生物合成過程、肽生物合成過程、肽代謝過程、細胞蛋白質代謝過程、細胞氮化合物生物合成過程)以及酰胺合成、代謝,在CC和MF類主要富集到核糖體相關部位(胞質小核糖體亞單位、核糖體小亞基、核糖核蛋白復合物、大核糖體亞基、核糖體亞基、胞質大核糖體亞基、核糖體的結構成分)。如圖2所示,顯著下調的DEGs在BP類主要富集到某些糖類酶的活性(葡聚糖外切-1,3-β-葡萄糖苷酶活性、葡聚糖內切-1,6-β-葡萄糖苷酶活性、D-阿拉伯糖-1-脫氫酶活性),在CC類主要富集到某些糖類代謝(葡聚糖分解代謝過程、多糖分解代謝過程、細胞碳水化合物代謝過程)及脂肪酸的合成、代謝。脂肪酸的生物合成原料主要是葡萄糖分解代謝產生的乙酰CoA,且天冬酰胺等參與脂肪酸的生物合成,則酰胺生物合成、細胞酰胺代謝可能與脂肪酸生物合成相關。同時核糖體是合成蛋白質的場所,它將遺傳密碼轉換成氨基酸序列并從氨基酸單體構建蛋白質聚合物[14-15]。以上結果表明,空氣刺激會影響核糖體功能和脂肪酸合成及代謝進而影響C.parapsilosisB7的生長及代謝,這為差異基因的KEGG富集分析提供思路。

圖2 DEGs GO富集分析Fig.2 GO analysis classification of DEGs

2.4 DEGs KEGG富集分析

為了進一步系統地分析差異基因富集到的代謝通路,采用KOBAS(一個用于注釋和識別豐富的路徑和疾病的web服務器)分析受空氣影響的C.parapsilosisB7對KEGG途徑的富集,采用BH(FDR)方法進行多路復用,并根據生物信息學數據庫將DEGs分配到不同的途徑。如圖3所示,DEGs顯著富集到核糖體途徑,脂肪酸生物合成途徑中(P<0.05),則KEGG富集到的通路與GO富集分析到的功能一致。

圖3 差異表達基因KEGG富集分析Fig.3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

DEGs在核糖體的通路顯著富集,且富集數最多,超過差異基因總數的25%。核糖體是合成蛋白質的分子機器,通過對mRNA的解讀,與攜帶氨基酸的tRNA協同作用翻譯出一條多肽鏈,多肽鏈再經過后期的加工、折疊及轉運等過程,最后形成有功能的蛋白[14-15]。在菌株進行生命活動的每個過程中都有核糖體的參與,本研究中核糖體中的亞基蛋白的調控基因RPL3/4/5/10/12/15、RPSA/3A/15A、RPS9和RPL7A/10A是顯著上調的(圖4)。

圖4 核糖體通路Fig.4 The pathway of ribosome

RPL3/4/5/10/12/15、RPSA/3A/15A、RPS9和RPL7A/10A基因注釋到翻譯過程,上述基因的上調提高了翻譯準確度,促進了翻譯的正向調節,說明翻譯質量和速度將可能會加快。核糖體蛋白SA(ribosomal protein SA, RPSA)是40S核糖體亞基的一個組成部分,在HeLa細胞中被鑒定為H2O2靶點[16]。核糖體蛋白L4和L22形成大核糖體亞基中肽出口通道的一部分。RPL4蛋白是一種高度保守的核糖體亞基,其對于維持核糖體翻譯效率和保真度至關重要[17]。RPL10位于氨基酸tRNAs在調節過程中移動的通道附近,并參與tRNA通過該結構的運動;RPL10還很好地定位為肽酰轉移酶中心附近的活性傳感器,并將該信息傳遞到其他功能中心以協調核糖體功能。RPL10環是核糖體結構和功能的主控制器,影響核糖體組裝和生物發生的關鍵步驟以及延伸的蛋白質合成階段[18]。生物膜的主要成分是脂質和蛋白質,蛋白質在生物膜的形成中起促進作用[9,19]。有空氣條件下,核糖體通路中RPL10、RPSA等基因上調有利于蛋白質的合成,從而有利于生物膜的形成。

另外,DEGs在脂肪酸生物合成途徑中顯著富集。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,其中在不飽和脂肪酸合成途徑中FAD2顯著上調(P<0.05)。FAD2基因編碼對多不飽和脂質合成至關重要的酶,在不飽和脂肪酸的生物合成途徑中起著極其重要的作用[20]。磷脂的組成成分磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺含不飽和脂肪酸較多,而磷脂又是生物膜的重要組成部分[21-22]。細胞膜上的磷脂主要由磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)組成,其中PS、PE和PI位于細胞膜脂質雙層內側,PC位于膜外側,PS和PE中[22]。因此脂肪酸代謝通路中FAD2是不飽和脂肪酸合成的關鍵基因,從而有利于形成磷脂,進而有利于生物膜的形成。

2.5 DEGs qRT-PCR驗證

在KEGG富集分析中,實驗組相對于對照組而言,FAD2上調(表2),由于FAD2基因編碼對多不飽和脂質合成至關重要的酶[20],則多不飽和脂質合成增加。同時核糖體蛋白調控基因如RPL4、RPL10,RACK1,RPS2等上調(表2),說明核糖體的作用加劇,促進蛋白質的產生[14-15],從而有利于生物膜的形成[19]。為了驗證轉錄組學預測的準確性,定量分析了核糖體通路和脂肪酸生物合成通路中的FAD2、RPL4、RPL10的表達量。其中并沒有選擇甾醇通路中基因進行qRT-PCR驗證,這是因為在這個通路中基因雖然發生顯著變化,但其表達量非常低。如圖5所示,驗證結果表明,實驗組相對于對照組,這3個基因的表達量顯著上調(P<0.05)。轉錄組測序結果與qRT-PCR結果一致,表明DEGs的結論是可靠的。

a-FAD2;b-RPL4;c-RPL10

3 結論

本文通過對泡菜中“生花”酵母菌C.parapsilosisB7進行轉錄組測序,分析了有空氣和無空氣條件下C.parapsilosisB7差異表達基因。研究發現,空氣刺激下C.parapsilosisB7中具有合成蛋白質和磷脂功能的基因發生了變化,對核糖體通路和脂肪酸合成通路具有顯著影響,改變了這兩個通路中的25個基因的上調/下調。在核糖體通路中,核糖體蛋白調控基因RPL4、RPL10、RPSA較為關鍵,且脂肪酸合成通路中FAD2為關鍵基因。經過qRT-PCR驗證,證實空氣刺激導致RPL4、RPL10、FAD2基因顯著上調。綜上所述,空氣刺激可通過上調RPL4、RPL10、FAD2等關鍵基因的表達,而使核糖體和脂肪酸合成通路上調,進而有利于產生蛋白質和磷脂,從而導致C.parapsilosisB7“生花”。本研究結果為C.parapsilosisB7“生花”機理的深入探索提供依據,同時為泡菜“生花”現象的抑制提供靶向研究方向。