響應曲面法優化赤蘚糖醇結晶工藝

郭元亨, 皮冬偉, 陶進, 曹敏, 武麗達, 張媛, 王小艷*

1(中糧營養健康研究院有限公司,北京,102209)2(營養健康與食品安全北京市重點實驗室,北京,102209)3(吉林中糧生化有限公司玉米深加工國家工程研究中心,吉林 長春,130033)4(武漢中糧食品科技有限公司,湖北 武漢,430415)

人類生活水平提高和生活方式改變,伴隨的能量過度攝入引起的超重、糖尿病、“三高”之類的慢性疾病在全球范圍內發病率呈逐年增長態勢。國際糖尿病聯盟的預測顯示,截止2030年,全球將會有高達5.78億的成年人患有糖尿病,當前僅在我國就有1.35億糖尿病患者。民眾對美味和健康的雙重需求,使得低熱量甜味替代品的開發和應用成為“健康攝取”糖分的最有效途徑之一。

赤蘚糖醇是一種少量存在于海藻、蘑菇、梨、葡萄和西瓜等食物以及發酵食品(如醬油、葡萄酒)中的天然糖醇[1-2],常溫下為白色結晶體,易溶于水,對酸和熱的穩定性高,口感接近于蔗糖,熱量僅為蔗糖的1/10(0.4 kcal/g),人體對其耐受性高,對血糖沒有影響[3-4]。此外,赤蘚糖醇還具有防齲齒[5-6]、血糖調控、減緩肥胖、保護肝臟和心血管等功效[7-10]。赤蘚糖醇先后通過日本食品法規[11]、美國食品與藥品監督局[12]、聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會[13]的安全認證。2008年5月,我國衛生部批準赤蘚糖醇作為新資源食品,并在2014年對其進行了增補[14-15],公告中允許赤蘚糖醇在各類食品中按實際需要適量使用。

赤蘚糖醇的生產通常是以葡萄糖為發酵底物,通過微生物發酵(主要使用包括Yarrowia,Pichia,Candida,Torulopsis,Moniliella,Trichospornides在內的耐高滲透性酵母菌)獲得[16-18]。赤蘚糖醇的商品形式是晶體。然而,赤蘚糖醇在水中溶解度高,結晶難度較大,當前行業未能對結晶工藝細化研究,現行的結晶方法是在較高溫度下通過蒸發濃縮達到結晶目的,能耗較高[19],母液中殘留赤蘚糖醇含量較高,導致晶體收率偏低,造成一定程度浪費。近兩年,隨著赤蘚糖醇進入“紅?！笔袌?售價一路走低,必然要求對成本的進一步降低和對工藝和進一步優化。其中,優化赤蘚糖醇的結晶工藝對其產業的進一步發展十分重要。因此,本文旨在優化赤蘚糖醇的結晶工藝,研究影響結晶收率的主要因素和影響規律,并在單因素實驗的基礎上,采用響應曲面法對結晶工藝進行綜合性優化,大幅提升了赤蘚糖醇的單次結晶收率。為赤蘚糖醇的產業的降本減耗、提質增效提供參考依據,對赤蘚糖醇行業發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

改良解脂耶氏酵母、赤蘚糖醇發酵液,中糧營養健康研究院提供;赤蘚糖醇標準品,國藥集團化學試劑有限公司;實驗中用于高效液相色譜檢測的流動相均為色譜純級;液相檢測使用的水為Milli-Q水凈化系統(Millipore, Bedford, MA, USA)制備的18.2 MΩ超純水;其余所涉及化學試劑皆為分析純級。

1260型高效液相色譜系統,美國Agilent公司;XMTD-6000型恒溫真空干燥箱,重慶長風生物科技有限公司;陶瓷膜過濾系統,安徽普朗膜技術有限公司;Centrifuge 5424型控溫水浴鍋,德國Eppendorf公司;TDL-5-A型離心機,上海安亭科學儀器廠;PAL-1型糖度儀,北京陽光億事達貿易有限公司;RE-2002型旋轉蒸發系統,北京神泰偉業儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 赤蘚糖醇的定量分析

配制10.0 mg/mL的赤蘚糖醇標準溶液,并將此標準溶液稀釋成10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL的質量濃度梯度溶液。使用HPLC檢測赤蘚糖醇梯度溶液的峰面積,繪制標準曲線,并求回歸方程。依據回歸方程對待檢樣品定量分析。色譜條件如下:HPLC系統(Agilent 1260型),配置G 1316 A型柱溫箱、G 1329 B型自動進樣器、G 1311C型四元泵、G 1236A型示差檢測器和waters sugar-PakI型專用糖分析色譜柱(10 μm,6.5 mm×300 mm);色譜柱溫度和示差折光檢測器檢測溫度均設為55 ℃;流動相0.005 mol/L H2SO4水溶液,流速0.5 mL/min。流動相和所有待檢測樣品進樣前均通過0.22 μm的微濾膜過濾除雜。

結晶過程中,赤蘚糖醇結晶率的計算如公式(1)所示:

赤蘚糖醇結晶率/%=(me-ms)/(Vs×Cs)×100

(1)

式中:me,結晶后得到的赤蘚糖醇晶體總質量,g;Vs,赤蘚糖醇溶液的初始體積,mL;Cs,溶液中赤蘚糖醇的初始質量濃度,mg/mL;ms,晶種添加質量,g。

1.2.2 赤蘚糖醇溶液制備

采用改良解脂耶氏酵母,發酵生產赤蘚糖醇,終質量濃度約為220 mg/mL。發酵液使用陶瓷過濾膜(孔徑50 nm,膜面積0.25 m2)固液分離,收集透過液。透過液采用活性炭脫色(固液比1∶200,g∶mL)。脫色液依次通過LX-160強酸型陽離子交換樹脂脫鹽和D-354強堿型陰離子交換樹脂脫鹽,真空減壓濃縮。按如下流程制備赤蘚糖醇。

基因工程菌→一級種子培養→二級種子培養→補料發酵培養→陶瓷膜固液分離→活性炭脫色→離子交換樹脂純化→減壓濃縮

1.2.3 赤蘚糖醇的介穩曲線繪制

取赤蘚糖醇晶體45.0 g放入50 mL離心管,加去離子水定容到50 mL。8組樣品依次放置在0、10、20、30、40、50、60、70 ℃的水浴中加熱保溫,振蕩至充分溶解,取上清液稀釋100倍測定濃度。以赤蘚糖醇溶液溫度為橫坐標,濃度為縱坐標繪制其溶解度曲線。

將一系列不同溫度下的飽和赤蘚糖醇溶液(700、650、600、550、500、450、400 mg/mL)以0.1 ℃/min的速率降溫,同時觀察赤蘚糖醇溶液。當赤蘚糖醇溶液透光率突然降低時,認為此時溶液達到了極限超溶解濃度,記錄其溶液溫度[20]。為排除赤蘚糖醇溶液中存在晶核的影響,降溫起點從高于溶液飽和溫度5 ℃開始[21]。以溶液達到極限超溶解時刻的溫度為橫坐標,對應濃度為縱坐標繪制赤蘚糖醇的超溶解曲線。

1.2.4 單因素試驗

1.2.2節所獲得的赤蘚糖醇溶液,其純度可達98.0%以上。將前述赤蘚糖醇溶液濃縮到550 mg/mL,分別按固含物質量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%加入赤蘚糖醇晶種,25 ℃條件下結晶1 h,抽濾干燥稱取晶體質量,研究晶種添加量對赤蘚糖醇結晶率的影響。將1.2.2節所獲得的赤蘚糖醇濃縮到600 mg/mL以上的質量濃度,依次加水稀釋配制成250、300、350、400、450、500、550、600 mg/mL溶液,環境溫度25 ℃,并加少量晶種,結晶1 h。研究赤蘚糖醇質量濃度在250～600 mg/mL變化時對結晶率的影響。配制550 mg/mL赤蘚糖醇溶液,加少量晶種,分別在25 ℃結晶0.5、1、2、3、4、5、6 h后,研究結晶時間在0.5～6 h內變化時對其結晶率的影響。配制550 mg/mL赤蘚糖醇溶液,加少量晶種,分別在-10、-5、0、5、10、15、20、25 ℃的環境溫度下結晶3 h,研究赤蘚糖醇在環境溫度從-10～25 ℃對其結晶率的影響。

1.2.5 Box-Behnken(BBD)設計試驗

為了進一步優化赤蘚糖醇的結晶工藝,依據1.2.4節所述的單因素試驗結果,使用BBD中心復合法設計試驗[22-23]。將赤蘚糖醇的晶種添加量(X1),初始濃度(X2),結晶時間(X3)和結晶溫度(X4)設定為自變量,赤蘚糖醇結晶率(Y)設為因變量。設計4因素3水平的響應面試驗,試驗設計詳見表1。

表1 響應面因素及水平Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken design

依據公式(2)模擬二次回歸方程。

(2)

式中:Y,因變量;β0,βi,βii,βij依次為常數項、一次項、二次項和交互項的系數;Xi和Xj為獨立變量。

1.3 數據分析

所有實驗數據均采用3組平行實驗測量結果的均值±標準差表示。采用Design-Expert軟件(V.12)對赤蘚糖醇結晶工藝進行響應面法優化。研究數據通過單因素方差分析(ANOVA)和回歸分析處理。

2 結果與分析

2.1 赤蘚糖醇的定量分析

赤蘚糖醇的高效液相色譜詳見圖1-a,赤蘚糖醇的保留時間為13 min左右,峰型對稱。根據不同濃度梯度的標準溶液與其對應的高效液相色譜峰面積關系,繪制標準曲線,詳見圖1-b,標準曲線R2為0.999 8,表明線性關系良好。

a-高效液相色譜圖;b-標準曲線

根據標準曲線獲得的回歸方程如公式(3)所示。

A=310 347Cs+738.82

(3)

式中:A,高效液相色譜測得的赤蘚糖醇峰面積;Cs,溶液中赤蘚糖醇的質量濃度,mg/mL;R2=0.999 8。

2.2 赤蘚糖醇的介穩區間及晶種對降溫結晶的影響

過飽和是一種溶質在溶液中以高于飽和度的濃度存在,且保持穩定的溶解狀態而不結晶析出的現象。溶液中溶質處于過飽和狀態而欲自發產生晶核時的極限溶解度稱為超溶解度,宏觀表現為一定溫度下溶質結晶析出的起始濃度[20]。一系列變化的溫度下測定出溶質的超溶解度,順次連接各點即可繪制出超溶解度曲線。介于溶解度曲線和超溶解度曲線之間的區域,即為溶質在該溶液體系中的介穩區。

如圖2所示,右下方的曲線為赤蘚糖醇的溶解度曲線,溶解度曲線右下方是穩定區。在穩定區中溶液尚未達到飽和狀態,赤蘚糖醇無結晶析出的可能性。左上方的曲線為赤蘚糖醇的超溶解度曲線,此曲線左上方的區域為不穩定區。在不穩定區,赤蘚糖醇溶液處在過飽和狀態,可以自發地產生晶核。介于溶解度曲線與超溶解度曲線之間的區域,即為赤蘚糖醇的介穩區。在介穩區中,赤蘚糖醇溶液無法自然地產生晶核,但如果溶液中已存在或引入一定量的晶種,晶種便會生長、變大。介穩區寬度是指超溶解度曲線與溶解度曲線之間的直線距離,其垂直方向的距離代表赤蘚糖醇的最大過超溶解度,水平方向的距離則代表最大過冷卻溫度。介穩區的研究對于赤蘚糖醇的結晶過程具有重要意義,在工業生產中,可作為選擇結晶操作條件的重要依據。介穩區寬度越大,往往結晶操作彈性較大,結晶率較高。

圖2 赤蘚糖醇介穩曲線Fig.2 Metastable curve of erythritol

在降溫結晶過程中,降溫速率與添加晶種的時機對結晶過程有著重要的影響[19]。若在不添加晶種的情況下直接快速降溫,則溶液的狀態迅速達到不穩定區域,此刻溶液中就會發生初級成核現象,大量微小的晶核驟然產生。這種工況屬于無控制結晶,大量微小、不規則晶體影響后續固液分離;且無控制結晶會導致產品晶體夾帶、包裹少量母液中的雜質,從而影響產品最終品質(圖3-a)。

a-不存在晶種,快速降溫;b-不存在晶種,緩慢降溫;c-存在晶種,快速降溫;d-存在晶種,緩慢降溫

若體系中不存在晶種而緩慢冷卻,體系的狀態會從穩定區平穩穿越介穩區,到達超溶解度曲線,此時會溶液中會生成較多的晶核。當溶液的過飽和度因成核而有一定量的消耗后,體系的狀態便會脫離超溶解度曲線而回歸到介穩區,此時便不再有晶核生成,但已形成的晶體顆粒會逐漸生長。由于初級成核速率過快,其晶核的生成量無法與晶體顆粒生長速率匹配,導致所得晶體的粒度分布范圍較寬,也會影響后續分離和產品品質(圖3-b)。

若體系中有晶種存在且以較快速度降溫,則溶液的狀態從穩定區快速越過溶解度曲線到達介穩區,此時晶種開始長大。但由于降溫迅速,晶粒生長速度無法消耗掉體系的過飽和度。溶液仍有可能越過超溶解度曲線而到達不穩區,從而發生初級核,影響后續分離工藝和產品品質(圖3-c)。

若溶液中存在晶種且緩慢降溫,則在溶液狀態從穩定區越過溶解度曲線后,會始終保持在介穩區狀態。此種操作情況下,體系的降溫速率決定了晶體的生長速率。因溶液體系不會越過超溶解度曲線而進入不穩區,故不會有初級成核現象出現。這種操作方法所得的晶體形態一致,粒度均勻,后續分離容易,晶體顆粒不會夾帶包裹母液中的雜質。實際生產過程中,一般追求這種操作方式(圖3-d)。

2.3 單因素實驗結果

赤蘚糖醇結晶過程中,晶種的添加量對結晶率的影響如圖4-a所示,在1 h的結晶時間內,赤蘚糖醇的結晶率隨著晶種的添加量增加而呈現遞增趨勢。當晶種的添加量達到赤蘚糖醇溶液中固含物質量的1%后,結晶率不再隨著晶種添加量有顯著提升。對應前述降溫結晶機理,當晶種添加量<1%時,意味著體系中晶粒的數量達不到晶體析出速率的要求,因此結晶率較低。這種情況下,隨著時間的延長,赤蘚糖醇晶體會長的過大,晶體顆粒的規則性和粒度均勻性也會受影響。因此后續結晶過程中,將晶種的添加量維持在固含物質量的1%左右。

a-晶種添加量;b-初始質量濃度;c-結晶時間;d-溫度

圖4-b表明,水溶液中赤蘚糖醇質量濃度<250 mg/mL,25 ℃的條件下基本不會出現結晶,在赤蘚糖醇溶液的質量濃度<600 mg/mL時,結晶率隨著初始濃度的升高而增高。但在工業生產過程中,若赤蘚糖醇溶液的質量濃度達到600 mg/mL,降溫過程中容易(結晶過程中冷媒一般在10 ℃以下)穿過介穩區到達不穩定區,形成初級晶核。除此之外,加熱濃縮過程中,隨著溶液的濃度升高,黏度會隨之增大,導致液體傳熱速率下降,局部受熱現象加劇,濃縮液中殘留還原糖類受熱促使溶液顏色褐變,影響產品品質。因此初始質量濃度不宜過高,控制在500～550 mg/mL。

圖4-c表明,在3 h之前,赤蘚糖醇的結晶率隨著結晶時間的延長快速增高。3 h之后,赤蘚糖醇的結晶率增加速率明顯放緩,盡管整體而言還是略有所增。其內在原因是隨著赤蘚糖醇以固態形式結晶析出,溶液中的赤蘚糖醇濃度逐漸降低。從而致使溶解-結晶平衡過程中,溶解速率隨著晶體總量升高而逐漸加快,結晶速率隨溶液濃度減小而逐漸降低。當溶液中結晶速率和溶解速率最終趨同時,結晶率便不再增高[23]。整體權衡結晶率和時間成本,將合適的結晶時間選在3 h左右。

圖4-d顯示,溫度在-10～-5 ℃時赤蘚糖醇的結晶率隨著溶液的溫度升高而增大,當溫度>-5 ℃時,赤蘚糖醇結晶率隨著溶液溫度的升高而降低。這是因為,溫度在較低范圍內波動時,隨著溫度升高,溶液黏度有所下降,微觀環境中分子運動加快,有利于赤蘚糖醇分子相互碰撞,加快赤蘚糖醇結晶析出。但當溫度超過臨界值時,一方面赤蘚糖醇的過飽和度下降,另一方面,溶液黏度對分子運動的約束程度也降低,致使赤蘚糖醇結晶率下降[24]。赤蘚糖醇最適結晶溫度宜選在-5 ℃左右。

2.4 模型擬合與統計分析

將表2實驗數據通過Design-Expert V.12統計軟件進行多元回歸分析,即可得到因變量Y與4個自變量(X1、X2、X3和X4)之間的模擬回歸方程,如公式(4)所示。

表2 BBD設計表與實測的赤蘚糖醇結晶率Table 2 The Box-Behnken design matrix and response values for erythritol yield

Y=39.57+0.48X1+8.18X2+6.07X3+1.83X4+0.88X1X2+0.23X1X3+0.28X1X4+0.53X2X3+1.23X2X4-1.90X3X4-0.83X12-0.99X22-2.35X32-4.02X42

(4)

式中:Y,赤蘚糖醇的結晶率;X1,晶種添加量,%;X2,赤蘚糖醇初始質量濃度,mg/mL;X3,結晶時間,h;X4,結晶溫度,℃。

P>0.05意味著自變量對響應值的影響不顯著,P<0.05則意味著變量對響應值的影響顯著。如表3所示,模型P<0.000 1,意味著由擾動所導致的模型失真概率低于0.01%,因此回歸模型具有顯著性。失擬檢驗的P=0.469 1,意味著失擬檢驗相比純誤差不顯著,根據BBD分析原理,失擬檢驗不顯著表示結果良好。在所有的變量中,二次項X12對響應值Y具有顯著影響(P<0.05),一次項X2和X3,以及二次項X42對響應值Y有著極顯著影響(P<0.01)。

表3 響應面回歸模型的單因素方差分析結果Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the response surface regression model

2.5 響應曲面及結晶工藝的優化

如圖5所示,將4個自變量中的2個保持在中間水平,則另外2個自變量的投影組成一系列同心圓或橢圓,這一系列同心圓或橢圓便代表了變量之間相互影響的顯著程度。若曲線呈現橢圓狀,意味著相應的變量之間的交互作用對響應值存在顯著影響;若曲線呈圓形則意味著變量之間的交互作用對響應值的影響不顯著[25]。結晶溫度和晶種添加量之間的投影近似橢圓形,意味著兩者交互作用對響應值有顯著性影響。

a-晶種添加量與初始質量濃度;b-晶種添加量與結晶時間;c-晶種添加量與結晶溫度;d-初始質量濃度與結晶時間;e-初始質量濃度與結晶溫度;f-結晶時間與結晶溫度

通過響應面法對赤蘚糖醇的結晶工藝進行優化,最優條件為晶種添加量赤蘚糖醇溶液中固含物質量的1.11%,初始質量濃度550 mg/L,結晶時間3 h,結晶溫度-4.36 ℃?？紤]工業生產過程操作的方便性,將晶種添加量設定為1%,溶液初始質量濃度設定為550 mg/mL,結晶終止溫度設定為-4.5 ℃,結晶持續時間為3 h。在修正的條件下,使用BBD預測的赤蘚糖醇結晶率為53.10%。為發進一步驗證模型的可信度,在修正條件下進行了3組平行結晶實驗,平均結晶率為52.78%。

本工藝不同于蒸發結晶[22],因此省去了長時間蒸發所消耗的大量熱損耗,利用溫差所致的溶解度差異實現赤蘚糖醇結晶,工藝更加經濟。此外,與現有降溫結晶工藝中一次結晶收率僅為40%～50%相比[24],工藝更加穩定,收率明顯提高?？傮w而言,該模型與預測值相對誤差僅為0.60%,模型預測值與實際驗證值基本吻合,對實際應用模擬效果較佳。

3 結論

針對當前赤蘚糖醇產業中面臨的工藝粗放,結晶收率偏低的問題,為了獲得在水溶液體系中結晶赤蘚糖醇的最優工藝技術,本文研究了晶種添加量、溶液初始濃度、結晶時間和結晶溫度等4個主要影響因素對赤蘚糖醇結晶率的影響規律。單因素結果表明,晶種添加量、溶液初始濃度和結晶時間與結晶收率呈正相關性,且晶種添加量和結晶時間對結晶收率的影響有封頂現象。在單因素試驗的基礎上,進一步通過通過響應曲面法優化工藝。結果顯示赤蘚糖醇在水系中結晶的最優操作參數為:晶種添加量為1%,溶液初始質量濃度為550 mg/mL,結晶終止溫度為-4.5 ℃,結晶持續時間為3 h。在此條件下,赤蘚糖醇的結晶率可達52.78%。結晶收率高于當前工業生產水平。此工藝操作簡單易于放大,工藝優化方案可靠,可以為赤蘚糖醇的工業化結晶提供參考依據。