樹莓多糖組分RPP-5的結構特征與免疫活性研究

尹星星,楊永晶*,陸杰,王學紅,晁沐

1(青海大學 生態環境工程學院,青海 西寧,810016)2(青海樹莓農業產業化有限公司,青海 西寧,812100)

免疫系統能夠提高機體免疫力、抵御外界病原體攻擊,其功能主要是通過免疫細胞和免疫分子來發揮作用[1-2]。巨噬細胞是常見的免疫細胞,也是免疫系統中抵御病原體入侵的第一道防線,在先天免疫和炎癥反應中具有重要的作用[3]。此外,巨噬細胞具有抗原呈遞、募集與趨化等多種功能,不僅可以直接吞噬和殺死病原體,還能夠刺激NO、白細胞介素(interleukin, IL)、干擾素(interferon, IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等細胞因子的分泌,進而調節機體的免疫與炎癥反應[4]。因此,常用巨噬細胞及其相關因子來進行體外免疫活性的研究。

多糖是一類結構復雜的天然大分子物質,具有減緩腫瘤和炎癥發生、抵抗病毒侵入、降血糖、緩解疲勞、免疫調節等多種生物活性[5]。免疫調節作為多糖最顯著的生物活性之一,受到越來越多的學者的關注[6]。臨床上,香菇多糖能夠改善腫瘤微環境的免疫反應,用于抗腫瘤的輔助治療;靈芝多糖主要用于神經官能癥、多發性肌炎、皮肌炎等因免疫功能紊亂所致的各種疾病的治療[7]。此外,還有很多處于非臨床研究的多糖或多糖組分也具有顯著的免疫調節活性。例如,歐李多糖組分CHPP-2和阿魏側耳胞外多糖組分PFEPw-1均能夠刺激RAW264.7細胞分泌細胞因子,增強免疫活性[8-9];再如,地黃硒多糖能夠提高小鼠脾臟和胸腺的功能、促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖和Th1型淋巴細胞中IL-2、IFN-γ的分泌,表現出較強的免疫增強活性[10]。且多糖具有無毒、易降解等優勢,其被認為是理想的免疫調節劑候選物質[11]。

樹莓(RubusidaeusL.)是一種常見的經濟型漿果,因其果實中含有豐富的生理活性物質而被譽為“黃金水果”[12]。研究表明在膳食中添加樹莓,能夠起到抗肥胖、防止肝及內臟脂肪堆積和調節脂類代謝的作用[13]。多糖作為樹莓中重要的天然大分子,近年來得到了廣泛的研究。ZHANG等[14]發現樹莓粗多糖能夠通過抑制脂多糖引起的RAW264.7細胞增殖以及降低炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達來發揮抗炎作用;此外,樹莓粗多糖還能夠通過促進炎癥因子和趨化因子的表達和分泌來激活巨噬細胞,調節免疫反應[15]。前期研究發現,樹莓粗多糖能夠增加荷瘤小鼠的細胞免疫反應,進而發揮抗腫瘤的作用[16]。隨著研究的深入,具有顯著生理活性的多糖組分不斷從樹莓中分離純化出來。如樹莓多糖RCP-II,能夠清除大量的DPPH自由基、羥自由基和氧自由基,顯示出較強的抗氧化活性[17];紅樹莓多糖組分RCP-Ⅰ能夠降低大鼠血清中的甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量,升高高密度脂蛋白膽固醇的含量,進而起到預防高血脂癥的作用[12]。前期研究表明,從樹莓果肉中分離純化獲得的酸性多糖RPP-2a能夠刺激RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌,促進TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達,表現出較強的免疫增強活性[18]。

本研究采用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200對樹莓粗多糖進行分離純化獲得多糖組分RPP-5,并進一步分析RPP-5的結構特征及其在RAW264.7細胞中的免疫調節作用,為其進一步開發和利用提供理論參考和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹莓冷凍果,青海樹莓農業產業化有限公司(青海湟源);RAW264.7細胞,中國科學院細胞庫;RAW264.7細胞專用培養基、1640培養基、青-鏈霉素混合液(P/S)、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),武漢普諾賽生命科技有限公司;PBS,青海萊茵爾生物科技有限責任公司;TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;CCK-8試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成預混試劑、SuperReal彩色熒光定量預混試劑,天根生化科技有限公司;引物,金唯智生物科技有限公司;三氟乙酸,NaCl,北京伊諾凱科技有限公司;硼氫化鈉、高氯酸,上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司;乙酸乙酯,北京沃凱生物科技有限公司;醋酐、NaOH、乙酸酐,上海滬試實驗器材股份有限公司;乙酸,中國賽默飛世爾科技有限公司;甲醇,德國默克公司;二甲基亞砜、NaH、碘甲烷,中國阿達瑪斯試劑公司;甲基化試劑盒,揚州博睿糖生物技術有限公司;NO測定試劑盒,武漢生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3酶標儀、D-37520離心機,上海賽默飛世爾科技公司;BSZ-100自動收集器、BRT105-104-102串聯凝膠、多糖凝膠純化系統,揚州博睿糖生物技術有限公司;UGC-24M氮吹儀,力辰科技有限公司;MS7-H550-Pro磁力攪拌器,無錫德凡儀器有限公司;GCMS-QP2010氣相質譜聯用儀、RID-10A FRC-10A高效液相色譜儀,日本島津公司;Sephadex G-200葡聚糖凝膠,美國通用電氣公司;RI-502SHODEX示差折光檢測器,日本昭和電工集團;HF100三氣培養箱,上海力申科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹莓粗多糖的提取

采用超聲波輔助法提取樹莓粗多糖。于電熱恒溫鼓風干燥箱中(溫度55 ℃)除去樹莓冷凍果水分后用高速萬能粉碎機粉碎(22 000 r/min,1～2 s)并過80目篩,獲得樹莓果粉。按照1∶4(g∶mL)的料液比向果粉中加入體積分數80%乙醇脫脂。之后60 ℃加熱回流除去樹莓果粉中的色素、單糖和寡糖,之后以1∶5(g∶mL)的料液比加入雙蒸水于60 ℃下超聲波提取1 h,離心棄上清液,浸提后收集提取液。采用Sevag法除蛋白,重復操作4～5次充分除去蛋白。將除去蛋白的提取液在60 ℃下進行旋轉蒸發,濃縮至原來體積的1/4后加入4倍體積95%乙醇,低溫醇沉過夜后離心取沉淀物,冷凍干燥至粉末狀即得樹莓粗多糖。

1.3.2 RPP-5的分離純化

配制100 mg/mL的樹莓粗多糖溶液,采用DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱(7.5 cm×60 cm)對其進行極性分離,分別使用0、0.2、0.4、0.8、1.5 mol/L的NaCl溶液洗脫,流速為5 mL/min,收集洗脫液。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量,合并餾分,經濃縮、透析和冷凍干燥后獲得多糖樣品。將經DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱純化后的多糖配制成100 mg/mL的多糖溶液,經微孔濾膜過濾后采用多糖凝膠純化系統按照分子質量差異進一步純化,洗脫劑為蒸餾水,流速為0.5 mL/min。采用Sephadex G-200葡聚糖凝膠層析柱(2.6 cm×60 cm)進行多糖純化,通過博睿糖生物技術有限公司特制的多糖凝膠純化系統結合示差檢測器(RI-502 SHODEX)對多糖進行在線監測,并收集對稱峰溶液,最后經冷凍干燥后的樣品即為樹莓多糖組分RPP-5。

1.3.3 RPP-5的含量及其分子質量測定

配制1 mg/mL的RPP-5溶液,取0.2 mL RPP-5溶液加入1 mL乙醇,于4 ℃靜置1 h后,8 000 r/min離心5 min,棄上清液后加入80%乙醇,離心留沉淀。之后加入2 mL蒸餾水,沸水浴加熱使沉淀溶解后,將該溶液作為多糖檢測液,取該溶液100 μL,依次加入50 μL試劑一、250 μL濃硫酸,沸水浴20 min后,488 nm處測定吸光度,按照多糖含量試劑盒說明書計算多糖含量。采用高效凝膠滲透色譜法測定樹莓多糖組分的分子質量。配制多糖溶液,將過濾后的多糖溶液加入到進樣小瓶中。使用裝有BRT105-104-102系列色譜柱(8 mm×300 mm)和RI-502示差折光檢測器的LC-10A高效液相色譜系統測定RPP-5的分子質量。

1.3.4 單糖組成分析

通過GC-MS分析RPP-5的單糖組成。分別取2 mg RPP-5和單糖標準品,于120 ℃條件下加入三氟乙酸水解,冷卻至室溫后經旋轉蒸發儀蒸干除去剩余的三氟乙酸,在殘基中加入雙蒸水、硼氫化鈉和冰醋酸將其還原中和,經旋蒸、烘干后加入乙酸酐,100 ℃反應1 h,冷卻后加入甲苯,減壓濃縮蒸干。重復以上步驟4～5次,除去多余的醋酐,獲得乙?；苌a物。使用配備有CarboPacTMPA-20分析柱(3 mm×150 mm)和脈沖電流檢測器Dionex ICS-5000系統測定乙?；苌a物。首先用等度NaOH(250 mmol/L)洗脫10 min,之后用含有50 mmol/L NaOH的醋酸鈉(500 mmol/L)繼續洗脫30 min。將洗脫溫度、進樣量和流速分別設置為30 ℃、5 μL和0.3 mL/min。最后,對比RPP-5與各單糖標準品的保留時間和峰面積,分析并計算RPP-5的單糖組成和物質的量比。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

精確稱取RPP-5 2 mg和KBr 200 mg,制成粉末后,采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內進行分析。

1.3.6 甲基化分析

稱量RPP-5樣品(2～3 mg)置于玻璃反應瓶中,加入無水DMSO、甲基化試劑A液,經超聲波溶解后再加入甲基化試劑B液,并對其進行水浴后加入超純水加入終止甲基化反應,獲得甲基化產物。取甲基化后的多糖同1.3.4節的方法進行乙?；幚?使用配備有RXI-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)的GC-MS儀器檢測乙?；苌a物,經GC-MS測定后與標準質譜圖庫進行比對。條件如下:初始柱溫120 ℃,升溫速度3 ℃/min,H2流速1 mL/min,檢測器溫度到達250 ℃,5 min后進行分析。

1.3.7 樹莓多糖組分免疫調節活性研究

1.3.7.1 細胞培養

采用RAW264.7細胞專用培養基(含體積分數15% FBS)培養RAW264.7細胞,三氣培養箱溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。當細胞密度為80%以上時,將RAW264.7細胞(1×104個/孔)接種到96孔板中。

1.3.7.2 細胞活力測定

接種至96孔板中的細胞于三氣培養箱中繼續孵育12 h后,加入不同質量濃度的RPP-5溶液(0、20、40、80、160 μg/mL)及陽性對照脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液(5 μg/mL),以加入0 μg/mL多糖溶液的RAW264.7細胞作為空白對照組,每個濃度設置6個復孔,繼續于37 ℃、5% CO2的三氣培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μL CCK-8,于三氣培養箱中孵育1 h,450 nm處測定吸光值。

1.3.7.3 NO的含量測定

RAW264.7細胞培養及處理同1.3.7.2節,收集RAW264.7細胞培養液,按照NO測定試劑盒說明書操作測定RAW264.7細胞中NO的含量。

1.3.7.4 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量測定

RAW264.7細胞培養及處理同1.3.7.2節,收集RAW264.7細胞培養液,按照ELISA檢測試劑盒測定試劑盒說明書操作,分別測定RAW264.7細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.3.7.5 IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達量的測定

將RAW264.7細胞(2×106個/孔)接種至6孔板中,于三氣培養箱中培養12 h后,將培養基更換為5 μg/mL的LPS和不同濃度的RPP-5溶液,每個濃度設置3個復孔,繼續培養24 h。使用總RNA提取試劑盒提取RAW264.7細胞中的總RNA,之后使用cDNA第一鏈合成預混試劑將mRNA逆轉錄為cDNA,將cDNA作為第一鏈為合成模板,進行Real-time PCR擴增,根據2-△△Ct相對定量法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計學分析

數據用SPSS 26.0軟件進行統計學分析,實驗數據以平均值±標準偏差形式表示,采用ANOVA單因素方差分析進行組間比較。P<0.05表示數據之間存在顯著差異;P<0.01表示數據之間存在極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 RPP-5的分離純化

如圖1-a所示,在DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱上分別以0、0.2、0.4、0.8、1.5 mol/L的NaCl作為洗脫液進行洗脫,出現了5個洗脫峰,說明樹莓粗多糖中含有5個不同極性的組分,分別命名為組分1(0 mol/L NaCl)、組分2(0.2 mol/L NaCl)、組分3(0.4 mol/L NaCl)、組分4(0.8 mol/L NaCl)和組分5(1.5 mol/L NaCl)。其中除了組分1為中性多糖外,其余組分均為酸性多糖。將1.5 mol/L NaCl洗脫下來的組分5在Sephadex G-200凝膠層析柱進一步純化,在洗脫時間為149～169 min時獲得一個單一對稱峰,說明該多糖組分具有較好的分子質量均一性,將其命名為RPP-5(圖1-b)。

a-樹莓粗多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow色譜洗脫曲線;b-RPP-5的Sephadex G-200柱洗脫曲線

2.2 RPP-5的含量及分子質量分析

經測定,RPP-5的糖含量為99.8%。由圖2可知,在洗脫時間為42～44 min時獲得一個單一對稱峰(洗脫時間46～49 min時為溶劑峰)進一步證實了RPP-5為分子質量均一的多糖組分。根據標準曲線方程計算得RPP-5的重均分子質量、數均分子質量和峰位分子質量分別為7 598、6 183、7 492 Da。

圖2 RPP-5分子質量測定Fig.2 Molecular weight determination of RPP-5

2.3 單糖組成分析

如圖3所示,根據保留時間和峰面積得知,RPP-5中存在6種單糖,分別為阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖,物質的量比為44.5∶21.7∶15.9∶8.8∶5.0∶4.1。其中,阿拉伯糖的含量最高,其次是葡萄糖和半乳糖。

a-混合單糖標準物的GC-MS圖譜;b-RPP-5的GC-MS圖譜

2.4 傅里葉紅外光譜分析

結果如圖4所示,吸收帶在3 600～3 200 cm-1是—OH的伸縮振動吸收峰,這個區域的吸收峰是糖類的特征峰[19]。具體如下:3 409 cm-1是O—H的伸縮振動吸收峰,是糖類的特征峰[20]。1 631 cm-1處存在結合水的特征吸收峰[21]。1 415 cm-1和1 137 cm-1處的吸收峰均是由C—O伸縮振動所致[22-23]。在873 cm-1處有一個吸收峰,可能為端基差向異構C—H以外的C—H變角振動[24]。

圖4 RPP-5的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of RPP-5

2.5 甲基化分析

如圖5所示,RPP-5的GC-MS圖譜中出現12個峰,與標準質譜圖庫進行比對后可知,存在1→3、1→4、1→5、1→4,6和1→3,4,6等糖苷鍵連接類型。其中葡萄糖和半乳糖都表現出3種乙?；苌a物,分別為2,3,6-Me3-Glcp、2,3-Me2-Glcp、2-Me1-Glcp和2,3,4,6-Me4-Galp、2,3,6-Me3-Galp、2,3,4-Me3-Galp,其連接方式分別為→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→和Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→;阿拉伯糖表現出4種乙?；苌a物,即2,3,5-Me3-Araf、2,3-Me2-Araf、2,3,4-Me3-Arap和2,4-Me2-Arap,其連接方式分別為Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→和→3)-Arap-(1→;而木糖和甘露糖各自表現出一種乙?；苌a物,即2,3-Me2-Xylp和2,3,4,6-Me4-Manp,其連接方式分別為→4)-Xylp-(1→和Manp-(1→。根據峰面積計算連接方式含量可知,→4)-Galp-(1→的含量為26.27%,含量最高,其次是→4)-Xylp-(1→、Araf-(1→和→4,6)-Glcp-(1→,含量分別為16.50%、11.38%和10.41%,其他連接方式的含量均小于10%(表2)。以上結果說明,RPP-5是一種具有多支鏈結構的雜多糖,推測其主鏈主要由→4)-Galp-(1→和→4)-Xylp-(1→組成,其支鏈中可能含有Araf-(1→、Galp-(1→、Arap-(1→、Manp-(1→、→3)-Arap-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→等殘基。

圖5 RPP-5的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS pattern of RPP-5

表2 RPP-5的GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of RPP-5

2.6 RPP-5免疫活性研究

2.6.1 RPP-5對RAW264.7細胞活力的影響

如圖6所示,與空白對照組相比,經質量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理之后,RAW264.7細胞活力極顯著升高(P<0.01)。

圖6 RPP-5對RAW264.7細胞活力的影響Fig.6 Effects of RPP-5 on the viability of RAW264.7 cells

2.6.2 RPP-5對RAW264.7細胞中NO含量的影響

如圖7所示,與空白對照組相比,經質量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,NO的含量極顯著升高(P<0.01),且呈現明顯的劑量依賴效應。

圖7 RPP-5對RAW264.7細胞中NO的影響Fig.7 Effects of RPP-5 on NO in RAW264.7 cells

2.6.3 RPP-5對RAW264.7細胞培養液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響

如圖8-a所示,與空白對照組相比,經質量濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,IL-6的含量極顯著上升且呈現劑量依賴性(P<0.01)。圖8-b顯示,與空白對照組RAW264.7細胞相比,經40～160 μg/mL的RPP-5處理后,IL-1β的含量明顯升高(P<0.01,P<0.05);圖8-c結果表明,與空白對照組RAW264.7細胞相比,經20～160 μg/mL的RPP-5處理后,TNF-α的含量極顯著升高(P<0.01)。

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α

2.6.4 RPP-5對RAW264.7細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達量的影響

如圖9-a與9-b所示,與空白對照組相比,經濃度為20～160 μg/mL的RPP-5處理后,RAW264.7細胞中IL-6和IL-1β mRNA的表達量均極顯著增加(P<0.01);圖9-c顯示,經40～160 μg/mL的RPP-5處理時,能夠極顯著升高RAW264.7細胞中TNF-α mRNA的表達量(P<0.01)。當RPP-5質量濃度為160 μg/mL時,IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達量均為最高。

a-IL-6;b-IL-1β;c-TNF-α

3 結論

本研究利用超聲波輔助提取樹莓粗多糖,然后采用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱和Sephadex G-200凝膠層析柱對樹莓粗多糖分別根據極性和分子質量進行分離,最終獲得酸性多糖組分RPP-5。研究發現RPP-5的峰位分子質量、重均分子質量和數均分子質量分別為7 492、7 598、6 183 Da,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖組成,物質的量比為44.5∶21.7∶5.9∶8.8∶5∶4.1,存在→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→、Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→、→3)-Arap-(1→、→4)-Xylp-(1→、Manp-(1→等12種單糖連接方式,根據多糖的連接類型和占比,推測其主鏈主要由→4)-Galp-(1→和→4)-Xylp-(1→組成,其支鏈中可能含有Araf-(1→、Galp-(1→、Arap-(1→、Manp-(1→、→3)-Arap-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→等殘基。與之前報道的樹莓多糖組分的結構相比,RPP-5在單糖組成、物質的量比、分子質量和連接方式上均有不同。例如,通過水提取并使用DEAE-A52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱從樹莓根中分離出分子質量為7 900 Da的酸性雜多糖RAPS-1,由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸組成,相對物質的量比為6.2∶1.0∶1.2,骨架由→4)-Glcp-(1→殘基構成,分支主要包括Galp-(1→和GlcAp-(1→殘基[25]。YU等[17]采用復合酶法從樹莓果實中提取粗多糖,利用大孔樹脂D4020和Sephadex G-100進行連續純化,得到一種水溶性樹莓多糖組分RCP-II。RCP-II由物質的量比為1∶0.55∶1.19∶0.52∶0.44∶1.90的半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成,平均分子質量約為4 013 Da。還有研究人員從樹莓中提取獲得多糖組分RP,其分子質量為837 820 Da,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖組成,其中半乳糖醛酸和阿拉伯糖含量最高,其主鏈上有大量的1→2糖苷鍵[26]。此外,WU等[27]采用酶提取的果膠多糖RPE50%3主要含有50%的→4)-GalpA-(1→,16%的→5)-Araf-(1和→3)-Araf-(1→,18%的→4)-Galp-(1→和→6)-GalpA-(1→;而酸提取的樹莓果膠多糖RPE50%-3比RPA50%-3含有更多的阿拉伯聚糖側鏈,表現出更好的免疫增強作用。造成RPP-5與其他樹莓多糖結構不同的原因可能有樹莓的品種差別、樹莓生長環境差異、提取部位以及提取方法的不同、分離方法差異等。

巨噬細胞是機體主要的免疫效應細胞,能夠維持機體的免疫、監視和炎癥反應[28]。巨噬細胞的活力是評估其免疫調節能力的重要參數之一。愈來愈多的科學研究表明,各種天然多糖能夠刺激巨噬細胞中NO、TNF-α和IL-6和IL-1β的產生,從而刺激免疫反應[29]。NO是參與巨噬細胞免疫刺激的重要物質之一,有著增強巨噬細胞細胞的免疫調節活性的作用[30]。IL-6是促進免疫細胞的分化來誘導適應性免疫反應的關鍵細胞因子。IL-1β也被認為是關鍵的炎癥介質之一,多糖能夠通過調節IL-1β的分泌來增強免疫活性[31]。TNF-α是一種由巨噬細胞產生的促炎細胞因子,能夠進一步促進該細胞的活性[32]。本研究中,RPP-5能夠增強RAW264.7細胞的活力,升高細胞中NO的含量,促進細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌及其mRNA的表達。以上結果表明,RPP-5具有顯著的免疫增強活性,可用作天然免疫增強劑用于功能性食品、保健品及藥品等的開發中。

多糖的分子質量、單糖組成以及糖苷鍵的類型與其生物活性密切相關。低分子質量多糖具有較為簡單的結構,在通過細胞屏障時因其阻礙較小,進而在發揮免疫調節活性時具備一定的優勢[33]。分子質量較高的多糖盡管結構較為復雜,但其與受體和蛋白的連接位點較多,也具有較強的免疫活性[34]。RPP-5的重均分子質量為7 598 Da,有利于其免疫增強活性的發揮。除分子質量外,單糖組成也是影響多糖免疫活性的重要因素之一。研究表明,半乳糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖的含量與巨噬細胞免疫活性的增強呈正相關[35]。金櫻子果實多糖,因其半乳糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖占單糖總量的86.7%,能夠激活巨噬細胞RAW264.7細胞分泌免疫細胞因子進而表現出極強的免疫增強活性[36]。龍葵多糖經水提取和堿提取分別獲得SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1和SNLAP-2四種多糖亞組分,SNLWP-1中半乳糖和阿拉伯糖作為主要糖成分;SNLAP-1和SNLAP-2均富含木糖、半乳糖和阿拉伯糖;SNLWP-2富含葡萄糖。研究發現,富含半乳糖、阿拉伯糖和木糖的多糖亞組分能夠升高H22型小鼠血清中IL-2和IFN-γ的水平,通過增加免疫反應來實現抗腫瘤作用[37]。此外,多糖的免疫活性還與其連接方式對關。例如,羅望子多糖TKP-2-1中1,4,6-Glcp的含量為37%、1,4-Galp的含量為10.9%,具有較強的免疫刺激活性[33]。黃芪總多糖中存在APS-I和APS-Ⅱ兩種分子質量不同的多糖組分,APS-Ⅱ中單糖的主要連接方式為1→2,4-Glcp和1→4,6-Glcp,與黃芪多糖APS-I相比具有更強的免疫增強活性[38]?？梢?1,4,6-Glcp、1,4-Galp、1→2,4-Glcp這些單糖連接方式的含量可能與免疫增強作用呈正相關。本研究中,RPP-5由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖組成,其中阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和木糖占總糖含量的82.15%,存在12種單糖連接方式,其中→4)-Galp-(1→的含量最高,為26.27%,→4,6)-Glcp-(1→的含量為10.41%。由此可見RPP-5具有較強的免疫增強活性,這也與免疫調節活性結果相互印證。

綜上,RPP-5分子質量為7 598 Da,由物質的量比為44.5∶21.7∶5.9∶8.8∶5∶4.1的阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和甘露糖6種單糖組成,存在→4)-Glcp-(1→、→4,6)-Glcp-(1→、→3,4,6)-Glcp-(1→、Galp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、Arap-(1→、→3)-Arap-(1→、→4)-Xylp-(1→、Manp-(1→等12種單糖連接方式。RPP-5能增強RAW264.7細胞的存活率,升高RAW264.7細胞中的NO含量,促進細胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌及其mRNA的表達,顯示出較強的免疫增強活性,具有進一步開發為免疫調節劑的潛力。但RPP-5調節免疫的作用機制還有待進行進一步地深入研究。