枳椇子多糖的酸提取工藝優化及其理化性質與抗氧化活性研究

劉春陽,白金波,楊尚青,史進陽,秦亞敏,吳德玲,2,3,解松子,2,3*

1(安徽中醫藥大學 藥學院,安徽 合肥,230012)2(中藥研究與開發安徽省重點實驗室,安徽 合肥,230012)3(中藥飲片制造新技術安徽重點實驗室,安徽 合肥,230012)

枳椇子首載于唐代《新修本草》《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥材》和《香港中藥材標準》要求枳椇子的功能性部位為種子[1]。作為一種藥食兩用中藥,枳椇子含有三萜皂苷、黃酮、苯丙素類、多糖等多種化學成分[2],具有保肝、降血糖、抗氧化、降尿酸、調節免疫等藥理作用[3]。

植物多糖作為一種生物大分子具有多種生物活性。目前對于枳椇子多糖的研究主要集中在肉質果梗上,而對于種子的研究較為缺乏[4-5]。由于多糖在植物細胞中存在的部位不同,使植物多糖結構復雜,組成多樣,多糖的高效提取一直受到廣大研究學者的關注,提取方式是影響多糖提取率的重要因素之一。已有研究學者利用響應面法優化枳椇子多糖的水提工藝,使多糖的提取率達到1.84%[6];采用微波輔助技術提取桑葉多糖得到多糖的提取率達到9.41%[7];采用酶輔助法提取黃芪多糖,使多糖得率達到29.96%,高于水提取法[8]。酸提取法是利用稀酸溶液提取多糖的一種方法。已有研究證明,酸提取法能夠將含有酸性基團的多糖提取出來,并且能夠提高植物多糖的提取率和溶解性;此外,酸提取多糖也具有良好的生物活性,例如,以鹽酸為提取溶劑提取玉米須多糖,其得率達到33.36%[9];采用稀鹽酸溶液提取得到的羊棲菜多糖具有良好的抗氧化活性;通過比較由不同提取方式得到的海藻多糖的生物活性,發現酸提取多糖能顯著性提高與膽汁酸的結合能力[10]。

因此,本文采用酸溶劑提取法提取枳椇子種子部位的粗多糖,經單因素考察和正交試驗優化提取工藝參數,通過Sevag法除蛋白、DEAE-52陰離子交換柱對多糖進行分離純化,并對其進行理化性質分析和體外抗氧化活性評價,以期為枳椇子多糖的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇子,安徽亳州,烘干粉碎后備用;葡聚糖分子質量標準品,上海源葉生物科技有限公司;DEAE纖維素DE-52,北京索萊寶科技有限公司;DPPH、ABTS試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50冷凍干燥機,博醫康(北京)儀器有限公司;HC-3018高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;SPECORD S600紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;RID-10A凝膠色譜儀,島津;DHL-A電腦數顯恒流泵,上海滬西分析儀器廠有限公司;SpectraMax i3X酶標儀,賽默飛世爾科技公司;尼力高6700傅立葉交換顯微紅外成像光譜儀,美國尼高力儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗樣品預處理

枳椇子原藥材洗凈、烘干、打粉,稱取適量藥材粉末以石油醚為溶劑脫脂,脫脂后的濾渣晾干備用。取80%(體積分數)的乙醇與該濾渣混勻,80 ℃回流脫單糖,濾渣烘干備用。

1.3.2 枳椇子多糖提取

稱取適量的枳椇子粉末,加入適量的HCl溶液進行提取,提取液過濾,濾液立即用0.5 mol/L NaOH溶液中和,5 000 r/min離心10 min后去除沉淀,濃縮至一定體積,加入無水乙醇使提取液中乙醇體積分數為80%,靜置24 h,所得醇沉物復溶后加Sevag試劑攪拌離心,直至無蛋白沉淀產生。糖液除去殘留的有機試劑后,蒸餾水透析,冷凍干燥。

1.3.3 枳椇子多糖提取率和含量測定

標準曲線的繪制:稱取適量的無水葡萄糖,配成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液,分別取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL標準溶液于試管中,蒸餾水補足至1 mL。加入2.5 μL 80%苯酚溶液(體積分數,下同),再加入2.5 mL濃硫酸,混勻后室溫反應20 min,用紫外可見分光光度計在490 nm處檢測吸光度值。以無水葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線:y=21.45x-0.008 1,R2=0.990 2。

取0.1 mg/mL的多糖樣品溶液1 mL,加入25 μL 80%苯酚溶液,再加入2.5 mL濃硫酸,渦旋混勻后室溫反應20 min后,用紫外分光光度計在490 nm處檢測吸光度值,枳椇子粗多糖得率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:m1,枳椇子多糖的質量,mg;m2,樣品質量,mg。

1.3.4 單因素試驗

以枳椇子原藥材粉末為原料,固定提取溫度(A)80 ℃、料液(B)為1∶60(g∶mL)、提取時間(C)2 h、鹽酸濃度(D)0.2 mol/L,改變某一因素探討對枳椇子多糖得率的影響,單因素設計如表1所示。

表1 單因素試驗設計Table 1 Single factor experiment design

1.3.5 正交試驗

根據單因素試驗結果,采用四因素三水平正交試驗進行提取工藝優化。正交試驗設計見表2,每組平行做3次,多糖得率結果取均值并驗證其合理性及穩定性。

表2 酸提取法正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of acid extraction method

表3 酸提取法正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results of acid extraction method

1.3.6 分離純化

將凍干的HDP用超純水配制為10 mg/mL的溶液,過濾,加入預先用Tris-HCl平衡的DEAE-52纖維素陰離子交換柱(1.6 cm×60 cm)中,以5.0 mL/min的流速分別用超純水和不同梯度濃度的NaCl溶液(0.1、0.2、0.3 mol/L)洗脫。收集同一洗脫液的糖溶液透析、濃縮、冷凍干燥后備用。

1.3.7 化學成分測定

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法[11],根據回歸方程y=7.735 7x-0.002 6(R2=0.994 8)計算;糖醛酸含量測定采用間羥基聯苯法[12],根據回歸方程y=4.672 6x-0.028 9(R2=0.997 5)計算。

1.3.8 結構鑒定

1.3.8.1 分子質量測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定枳椇子多糖的分子質量,以不同分子質量的葡聚糖標準品保留時間繪制標準曲線,色譜條件:凝膠柱為TSK G4000PWxl色譜柱,流動相為過膜雙蒸水,流速0.6 mL/min,進樣量20 μL,柱溫30 ℃,示差折光檢測器[13]。

1.3.8.2 單糖組成

參考張璐等[14]的方法采用高效液相色譜法測定HDP中的單糖組成。

1.3.8.3 紫外全波長掃描

取適量枳椇子多糖溶于雙蒸水中,紫外分光光度計在190～800 nm范圍內進行掃描。

1.3.8.4 紅外光譜

稱取2 mg充分干燥后的枳椇子多糖,與200 mg充分干燥的KBr壓片,紅外光譜掃描儀上4 000～400 cm-1范圍內對壓片進行掃描分析。

1.3.8.5 剛果紅實驗

取2 mL 2.5 mg/mL多糖溶液與2 mL剛果紅溶液置于試管中混勻,再向混合溶液中依次添加不同體積的NaOH溶液使混合溶液中NaOH濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L。并以不含枳椇子多糖溶液的混合溶液(蒸餾水與剛果紅混合溶液)作為對照。在室溫下靜置10 min后,測定不同濃度NaOH混合溶液的最大吸收值。

1.3.8.6 碘-碘化鉀實驗

配制1 mg/mL的枳椇子多糖溶液,加入1.2 mL碘試劑,混勻后用紫外分光光度計對在300～700 nm范圍內進行掃描。

1.3.8.7 掃描電鏡分析

稱取少量枳椇子多糖,均勻涂置于帶有導電膠的樣品臺,使用掃描電鏡高真空觀察枳椇子多糖表觀特征。

1.3.9 體外抗氧化活性

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力測定

參考滕歡歡等[15]的方法并稍作調整,配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液和不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mg/mL)枳椇子多糖溶液。取試管依次加入2 mL DPPH溶液后再加入2 mL不同濃度的枳椇子多糖溶液搖勻,避光反應30 min,測定其在517 nm處的吸光度值?？箟难?維生素C)為陽性對照,蒸餾水為空白對照,計算清除率。平行測定3次,取平均值,其計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A樣品,樣品與DPPH混合溶液OD值;A0,去離子水同DPPH混合溶液OD值;A對照,樣品同去離子水混合溶液OD值。

1.3.9.2 羥自由基(·OH)清除能力測定

參考LI等[16]的方法并稍作調整,配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mol/L的枳椇子多糖溶液。取7只試管,分別加入上述不同的枳椇子多糖溶液1 mL,隨后向試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL,再分別加入6 mmol/L的H2O2溶液1 mL,搖勻,靜置10 min,再加入6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL,搖勻,靜置30 min后,于510 nm處測其吸光值。以抗壞血酸(維生素C)作為陽性對照。其計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A樣品,樣品與反應溶液OD值;A對照,樣品與蒸餾水混合OD值;A0,蒸餾水與反應溶液OD值。

1.3.9.3 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考XIE等[17]的方法并稍作調整,配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mol/L枳椇子多糖溶液,分別取1 mL不同濃度多糖溶液與預先配制好的ABTS工作液2 mL混勻,避光1 h后在734 nm處測定吸光度值。以抗壞血酸(維生素C)作為陽性對照。其計算如公式(4)所示:

(4)

式中:A樣品,樣品與ABTS反應溶液OD值;A對照,樣品與PBS混合OD值;A0,蒸餾水與ABTS反應溶液混合OD值。

1.4 數據處理

采用SPSS 23.0進行正交試驗設計和單因素方差分析,圖采用Origin 2021和GraphPad Prism 8.2.1繪制。上述實驗均重復3次,實驗結果采用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對提取率的影響

料液比是影響多糖提取率的重要因素之一,合適的料液比能通過改變細胞內外滲透壓而使多糖充分溶出[18]。如圖1所示,枳椇子多糖得率隨著料液比的增大而出現先上升后下降的趨勢,隨著料液比的等比提高,溶液黏度降低,分子擴散速度加快,多糖溶出率提高,拐點出現在1∶100,此時提取率為(3.7±0.07)%。在1∶100之后多糖得率有所下降,當料液比為1∶140時,多糖提取率為(2.2±0.14)%。這可能是由于此時組織內外濃度差消失,多糖溶出率不再變化,酸溶液使多糖發生部分降解,造成提取率下降。故確定料液比(g∶mL)在正交優化中的因素水平為1∶80、1∶100、1∶120。

圖1 不同料液比對枳椇子多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid on polysaccharide yield of H. dulcis

2.1.2 鹽酸濃度對提取率的影響

如圖2所示,多糖得率隨著鹽酸濃度提高而先增后減,在0.2～0.4 mol/L這一區間多糖得率增加不明顯,0.1～0.2 mol/L和0.4～0.5 mol/L出現急劇的上升和下降趨勢,前者可能是由于酸溶液對藥材細胞壁的破壞使得多糖大量溶出,后者可能是由于高濃度的酸造成多糖降解,造成多糖損失[9]。故確定鹽酸濃度在正交優化中的因素水平為0.2、0.3、0.4 mol/L。

圖2 不同提取濃度對枳椇子多糖得率的影響Fig.2 Effect of extract concentration on polysaccharide yield of H. dulcis

2.1.3 時間對提取率的影響

提取時間是影響多糖得率的又一重要因素。如圖3所示,多糖得率隨著提取時間的等時延長而出現先升高后下降的趨勢。其拐點是2.5 h,提取率為(4.1±0.09)%。1 h和1.5 h的多糖得率分別是(3.0±0.06)%和(3.6±0.15)%,這可能是因為提取時間較短,使得多糖不能充分溶出;在提取時間為3 h時多糖得率為(3.9±0.03)%,呈現緩慢下降的趨勢,這可能是因為長時間浸提導致多糖發生降解,從而影響多糖的提取率[19]。故確定提取時間在正交優化中的因素水平為2、2.5、3 h。

圖3 不同提取時間對枳椇子多糖得率的影響Fig.3 Effect of extract time on polysaccharide yield of H. dulcis

2.1.4 溫度對提取率的影響

如圖4所示,多糖得率隨著溫度升高出現先上升后下降的趨勢。這與分子間的運動有關,隨著溫度的升高分子間運動速度加快,多糖溶出率增加,拐點出現在80 ℃,此時得率達到(3.9±0.19)%,但這種溶出是有限度的,當溫度達到100 ℃時,多糖得率下降到(3.4±0.21)%,這可能因為在溫度過高的情況下多糖結構會受到破壞,影響多糖得率[20]。故確定溫度在正交優化中的因素水平為70、80、90 ℃。

圖4 不同提取溫度對枳椇子多糖得率的影響Fig.4 Effect of extract temperature on polysaccharide yield of H. dulcis

圖5 枳椇子多糖DEAE洗脫曲線Fig.5 Elution curve of polysaccharide of H. dulcis

圖6 分子質量分布Fig.6 HPGPC profile of molecular weight distribution

2.2 正交試驗結果

通過直觀分析R值得出4個因素對枳椇子多糖提取的影響大小次序為料液比>溫度>濃度>時間。因C組極值很小,所以將此列作為方差分析的誤差列,結果見表4,根據方差分析結果可知,因素A、因素B,均具有顯著性差異,P<0.05;而因素C及因素D均沒有顯著性。

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

由正交結果分析得出酸提枳椇子多糖的最佳工藝組合為A3B2C3D1,提取條件為溫度90 ℃,料液比為1∶100(g∶mL),時間為3 h,濃度為0.2 mol/L。

按照最優工藝組合A3B2C3D1提取,并計算多糖得率。結果如表5所示,在最佳工藝條件下,枳椇子多糖得率均值為(4.07±0.07)%,相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為1.69%,說明優選出的最佳提取工藝合理且穩定,并且高于于剛等[21]水提枳椇子多糖的提取率。由表3可知,因素C的R值為0.33,極差較小,說明提取時間對該提取工藝的影響不大,考慮到節約能耗,故將正交最佳工藝調整為A3B2C2D1,即溫度90 ℃,料液比為1∶100(g∶mL),時間為2.5 h,鹽酸濃度為0.2 mol/L。

表5 正交試驗驗證結果Table 5 Orthogonal experiment verification results

2.3 枳椇子多糖分離純化

枳椇子粗多糖溶液經DEAE-52纖維素離子交換色譜柱分離,依次用超純水和0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫,依次得到4個組分,其得率分別是6.7%、7.0%、8.5%、26.7%。其中0.3 mol/L鹽洗組分得率最高,因此對該組分進行后續理化性質和生物活性研究,命名為HDP。

2.4 HDP的化學成分分析

HDP的碳水化合物含量占(67.86±0.19)%,蛋白質含量占(4.07±0.03)%,糖醛酸含量占(41.57±0.36)%,經該方法提取純化得到的枳椇子種子部位的多糖含量低于蔡冰潔等[22]提取純化的果梗部位的多糖含量,但種子部位多糖的糖醛酸含量高于果梗部位,推斷HDP為酸性多糖。

2.5 HDP分子質量

如圖2所示,HPD的出峰時間為10.24 min,為單一對稱峰,說明HDP經分離純化后為均一性多糖。根據多糖分子質量標準曲線Y=-2.052 2x+24.945計算,計算得出HDP的分子質量為3.03×105Da。強明亮[23]分離純化得到枳椇果梗部位的多糖,分子質量為3.65×105Da,楊兵[24]從果梗部位得到一個均一性多糖,分子質量為3.73×105Da,而對于同為鼠李科的駿棗多糖,其分子質量為3.24×104Da[25]。這說明處于同一科的植物多糖其分子質量可能存在較大差異,而對于同一屬的植物中多糖的分子質量差異相對較小。

2.6 HDP單糖組成分析

如圖7所示,HDP由甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖組成,摩爾百分比分別是10.46%、1.44%、8.19%、9.79%、4.54%、4.61%、38.02%、9.95%、13.01%。主要單糖組成包括半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。有研究報道,枳椇果梗多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成,各單糖的摩爾百分比分別是3.64%、1.41%、4.67%、5.16%、3.01%、60.02%、22.09%,半乳糖和阿拉伯糖是果梗多糖的主要單糖組分[24]。單糖組成結果證實HDP為酸性多糖,HDP的單糖組成與已發表文獻所報道的枳椇果梗多糖的單糖組成存在類似性,但單糖的組成比例有顯著差異,這可能與提取的部位和提取方法有關[22]。

圖7 單糖組成Fig.7 Monosaccharide composition of HDP

2.7 HDP的紫外光譜和紅外光譜分析

核酸和蛋白質在260 nm和280 nm附近有吸收峰,可以利用紫外全波長掃描來檢測多糖中是否含有游離的蛋白質和核酸。由圖8-a可知,HDP在260 nm處無吸收峰,在280 nm處有微弱吸收峰,說明HDP不含核酸,有少量蛋白存在。

a-紫外光譜;b-紅外光譜

2.8 HDP構象分析

剛果紅試劑可與三股螺旋結構的多糖形成復合物,復合物未接觸堿液時紫外掃描會出現紅移,接觸堿液后隨著堿液濃度增加而逐漸藍移至穩定[29]。由圖9-a可知,與對照組不同,HDP與剛果紅混合溶液未出現先紅移后藍移最后趨于穩定的現象,因此HDP沒有規則螺旋構象,這可能與HDP較復雜的單糖組成有關[30];由圖9-b可知,HDP在350 nm處有強吸收峰,而在565 nm左右沒有吸收峰。說明HDP主干上具有復雜的鏈狀結構,側鏈較長,支鏈較多。

a-三股螺旋結構;b-碘-碘化鉀紫外掃描圖

a-550×;b-2 000×;c-3 000×

2.9 HDP微觀表面形態分析

為了進一步研究枳椇子多糖的微觀結構,采用掃描電鏡觀察HDP表面微觀形態,HDP呈不規則層片狀分布,表面光滑致密,這可能與HDP中的阿拉伯糖與帶電基團形成氫鍵有關[31];在高倍鏡下,HDP表面出現空洞,并伴有少量裂痕,邊緣有不規則層片狀堆疊,這可能是由于酸提取溶劑在一定程度上影響HDP的表面微觀結構。

2.10 HDP抗氧化活性評價

過量活性氧誘導的氧化應激反應會對細胞結構和生物分子的功能造成嚴重損傷,從而直接或間接地引發衰老、炎癥和心血管疾病[32]。DPPH自由基較為穩定,抗氧化劑能夠將穩定的DPPH還原成非自由基形式的DPPH-H,從而使紫紅色的溶液迅速褪色。ABTS陽離子自由基是一種呈藍綠色的自由基,當與抗氧化劑結合后能使溶液褪色以此評價多糖的自由基清除能力?！H是活性氧中最強的一種,能快速穿透細胞膜與蛋白質、核酸等重要的生物大分子發生反應導致組織損傷和細胞死亡,因此·OH的清除對機體保護十分重要[33]。

HDP的自由基清除能力測定結果如圖11所示,DPPH自由基、ABTS陽離子和·OH清除率隨著多糖濃度的升高而增強,在多糖質量濃度為3.0 mg/mL時,DPPH自由基、ABTS陽離子和·OH清除率分別達到(61.67±0.15)%、(83.88±0.14)%、(58.89±0.91)%。經計算,HDP的IC50分別是1.178、0.867、2.112 mg/mL,表現出良好的體外抗氧化能力,但枳椇子多糖的抗氧化能力劣于拐棗多糖[34](在0.1 mg/mL時,對DPPH的清除率為86.73%;在2 mg/mL時,對ABTS的清除率為91.33%)。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-·OH清除率

理化性質是影響植物多糖抗氧化能力的關鍵因素。有研究報道,多糖清除自由基的能力通常取決于其供電子或供氫的能力,多糖的羧基可以與異碳的氫原子發生反應[35],因此較高的糖醛酸含量有利于提高多糖的自由基清除能力,本實驗得到HDP含有41.57%的糖醛酸,紅外光譜和單糖組成的結果也證實糖醛酸的存在,HDP表現較好的清除自由基能力可能與糖醛酸的含量有很大關系。HDP的分子質量為3.03×105Da,主要由半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖組成。多糖的分子質量也是影響多糖抗氧化能力的關鍵因素,分子質量過大不能透過細胞膜,分子質量過小則不能形成“活性中心”[24],有學者通過降解得到分子質量在6.60×105～8.80×105Da范圍的多糖,發現它們具有良好的抗氧化能力,這可能與較低分子質量的多糖具有更多的還原羥基,從而能與更多的自由基結合有關[36]。也有報道稱,葡萄糖占比少的多糖具有更好的抗氧化能力[37];此外,有研究證實以半乳糖為主鏈,阿拉伯糖為側鏈的阿拉伯半乳聚糖能表現出良好的抗氧化和抗衰老能力[38]。因此,HDP良好的抗氧化能力可能是糖醛酸含量、分子質量大小、單糖組成等多個理化性質共同作用的結果。

3 結論

本文利用單因素考察和正交試驗探究酸提枳椇子多糖的提取工藝,得到最優提取條件為溫度90 ℃,液料比1∶100(g∶mL),提取時間為2.5 h,鹽酸濃度為0.2 mol/L。在此工藝下多糖得率達到4.07%。通過對枳椇子粗多糖進行純化,以得率最高的HDP為對象進行理化性質分析和抗氧化活性評價。經測定HDP分子質量為3.03×105Da,含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖,是一種吡喃環型酸性多糖,具有無規則螺旋結構并含有較多分支,并表現出層片狀的微觀形態。HDP能夠有效清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基,表現出良好的體外抗氧化活力。本文主要研究了酸提枳椇子多糖的提取工藝、理化性質以及體外抗氧化活性。此后還需要進一步對枳椇子多糖進行深入的結構表征和體內生物活性研究,該研究將為枳椇子功能性食品的開發提供理論基礎。